TÉCNICAS INMUNODIAGNÓSTICAS

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TÉCNICAS INMUNODIAGNÓSTICAS 
A grandes líneas los métodos de diagnóstico pueden ser directos cuando se observa macro microscópicamente al agente que investigo o cuando detecto antígenos específicos de ese agente y son particulares de cada agente, o pueden ser indirectos cuando observo los anticuerpos que forma el huésped, es decir, la respuesta humoral ante el patógeno y son para cualquier agente. 
· Métodos directos: se utilizan técnicas moleculares como las sondas de hibridación o la amplificación de ANDARN (la más utilizada) que incluye la PCR y la RTPCR. Los materiales que pueden utilizarse pueden ser biológicos como las heces, la orina, etc., o ambientales como el agua y los suelos o alimentos. Tienen un 100% de especificidad, una sensibilidad variable y están limitados por la accesibilidad del material biológico necesario. 
· Métodos indirectos: son las técnicas serológicas y son comunes a todos los taxones. Los antígenos de agentes infecciosos como los virales (s = superficie; c = Core; e = envoltura) o los bacterianos (O = somático; K= capsular; H = ciliar) son particulares y se nombran con letras, mientras que los antígenos fúngicos y parasitarios representan mosaicos antigénicos (se prefieren métodos directos en estos). 
Los métodos directos para virus son a través de cultivos celulares y observaciones por inmunohistoquímica. Para bacterias y hongos, los métodos directos consisten en cultivos que van a multiplicar el número absoluto de los agentes, mientras que los parásitos son enriquecidos y esto aumenta el número relativo (aumenta el tamaño no el número) de los agentes. 
Inmunofluorescencia 
La Inmunofluorescencia directa va a tratar de encontrar antígenos en una muestra biológica a través de un reactivo de laboratorio que es un anticuerpo monoclonal y que es específico para ese antígeno, además de estar marcado fluorescentemente. Si se observa fluorescencia significa que el antígeno se unió al anticuerpo monoclonal fluorescente. 
· Ventajas: son específicas y rápidas. 
· Desventajas: los anticuerpos marcados son poco estables, se necesita un microscopio de fluorescencia, un operador muy bien entrenado y son muy costosas. 
La Inmunofluorescencia indirecta (IFI/TIF) detecta la presencia de un anticuerpo específico, por lo tanto, se debe tener disponible el antígeno para el anticuerpo en estudio. Se administra, además, un anticuerpo antihumano marcado fluorescente (anti gammaglobulina o conjugado). Cuando al microscopio el antígeno está fluorescente significa que había anticuerpo por lo que se unieron y se ligó el conjugado, lo que dio la fluorescencia. 
· Ventajas: son específicas y rápidas, son semicuantificables (nos dice una cantidad relativa de anticuerpos presentes), permiten detectar conjunta o selectivamente IgG e IgM, son precoces y el conjugado es de gran estabilidad. 
· Desventajas: caras, requieren microscopio de fluorescencia, requieren un operador entrenado y no son aptas para tamizaje (no se pueden utilizar para estudios poblacionales). 
Enzyme-Linked InmunoSorbent Assay (ELISA) 
A veces se utiliza como sinónimo del Enzimoinmunoensayo (EIA), pero no son los mismos y son más usados los ELISA que se realizan en micro placas. 
En el ELISA directo, el conjugado (anticuerpo con enzima, generalmente peroxidasa) se pega al antígeno cuando este está presente y, por acción de la enzima, se desarrolla color al actuar sobre compuestos cromogénicos. 
 
 	 
En el ELISA indirecto el conjugado es anti anticuerpo humano marcado con la enzima y que se habían anticuerpos pegados al antígeno, el conjugado se puede agregar al sistema y la enzima también por lo que esta generará color. 
· Ventajas: especificidad dependiente del Ag/Ac utilizado, sensibles y rápidas, semicuantificables, detectan conjunta o diferencialmente IgG e IgM, son realizables por un operador no especializado, de costo generalmente bajo y son aptas para el tamizaje. 
· Desventaja: para obtener resultados semicuantitativos requieren lector de placas. 
 
Semicuantificación 
En micro tubos con 100µL de solución buffer se agregan 100µL de la solución problema o a investigar que se van pasando a otros micro tubos con 100µL de solución de buffer y se van diluyendo. Luego cada una de estas diluciones se siembran en improntas y se observa, con microscopio de fluorescencia, hasta que dilución se ve fluorescencia lo que le brinda el título. Por ejemplo, se puede dar de un 1/8. 
Pese a esto, ese tipo de título es antiguo y actualmente se informa con la inversa del título acompañado de la palabra Dils. Por ejemplo, un título de 1/8 pasaría a ser un título de 8 Dils. Para interpretarlo debo compararlo con el título de corte que es una medida del fabricante y que constituye una medida estándar, donde si el título es mayor a este título de corte el resultado es un título reactivo y si es menor es un título no reactivo. 
 
