INMUNOLOGIA word

Vista previa del material en texto

BIOTECNOLOGÍA EN LA PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
- INTRODUCCIÓN
Los anticuerpos monoclonales son glucoproteínas especializadas que hacen parte del sistema
inmune, producidas por las células B, con la capacidad de reconocer moléculas específicas
(antígenos). Son herramientas esenciales en el ámbito clínico y biotecnológico, y han probado
ser útiles en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades infecciosas, inmunológicas y
neoplásicas.
- ESTRUCTURA Y CARACTERÍSTICAS BÁSICAS DE LOS ESTUDIOS
Las inmunoglobulinas están formadas por cuatro cadenas polipeptídicas. Dos cadenas
pesadas, y dos cadenas ligeras, cada una de ellas idéntica, unidas por puentes disulfuro que
forman una estructura espacial similar a una Y. Las cadenas ligeras y pesadas se agrupan de
tal manera que existe una proximidad espacial entre los cuatro extremos amínicos y por otra
parte los extremos carboxílicos. Las inmunoglobulinas pueden ser fraccionadas mediante la
utilización de enzimas (papaína, pepsina, etc.), obteniéndose diferentes tipos de fragmentos.
Al tratar con papaína la inmunoglobulina, se produce la ruptura específica de las cadenas
pesadas y se obtienen dos fragmentos: uno cristalizable que es el FC y otro Fab, que es en el
que se encuentran los sitios de unión antígeno
Cadenas ligeras
Como mencione hay dos tipos de cadenas ligeras: tipo kappa (κ) y lambda(λ) que poseen unos
200 aminoácidos cada una y se unen a las pesadas por un puente disulfuro intercatenario
(entre cadenas).
Cadenas pesadas
Están formadas por unos 400 aminoácidos y unidas entre sí por puentes disulfuro
intercatenarios, que pueden ser distintos en número dependiendo del tipo de inmunoglobulina.
Esta zona, donde se encuentran los puentes intercatenarios, es muy flexible y constituye lo
que se denomina zona bisagra, que es por donde se deforman estas moléculas cuando se unen
al antígeno.
Las cadenas ligeras poseen dos partes: una corresponde al extremo carboxílico que es
constante (CL) y otra que está ubicada al extremo amínico, que es muy variable (VL).
También las cadenas pesadas tienen una parte variable (VH) y otra constante (CH). Las
partes variables, tanto de las cadenas ligeras como de las pesadas, es por donde se produce la
unión al antígeno.
La parte constante de estas cadenas es diferente según la clase de inmunoglobulina que
consideremos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE
respectivamente. (poseen la misma estructura básica pero cada tipo de ig posee una cadena
pesada diferente) tipo: γ, α, (miu) μ, δ y ε(epsilon)
Las Ig son monoméricas, con excepción de la IgA, que forma dímeros, y de la IgM,
pentámeros.
Regiones hipervariables
Las zonas variables, tanto de la cadena L como H, poseen a su vez tres pequeños segmentos muy
variables, por lo que se les conoce como regiones hipervariables, su importancia radica en que
conforman el centro activo de las Igs, que es por donde se produce el reconocimiento y unión al
antígeno.
Cada una de estas regiones hipervariables se compone de 17 a 20 aminoácidos, de tal manera que
pequeños cambios suponen una enorme fuente de variabilidad de posibilidades de unión al antígeno
sin cambiar el resto de la molécula. Los anticuerpos son capaces de generar numerosas respuestas tras
su unión a los antígenos. Esas respuestas efectoras dependen del extremo carboxiterminal de cada
isotipo que determina el tipo de unión a determinados receptores de membrana de las células y la
capacidad de fijar complemento
- SÍNTESIS DE INMUNOGLOBULINAS. GENERACIÓN DE DIVERSIDAD.
ACTIVACIÓN Y MADURACIÓN DE LOS LINFOCITOS B
La producción de las Ig corre a cargo de las células B que en su etapa madura expresan en la
membrana moléculas de IgM e IgD. Cuando se activan, comienza una producción de Ig de
baja tasa, cambia el isotipo y comienza la maduración por afinidad. En la etapa de célula
plasmática hay una alta secreción de Ig de alta afinidad con escasa presencia de Ig de
membrana. Los mecanismos que controlan la diversidad de los anticuerpos son altamente
complejos y han ocupado la acti- vidad de los investigadores durante décadas.
