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406 | Genoma, patología molecular y terapia génica Figura 23-3. Transferencia de Southern. Mediante esta técnica, se transfieren los fragmentos separados sobre el gel de agarosa a una membrana especial de las mismas dimensiones que éste, originando en la misma una «réplica» de la disposición de los fragmentos en el gel inicial. Ello se consigue mediante la elución y arrastre de los fragmentos desde el gel a la membrana, por medio de una disolución reguladora y el uso de papel absorben- te para facilitar el flujo de la disolución reguladora (flechas negras de la parte inferior). Tras desnaturalizar los fragmentos (parte superior), éstos quedan fuertemente retenidos a la mem- brana, posibilitando su incubación en un medio líquido que con- tiene una sonda concreta que hibridará, de manera específica, con los fragmentos que contengan una secuencia análoga a la de la sonda. La presencia de los fragmentos sobre la membrana se puede detectar en función del tipo de marcaje de la sonda (mediante autorradiografía, como en la figura, si la sonda está marcada con un isótopo radiactivo, generalmente 32P). Película de rayos X Autorradiografía Sonda AD N di ge rid o en do nu cle as a re st ric ció n 1 AD N di ge rid o en do nu cle as a re st ric ció n 2 Gel Desnaturalización y transferencia Membrana Hibridación Papel absorbente Peso Disolución reguladora Membrana Gel Soporte M ar ca do re s de ta m añ o de A DN Figura 23-4. Detección de colonias transformadas que contienen un inserto concreto. Cuando se transforman bacterias con una mezcla de ADN recombinante, las colonias que crecen en presencia del antibiótico, para el que porta la resistencia el vector plasmídico, suelen contener algún tipo de ADN recombinante. La detección de la colonia o colonias que contienen un determinado inserto se hace por medio de una sonda para ese frag- mento. Para ello se hace una réplica de las colonias sobre una membrana, poniendo en contacto ésta sobre la placa que contiene las colonias y presionando ligera- mente para que sobre la membrana quede depositada una muestra de cada colonia y en la misma posición que en la placa. Tras lisar las células, desnaturalizar y fijar el ADN sobre la membrana, se incuba con la sonda en cuestión y se detecta la sonda fijada al ADN mediante autorradiografía. La posición de las manchas radiacti- vas sobre la membrana (en el ejemplo 1 y 7) nos indica las colonias de la placa original que contienen el ADN recombinante con el inserto de interés. El cultivo de bacterias de estas colonias en medio líquido permite amplificarlas y, con ellas, el ADN recombinante. 1 7 Placa con colonias transformadas por ADN recombinante Presión sobre el cesped bacteriano Bacterias unidas a la membrana Membrana Desnaturalización Hibridación Sonda radiactiva Autorradiografía Película de rayos X 1 2 34 5 6 78 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 23 Capitulo 23 8/4/05 11:42 Página 406
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