Reacciones por inmunocromatografía 
La inmunocromatografía es una técnica inmunológica que permite visualizar la reacción antígeno-anticuerpo por la acumulación del oro coloidal del conjugado en zonas específicas del papel de nitrocelulosa donde se fijan previamente anticuerpos de captura. 
Se basa en la migración de una muestra a través de una membrana de nitrocelulosa. La muestra es añadida en la zona del conjugado, el cual está formado por un anticuerpo específico contra uno de los epítopos del antígeno a detectar y un reactivo de detección. Si la muestra contiene el antígeno problema, éste se unirá al conjugado formando un complejo inmune y migrará a través de la membrana de nitrocelulosa. Si no, migrarán el conjugado y la muestra sin unirse. 
La zona de captura está formada por un segundo anticuerpo específico contra otro epítopo del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la unión del antígeno y conjugado quedarán retenidos y la línea se coloreará en este caso como rosa o azul (muestras positivas). En el caso contrario las muestras son negativas. 
La zona control está formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de detección. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unirá al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta línea es un control de que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras positivas y negativas. 
· Ventajas: específicos, rápidos y no requieren personal capacitado. 
· Desventajas: costosos, resultados cualitativos y no permiten diferenciar IgG de IgM. 
Inmunohistoquímica enzimática 
Es más comúnmente utilizada para la detección de antígenos en células en suspensión, sobretodo en infecciones virales. Se agrega un anticuerpo monoclonal con una enzima que si encuentra con el antígeno se unen y luego de administrar el sustrato la enzima actuará sobre este y quedará fijada en el tejido si se encuentra presente el antígeno. 
· Ventajas: altamente específicas y realizables en tejidos o células en suspensión. 
· Desventajas: complejas, requieren personal capacitado y los insumos son costosos. 
Reacciones de precipitación 
Pueden ser realizadas en fase líquida (no tiene utilidad en diagnóstico) o fase sólida. Se llama precipitación porque el antígeno y el anticuerpo difunden espontáneamente en aproximadamente 48 horas y cuando se encuentran precipitan. Pueden ser inmunodifusión doble (ID) o inmunodifusión radial doble (IDD). Se utilizan sobre todo en parasitología y no necesitan colorearse. 
· Ventajas: específicas y económicas. 
· Desventajas: técnicas largas (aprox. 2 días de difusión), resultados cualitativos y no se permite determinar IgG e IgM por separado. 
Contrainmunoelectroforesis 
Tiene aplicación en hongos mayormente, donde tanto el Ag como el Ac difunden, pero no espontáneamente sino por la aplicación de una corriente eléctrica, es decir, por electroforesis. Cuando se encuentran precipitan en una banda blanca. 
Reacciones de aglutinación 
Puede ser directa donde se aglutina directamente el antígeno con el anticuerpo, o puede ser indirecta cuandoel antígeno está unido a partículas inertes como látex, a gelatinas dando la aglutinación de partículas o a glóbulos rojos dando lugar a la hemoaglutinación. 
La hemoaglutinación indirecta es de las técnicas más difundidas y consiste en pegar el Ag a un glóbulo rojo heterólogo, se agrega el suero del paciente con anticuerpos, se van a unir y van a impedir que los glóbulos rojos caigan y se depositen porque forman una red de aglutinación. Luego se realizan diluciones sucesivas en pocillos, se homogeniza, se deja reposar 0,5-1 hora y luego se lee la reacción. En tanto si el suero del paciente no tiene los anticuerpos, los glóbulos rojos no se van a unir y van a caer sin formar la red de aglutinación. 
Se considera aglutinación positiva cuando la forma del pocillo es de manto (pocillos 1 y 2 de la imagen) y negativa en forma de botón (5 y 6). Los pocillos 3 y 4 se consideran dudosos. 
· Ventajas: específicas, sensibles, semicuantificables, técnicas cortas, económicas y no requiere personal especializado. 
· Desventajas: no permite determinar IgG e IgM por separado. 
Reacciones de inhibición 
Son utilizadas generalmente en bacteriología y se utilizan mayormente la de anticuerpos. Lo más común es la inhibición de la aglutinación o de la hemaglutinación. Se basa en administrar anticuerpos a un cultivo, que si no reconocen al patógeno se va a producir la hemoaglutinación al haber Ac disponibles para los glóbulos rojos. De lo contrario, es decir, si el anticuerpo reconoce al virus no se forma la aglutinación al no haber Ac disponibles. 
Otra reacción de inhibición es la de neutralización que se realiza por reducción de placas y detecta anticuerpos. Se inhibe un efecto citotóxico porque si la acción de un antígeno es la muerte celular y esta queda reducida cuando agrego un anticuerpo porque se unen al antígeno, donde este complejo se une a la célula y no hay destrucción celular. 
· Ventajas: específicas, técnicas cortas y económicas. 
· Desventajas: no son muy sensibles y no permiten determinar IgG de IgM por separado. 
 
Inmunotransferencia o Western Blot 
Consiste en fraccionar un antígeno en una membrana de micro celulosa y una vez que está fijado se agrega el suero patrón que puede tener un anticuerpo, un segundo anticuerpo, una enzima sustrato y posteriormente se revela con color. 
· Ventajas: altamente específicas, de técnica corta y no requiere equipamiento especial. 
· Desventajas: muy costos y no permite determinar IgG e IgM por separado. 
Respuesta celular del hospedador 
Conocidas como intradermorreacciones y tienen un gran uso en micología y en parasitología.