Resumiendo mucho, podemos decir que existen 2 etapas básicas en este proceso: una
recombinación somática, en la que se produce la combinación de distintos segmentos génicos
presentes en las regiones variables de las cadenas ligeras y pesa-das que terminan formando
un gen funcional responsable de la secuencia de AA de la porción variable de la molé- cula de
Ig, que da lugar a una muy elevada diversidad de moléculas en lo que se llama repertorio
primario de anti- cuerpos, y una hipermutación somática durante la respuesta a antígenos, que
corresponde a mutaciones puntuales de la secuencia variable una vez formada ésta y que
terminan per- mitiendo una mayor afinidad de unión.
Activación de las células B
Las células B se activan cuando su receptor de célula B (BCR) se une a antígenos solubles o
unidos a membrana. Tras la unión, el BCR se activa, forma microagregados y se favorecen
cascadas de señalización. Tras una fase de contracción, el microagregado forma una sinapsis
inmunológica que permite la interacción estable entre células T y B para favorecer una
señalización bidireccional activa.
Tras activarse, las células B pueden iniciar el proceso de conmutación de isotipos. En su
forma inactiva, las células B expresan IgM/IgD, pero tras activarse pueden producir IgA, IgE,
IgG o mantener la expresión de IgM. Esto se consigue mediante la escisión de isotipos no
deseados (Figura 1). Las citocinas, producidas por las células T y otras células, son
importantes para determinar qué isotipo expresarán las células B.
- PRODUCCIÓN DE ESTUDIOS MONOCLONALES
Un método para obtener anticuerpos monoclonales completamente humanos consiste en la
utilización de ratones transgénicos, en los cuales se introducen los genes de las
inmunoglobulinas humanas utilizando distintos vectores. Los ratones transgénicos portadores
de los genes de las inmunoglobulinas humanas se cruzan con ratones en los cuales se han
eliminado los genes de las inmunoglobulinas endógenas murinas, con el fin de conseguir un
ratón capaz de producir exclusivamente inmunoglobulinas humanas.
Por otra parte, la tecnología Phage Display (presentación de proteínas en la superficie de
fagos filamentosos) permite obtener anticuerpos monoclonales sin utilizar ratones. Los fagos
son partículas víricas que infectan bacterias, sin producir enfermedades en los seres humanos.
Mediante técnicas de ADN recombinante es posible introducir genes de cualquier organismo,
sin importar la complejidad, en el genoma de los fagos.
Lo que se pretende con esta tecnología es obtener una molécula que posea la máxima afinidad
por una determinada diana terapéutica.
Y para ello, el primer paso es obtener todas las posibles combinaciones genéticas que
produzcan la molécula que se está buscando y cada una de estas secuencias se fusiona con el
gen que codifica las proteínas de la cápside del fago, para lograr que sean expresadas en su
superficie. De esta forma se obtienen clones de fagos,
Posteriormente, se eligen aquellos fagos que expresen en su superficie la molécula con las
mejores propiedades de unión a la molécula diana.
Proceso de obtención de un anticuerpo monoclonal destinado a bloquear la acción de
una proteína diana en un determinado proceso patológico.
● Dicho proceso se inicia con el aislamiento de los genes que codifican las cadenas
ligeras (VL) y pesadas (VH) de la fracción variable, a partir de los linfocitos B
aislados de donantes humanos adultos sanos.
● Estos genes se amplifican mediante un proceso denominado reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), que permite aumentar su cantidad exponencialmente.
● Una vez aisladas y copiadas las secuencias genéticas, éstas se someten a un proceso
de recombinación, obteniéndose todas las combinaciones posibles, lo que supone la
creación de una gran cantidad de anticuerpos diferentes.
● El siguiente paso es clonar las combinaciones obtenidas, para lo cual se insertan en el
ADN delfago junto a los genes que codifican las proteínas estructurales de la
cápside. Los fagos se replican en el interior de E. coli y los anticuerpos funcionales
son expresados en su cápside, de la misma manera que un linfocito B expresa los
anticuerpos en su superficie.
● Se deberán seleccionarse aquellos que contienen la secuencia génica que codifica el
anticuerpo con la mayor afinidad y especificidad por la proteína diana en cuestión.
● Una vez seleccionada la combinación VH/VL (de la fracción Fab), ésta se ensambla
con el esqueleto estructural del anticuerpo, la fracción Fc. La secuencia genética
resultante se introduce en células de ovario de hámster chino (células CHO).
