PRACTICA N 04 - PROTEINAS III

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PRÁCTICA N° 04: PROTEÍNAS III
INTRODUCCIÓN
En el laboratorio a menudo queremos medir si una proteína específica se expresa en una
muestra. O determinar si distintas proteínas sufren variaciones frente a la presencia de un
determinado agente y relacionarlo con el diagnóstico y evolución de una patología.
Para ello se cuenta con diferentes técnicas analíticas que desde hace unos años atrás ganaron
su espacio en la biología molecular y se han ido perfeccionando, entre ellas RIA, ELISA,
Western blot, Inmunofluorescencia, Inmunoprecipitación, etc.
❖ El western blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de
proteínas. Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permite la
detección de una sola proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de
Western Blot se logra mediante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une
a un epítopo único de la proteína de interés.
❖ La Inmunofluorescencia (IF) o Técnica de Anticuerpos Fluorescentes se basa en la
unión inmunológica de un anticuerpo marcado con un fluorocromo a su antígeno
homólogo. Se considera un fluorocromo a una sustancia que al ser excitada por una
onda luminosa, es capaz de emitir luz de menor energía (mayor longitud de onda) que
la de la onda que provoca la excitación. El fluorocromo de más amplia aplicación en
esta técnica es el isotiocianato de fluoresceína. En 1941, la IF fue introducida por
Coons y colaboradores, quienes emplearon el isocianato de fluoresceína para marcar
tanto antígenos como anticuerpos. Posteriormente, las técnicas de conjugación fueron
modificadas por Riggs y colaboradores. Estos investigadores reemplazaron el radical
isocianato por el isotiocianato, este último más estable, más fácil de conjugar y de
obtener comercialmente.
A partir de los años 50, la IF ha sido ampliamente utilizada para la identificación de parásitos,
bacterias y numerosos virus, así como para la detección de anticuerpos contra estos agentes.
Principio de la técnica
Las moléculas proteicas de los anticuerpos se unen al marcador fluorescente (fluorocromo)
por medio de firmes enlaces químicos. Como la actividad inmunológica de estos anticuerpos
no se altera, la capacidad de los mismos de unirse a los antígenos homólogos permanece
íntegra.
Debido a la alta especificidad de la reacción Ag-Ac, la IF se ha convertido en un método muy
útil para el diagnóstico. Otra de sus ventajas, es el tiempo relativamente corto que se requiere
para el procesamiento de la muestra hasta llegar al resultado final. La IF es aplicable a
cualquier sustancia antigénica que se localice dentro o fuera de las células, sean antígenos
protozoarios, bacterias, virus, hormonas, enzimas, antígenos tisulares y otros.
En dependencia de los objetivos trazados, se pueden emplear distintas variantes de tinción en
la inmunofluorescencia:
Método Directo: El material se tiñe directamente con el correspondiente anticuerpo
marcado.
Antígeno (Ag) + Ac fluorescente (Ac-F) → Ag-Ac-F 30
Este es el método más simple y específico aunque es menos sensible que el indirecto. Tiene la
desventaja de que para cada antígeno específico se requiere de un anticuerpo homólogo
marcado con el fluorocromo, lo cual no resulta económico ni práctico.
Método Indirecto: El anticuerpo primario (no marcado) se añade sobre la muestra y el
anticuerpo secundario (marcado) se combina con el complejo Ag-Ac primario. Si la
fluorescencia es específica, se puede identificar el antígeno cuando se conoce el anticuerpo
primario o viceversa.
Ag + Ac primario → Ag-Ac primario
Ag-Ac primario + Ac secundario (Ac-F) → Ag-Ac primario-(Ac-F)
Este método, en comparación con el directo, presenta 3 ventajas fundamentales: es más
sensible, sirve para detectar tanto Ag como Ac y se puede trabajar una amplia variedad de
Ag-Ac siempre que se utilizan sueros de la misma especie.
EXPERIMENTO 1.
DETECTAR LA PRESENCIA DE α-TUBULINA EN CÉLULAS DE
NEUROBLASTOMA
Objetivos.
Conocer y familiarizarse con la técnica de Inmunofluorescencia.
Método
Determinación por Inmunofluorescencia indirecta de la proteína del citoesqueleto α-tubulina
en el cultivo celular de neuroblastoma
Procedimiento.
1. Una vez preparada la placa de cultivo celular con el número adecuado de células se
les deja por incubando por 24 horas con medio de cultivo completo a 37°C con 5%
CO2 o son expuestas a algún agente en estudio que podría afectar a la presencia y
cantidad de la proteína a-tubulina.
