HPLC 1

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Cromatografía Líquida de Alta 
Precisión
HPLC
Ventajas de HPLC frente a otras cromatografías
 Alta sensibilidad
Fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas
Idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles
Gran aplicabilidad en distintos campos: industria, ciencia, sociedad.
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Insecticidas: carbamatos, organofosforados
Fungicidas: benzimidazoles, carbamatos
Herbicidas y reguladores del crecimiento: ureas, 
fenilureas, triazinas, glifosatos( diquat/paraquat)
Aflatoxinas: B1, B2, G1, G2
Micotoxinas: deoxinivalenol (DNO)
Acidos Fenólicos, Carbohidratos
Proteínas, Aminoácidos
Antocianinas
Vitaminas Liposolubles e Hidrosolubles
Drogas de Abuso
Antibióticos,Esteroides,Analgésicos
Aplicaciones generales
Tipos de Cromatografía Líquida (FM líquida)
Cromatografía de adsorción o líquido – sólido
Cromatografía iónica
Cromatografía de exclusión por tamaño o en geles
Cromatografía de reparto
• líquido – líquido (requiere un soporte sólido)
• líquido – fase unida químicamente
En cromatografía de reparto, según la polaridad de la fase estacionaria:
 Cromatografía en fase normal: fase estacionaria de elevada polaridad 
(agua, trietilenglicol) y fase móvil apolar (hexano, isopropileter)
Cromatografía en fase reversa: 
•fase estacionaria no polar (hidrocarburos) y 
•fase móvil relativamente polar (agua, metanol, acetonitrilo)
Los solutos más polares eluyen primero 
Un aumento de la polaridad de la FM incrementa el tiempo de elución
El 75% de los análisis por HPLC se efectúa en fase reversa
La fase estacionaria consiste en cadenas C8 (n- octilo) o C18 (octadecilo)
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Optimización de una Separación
– Eficiencia
Para optimizar la eficiencia de la columna :
 Disminuir el tamaño de partícula
 Emplear el flujo acorde al mínimo de la gráfica HETP
 Emplear un solvente menos viscoso
 Incrementar la temperatura de la columna
 Incrementar la uniformidad de la partícula
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II. Instrumentación
Reservorios de Fase móvil
Sistema de bombeo
Inyectores
Columnas
Detectores
Fase Móvil – Características
Además de la calidad en la separación, la fase móvil debe: 
No alterar la columna ni sus características
Ser compatible con el detector
Disolver la muestra
Tener una viscosidad baja
Permitir la recuperación fácil de la muestra, si es necesario.
Ser de pureza elevada y no tóxico
Ser comercialmente disponible a un precio razonable
Fase Móvil – Preparación
1. Filtración: para eliminar el polvo y partículas sólidas en suspensión que pueden dañar la 
bomba, los sistemas de inyección u obturar la columna. Se efectúa filtración al vacío a 
través de un filtro millipore de tamaño de poro muy pequeño
2. Desgasificación: se deben eliminar los gases disueltos, en general 
oxígeno y nitrógeno, que forman burbujas en la columna y sistemas 
de detección provocando ensanchamiento de bandas y problemas 
de funcionamiento del detector. Se lo efectúa mediante bombeo 
por vacío, dispositivo para calentar y agitar los disolventes, o por 
arrastre mediantes finas burbujas de un gas inerte de baja 
solubilidad. 
3. Mantener los reservorios tapados
Fase Móvil – Preparación
Buffers
Los buffers serán necesarios cuando se analicen muestras 
que contengan analitos ácidos o básicos.
 Las concentraciones recomendadas son del orden de 10 a 
20 mM; de ser necesaria una mayor concentración asegurarse 
que no ocurra precipitación. 
 Recordar que el intervalo de amortiguamiento es de 
máximo ±1,5 unidades en torno al valor de pKa (ver tabla).
 El pH deberá ajustarse en el buffer acuoso (teniendo en 
consideración la modificación del pH por el solvente 
orgánico). 
Preparación de la Fase Móvil
Solventes para fase reversa
- La mayoría de la LC por fase reversa utiliza agua 
como el componente principal de la fase móvil
- El agua es el líquido polar más común
- Casi todos los compuestos, excepto los más 
polares o más iónicos, experimentan una 
fuerza hidrofóbica fuerte que los conducen a la 
fase estacionaria y causan su retención
- Se debe utilizar siempre agua grado HPLC
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Bombas
- Características
 Operar a presiones elevadas, mayores de 6000 psi 
 Libre de pulsaciones
 Inerte. Materiales resistentes a la corrosión
 Operar con gradiente de solventes
Sistemas de bombeo: bombas recíprocas
El disolvente es entregado por la bomba con el pistón reciprocante.(10
μL/min -10 mL/min)
El diseño del pistón con un control electrónico de su movimiento
proporciona un flujo ligeramente pulsante.
Una cámara de mezclado proporciona una homogenización de los
disolventes antes del punto de inyección de la muestra.
Un transductor de presión convierte la presión del sistema en una
salida eléctrica que se despliega en la pantalla
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Bombas
– Tipos de Bombas
C
o
m
p
o
si
ci
ó
n
Tiempo
% B
 Isocrática
 Gradiente
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Bombas
– Análisis Isocratico
 Estabilidad en la línea base
 Tiempo de análisis largo
 Presión Constante
 Resolución limitada
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Bombas 
– Análisis con Gradiente
 Resolución de Mezclas Complejas
 Tiempo de Análisis Corto
 Variación de la Presión
 Inestabilidad de Línea Base
 Vida útil de la Columna Limitada
C
o
m
p
o
si
ci
ó
n
%B
Tiempo
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Inyector Manual 
- Caracteristicas
 Válvula de 6 puertos
 2 posiciones: carga e inyección
 Utiliza un loop; requiere cambio de loop para inyectar 
diferentes volumenes
 Jeringa para introducir la muestra
 Limpieza manual de línea de inyección
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Inyector Manual
- Funcionamiento
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Inyector Automático 
– Características
Válvula de 6 puertos / 2 posiciones
 Utiliza un solo loop. No requiere de cambio de 
loop para volumenes menores
 2 posiciones: carga e inyección
 Aguja / Jeringa para introducir muestra en forma 
programada
 Limpieza automática de la línea de inyección.