Seguidamente, se detallan las etapas del proceso de fabricación industrial. El proceso de
producción consta de dos fases fundamentales:
1. Fase de elaboración o upstream o de producción a pequeña escala y
2. Fase de transformación o downstream o de producción a gran escala.
La fase de elaboración comienza con el cultivo de las células, que serán las encargadas de
producir la proteína terapéutica. Estas células se cultivan a pequeña escala, en frascos o placas
Petri, que contienen el medio de cultivo necesario para que las células crezcan. Una vez
conseguida la línea celular, se somete a crioconservación en numerosos viales para crear un
banco de células.
Cuando se va a llevar a cabo el proceso de fabricación de un lote, se descongela un vial del
banco de células y se inicia el cultivo celular en un matraz que contiene un pequeño volumen
de medio de cultivo.
Durante el proceso de escalado, las células se transfieren secuencialmente a recipientes cada
vez más grandes, que contienen mayor volumen de medio de cultivo, de manera que las
células se dividen constantemente siempre que el entorno de crecimiento siga siendo
favorable.
A continuación, las células que han mostrado mayor capacidad de crecimiento de forma
estable a lo largo de varios cultivos se cultivan en equipos de volumen superior y se evalúa su
capacidad de producción de la proteína de interés y la calidad de la misma, en base a su
correcta estructura, glicosilación, funcionalidad, etc.
La siguiente etapa es la fase de transformación o downstream o de producción a gran escala;
es decir, a la escala de producción necesaria, que vendrá determinada por las necesidades de
producción (en base al volumen de mercado al que va destinado el fármaco) y la
productividad de la línea celular.
- UTILIDAD Y APLICACIÓN EN PATOLOGÍA HUMANA DE LOS ESTUDIOS
MONOCLONALES
Sin tener en cuenta el uso de diagnósticos, los cuales han revolucionado el campo de la
histopatología y desarrollado nuevas técnicas de laboratorio como la “citometría de flujo”
para el tratamiento de enfermedades humanas. La unión del anticuerpo monoclonal al
antígeno contra el que está diseñado puede facilitar la producción de citotoxicidad celular
dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad por la activación del sistema de
complemento. La propia unión al antígeno puede bloquear receptores de la membrana celular,
unirse a factores presentes en el suero y evitar su unión a receptores, o inducir señales
intracelulares. Las consecuencias finales de estas interacciones son numerosas y han
encontrado aplicación en áreas muy diversas.
Una manera de modificar la capacidad efectora de los anticuerpos monoclonales es la
conjugación con moléculas citotóxicas con toxinas, con radiofármacos o con citocinas; esta
última ha sido una estrategia utilizada en oncología mediante la creación de proteínas de
fusión que incorporan genes de IL-2, IL-12 o GM-CSF, entre otras. La conjugación de
enzimas capaces de convertir un profármaco en fármaco con anticuerpos monoclonales
dirigidos a células tumorales ha permitido una acción muy selectiva en el tejido tumoral del
fármaco en cuestión.
En la oncología es el área de aplicación terapéutica más importante para la utilización de
anticuerpos dirigidos contra Her2 en cáncer de mama o contra el factor de crecimiento
epidérmico (EGF) o el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) en varios tipos de
tumores entre otros. Las enfermedades autoinmunes son el grupo siguiente de patología
humana en el que más se han empleado estos productos y, fundamentalmente en:
● Artritis
● Reumatoide
● Enfermedad inflamatoria intestinal
● Esclerosis múltiple
● Lupus eritematoso
Así como en el rechazo de trasplantes y enfermedad de injerto contra el huésped.
Los anticuerpos monoclonales se han empleado también con otras finalidades, como el
tratamiento de la septicemia, la prevención de complicaciones de enfermedades virales o el
tratamiento de intoxicaciones por fármacos. Sin ninguna duda, la disponibilidad de estos
anticuerpos y de la tecnología para su refinamiento constituye ahora y más aún en el futuro
una parte fundamental de la medicina para el tratamiento de las enfermedades y de la forma
de aplicarlos.
- CONCLUSIONES
- Además de su impacto en el diagnóstico de laboratorio, los anticuerpos monoclonales son una
herramienta terapéutica muy poderosa.
- Su alta especificidad permite acceder a dianas muy precisas, permitiendo la determinación de
cambios celulares muy diferentes, además, dependiendo de la región Fc, pueden diseñarse
para promover diferentes tipos de respuestas efectoras.
- El uso de anticuerpos ha mejorado significativamente su tolerabilidad clínica. La
manipulación de anticuerpos o el diseño de nuevos fragmentos de anticuerpos combinándolos
con otras moléculas abre una amplia gama de aplicaciones médicas.