2. Una vez listo el cultivo se procede a las 4 etapas fundamentales de la
Inmunofluorescencia:
- Fijación
- Permeabilización
- Bloqueo
- Inmunodetección
En el presente experimento, se usará el simulador virtual Immunology Virtual Lab l
PraxiLabs para conocer los pasos del ensayo de inmunofluorescencia a través del siguiente
video: https://www.youtube.com/watch?v=64Svwvc_rMA
Por lo que deberá anotar cada paso realizado en el simulador virtual y relacionarlos con las
etapas descritas anteriormente.
PASOS DEL SIMULADOR VIRTUAL.
1. Para empezar vamos a retirar los medios de la placa pipeteando.
2. Añadir 2 ml de PBS en la placa. Pasado un momento remover el PBS de la
placa a este proceso se le llama lavado.
3. El proceso de lavado se va a repetir una vez más
4. Ahora se debe añadir la solución, va a ser 2 ml de solución de
paraformaldehído en la placa. Pasado un momento remover la solución de la
placa y añadimos el buffer a nuestra placa. Añadimos 2 ml de PBS.
5. Hacemos el proceso de lavado 2 veces.
6. Añadimos 2 ml de 0.1% triton X-100% en PBS en la placa.
7. Colocamos la placa en hielo y la ponemos en incubación por 15 minutos, este
proceso se llama: Permeabilización de célula.
8. Removemos el 0,1% triton X-100% de la placa, añadimos 2 ml de PBS a
nuestra placa, esperamos un momento y lo quitamos.
9. Añadimos 0,1 ml de tampón de bloqueo en la placa.
10. Ponemos un papel filtro en nuestra placa.
11. Encima del papel filtro añadimos 20 µl del anticuerpo primario.
12. Añadimos la platina sobre nuestro anticuerpo primario y cubrimos nuestra
placa.
13. Colocamos la placa en una caja oscura.
14. Ponemos la caja toda la noche en un refrigerador a 4°C
15. Pasada la noche sacamos la caja del refrigerador y quitamos el papel filtro.
16. Añadimos 2 ml de PBS a la placa, esperamos y lo removemos, es el proceso
de lavado.
17. Sacamos una nueva placa y ponemos papel filtro en esta.
https://www.youtube.com/watch?v=64Svwvc_rMA
18. Añadimos 20 µl del anticuerpo secundario.
19. Añadimos la platina sobre nuestro anticuerpo secundario y cubrimos nuestra
placa.
20. Nuestra nueva placa con el anticuerpo secundario la colocamos en nuestra caja
negra.
21. Colocamos la caja negra durante la noche a 4°C
22. Pasada la noche sacamos la caja negra, la abrimos y quitamos el papel filtro de
esta.
23. Hacemos el proceso de lavado.
24. En una platina microscópica rectangular colocamos 5 µl de medio montaje.
25. Colocamos una platina circular encima de nuestro medio montaje.
26. Observamos nuestra platina bajo un microscopio en una habitación oscura.
27. Aquí estarán los resultados.
Para la detección de α-tubulina; se debe usar como anticuerpo primario un Anti α-tubulina
(producido en algún animal de experimentación puede ser mouse o rabbit) en este ensayo fue
mouse. Y el anticuerpo secundario debe ir dirigido contra la especie del anticuerpo primario,
por lo que es fundamental conocer este dato. (Si el anticuerpo primario se produjo, por
ejemplo, en ratón, el secundario deberá ser un anti-ratón obtenido en una especie diferente a
ésta) por lo que en este ensayo se usó un anti-mouse Dylight 488 (marcado con fluoróforo
verde)
En inmunofluorescencia no solo se debe marcar la proteína en interés, sino también se marca
el núcleo (con los colorantes Hoechst o DAPI) y alguna proteína constitutiva como la actina
en este caso.
Resultados: 1 Fig. Detección de F-actina usando como anticuerpo a la Faloidina
2Fig. Tinción de los núcleos con Hoechst
3Fig. Detección de a-tubulina usando como 1er anticuerpo un Anti α-tubulina mouse,y como 2do anticuerpo un anti-mouse marcado con fluoróforo verde
4Fig. Merge o sobreposiciones de cada una de las 3 primeras imágenes para tener una
visual total del cultivo de neuroblastoma
EXPERIMENTO 2.
Lectura y discusión del artículo:
SARS coronavirus papain-like protease induces Egr-1-dependent up-regulation of
TGF-β1 via ROS/ p38 MAPK/STAT3 pathway
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4865725/pdf/srep25754.pdf
Objetivos.
