27 Conf 27 Análisis Químico Electroforesis convencional

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Conceptos básicos. 
Instrumentación. Soportes. 
El proceso electroforético clásico.
Análisis Químico
Electroforesis convencional
1
INTRODUCCIÓN
Separar y analizar moléculas:	proteínas 
				ADN/ARN
ELECTROFORESIS
... en función de su diferente movilidad al aplicar un campo eléctrico
(dependerá de su carga eléctrica y radio hidrodinámico) 
cátodo
ánodo
* Moléc. (+)  polo (-) o cátodo
* Moléc. (-)  polo (+) o ánodo
ELECTROFORESIS LIBRE 
 moléculas en disolución o suspensión: 
poco resolutiva 
Arne Tiselius
1937
(Nobel 1948)
ELECTROFORESIS DE ZONA 
 SOPORTE que retiene las moléculas:
elevado poder de resolución	
ánodo
cátodo
SOPORTE
2
INSTRUMENTO ELECTROFORÉTICO
-
+
muestra
muestra
fuente de 
alimentación
cable
cubeta
tampón
gel
electrodo
electrodo
cátodo
ánodo
cátodo
* Fuente de alimentación
* Cubeta
* Tampón de electroforesis
* Soporte electroforético
 (gel)
* Dos electrodos
	ánodo (+)
	cátodo (-)
Componentes:
(E. horizontal)
3
SOPORTE ELECTROFORÉTICO
 No restrictivo (Tipo I): Tamaño poro >>> moléculas, no opone impedimento
 a su paso  separación sólo por CARGA
 * Electroforesis de proteínas: • Papel, almidón, agar, acetato de 
 celulosa
Gel poroso
Características
 Gel poroso (entramado tridimensional interno)
 Tiene que permitir el paso de moléculas
 Material inerte: NO puede estar cargado y no 
 debe adsorber las moléculas de la muestra
Tipos de Soporte
 Restrictivo (Tipo II): Tamaño poro ≈ moléculas, opone resistencia a su
 paso  separación por tamaño (tamizado molecular)
 * Electroforesis de proteínas: • Separación por CARGA y TAMAÑO
 • Acrilamida
 * Electroforesis de DNA/RNA: • Separación sólo por TAMAÑO
 • Agarosa, acrilamida
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EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA 
+
-
Campo eléctrico (DV)
Soporte: (no restrictivo) Tiras de acetato de celulosa
Electroforesis horizontal
1. Aplicación de la muestra
2. Electroforesis
3. Detección por tinción:
 Azul de Coomassie
 Negro amido
4. Densitometría
Aplicaciones diagnósticas en serología
(separación proteínas séricas)
muestra
Avance de las proteínas
EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
Electroforesis vertical 
Soporte: (restrictivo) Gel de Poliacrilamida
	* Copolimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida
			
	* Variación de la concentración  variación del tamaño de poro
 [poliacrilamida] tamaño poro 
1. Preparación del gel
2. Montaje de la cubeta
3. Aplicación de la muestra
4. Electroforesis
5. Detección por tinción:
 Azul de Coomassie
 Sales de plata
PAGE: polyacrylamide gel electrophoresis.
SDS-PAGE: determinación de la masa molar
Marcadores de masa molar: 
* Mezcla de diferentes proteínas pre-teñidas de las que se conoce la masa molar.
* Por comparación se puede determinar la MM de a proteína desconocida.
Conclusiones