Analizar y evaluar la importancia de la técnica de Inmunofluorescencia en el estudio del
efecto del coronavirus SARS en la activación de las vías MAPK.
Procedimiento
1. Discutir los resultados encontrados en el artículo, analizar el pool de técnicas
analíticas empleadas y la información que aportan
CUESTIONARIO.
1. Indique las diferentes formas de fijar células para la técnica de
inmunofluorescencia.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4865725/pdf/srep25754.pdf
-Existen distintos tipos de fijación de células dependiendo de la técnica a usar el tipo
de célula. En la inmunofluorescencia se pueden usar tres agentes.
a. Glutaraldehído: Este compuesto actúa por puentes entre los grupos amino de
las proteínas. Tiene la ventaja de ser el más severo y el que preserva mejor la
estructura, sin embargo puede causar fluorescencia inespecífica.
b. Paraformaldehído: Este compuesto actúa gracias a los grupo amino de las
proteínas. Tiene la ventaja de penetrar más rápido la muestra, producir menos
autofluorescencia y menor cantidad de enlaces.
c. Metanol/ Acetona: Este compuesto actúa por precipitación de proteínas y
carbohidratos, usándose para gran cantidad de estudios. Como ventaja se fija
más rápido que los aldehídos, además de fijar y permeabilizar al mismo
tiempo, sin embargo, puede causar alteración en la localización de los
antígenos.
2. Busque la composición del Buffer de bloqueo usado en la técnica.
-Se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) al 1% en PBS.
3. Diga que es el PBS.
-El tampón fosfato salino o buffer fosfato salino (conocido también por sus siglas en
inglés, PBS, de phosphate buffered saline) es una solución tampón empleada en la
investigación biológica, bioquímica y de inmunología diagnóstica. Su función es
eliminar el exceso de anticuerpos que no se unieron a los complejos deseados.
4. Para qué sirve el DAPI.
-DAPI se usa para la tinción de ADN, para tinción nuclear, para la tinción de células
vivas y para la contratinción en tinciones inmunofluorescentes de material humano y
botánico, y en citometría de flujo.
5. ¿Qué tipo de inmunofluorescencia usaron en el artículo?
-En el artículo se utilizó la inmunofluorescencia indirecta
6. Describa las partes del microscopio de fluorescencia e indique su uso en la
técnica.
● La fuente de alimentación eléctrica : Fuente de transformacion
independiente que alimenta la lámpara
● Portalámparas (que incluye una lámpara de vapor de mercurio):Fuente de
luz visible (mejor que una halógena y una led). Emana bastante calor y
necesita ser controlada además de necesitar un sistema centrado de tres ejes.
● Un sistema colector de luz : Esto permite centrar y seleccionar el haz de luz
hasta los filtros .
● Filtros de fluorescencia: Filtros que dependiendo de la longitud de onda nos
ayudará a identificar distintos tipos de fluorescencia respecto a los
fluorocromos.
● Lentes: Lunas amplificadores
● Base: Lugar de soporte de la muestra
● Condensador: Sistema condensador de luz visible
7. Con sus palabras explique la sgte. figura extraída del artículo.
-En imagen podemos observar la ruta encontrada en la investigación: El mecanismo el
agente Egr-1 con la respuesta dependiente TGF-B1 mediada por la pre fibrosis
pulmonar causada por SARS-CoV PL-Pro en relación a las rutas ROS/p38
MAPK/STAT3/, factores mediante los cuales podemos deducir cómo ocurre la
inserción del material genético en los alvéolos y las ubicaciones en cada paso del
ciclo. Esto quiere decir que sabemos cómo reaccionan estas células al momento de ser
infectadas, cómo actúan los factores mencionados y la posibilidad de prever las
fibrosis pulmonar se pueda originar.
REFERENCIAS
1. Análisis de proteínas. Electroforesis, transferencia e inmunodetección. Advansta
Corporation
2. Laboratorio de Arbovirus. TÉCNICAS DE LABORATORIO PARA EL
DIAGNÓSTICO Y LA CARACTERIZACIÓN DE LOS VIRUS DEL DENGUE.
2013
3. Shih-Wein Li1, Ching-YingWang1, Yu-Jen Jou1, Tsuey-ChingYang2, Su-Hua
Huang3, LeiWan4, Ying-Ju Lin4 & Cheng-Wen Lin. SARS coronavirus papain-like
protease induces Egr-1-dependent up-regulation of TGF-β1 via ROS/ p38
MAPK/STAT3 pathway.2016