BMC Teorica 6

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Tecnología del ADN 
recombinante 
BMC-UNM 
Las bacterias tienen tres formas posibles de intercambiar ADN: Transformación, 
Transducción y 
Conjugación 
Transformación 
Transducción 
Conjugación 
La biología molecular utiliza estos tres mecanismos de transferencia de ADN (o una parte 
de ellos) para el clonado, amplificación y caracterización de segmentos de ADN de interés. 
Clonado molecular 
Clonar significa hacer copias idénticas. 
Este término originalmente fue aplicado al procedimiento de aislar una célula y permitirle 
reproducirse creando una población de células idénticas. 
Actualmente, el clonado molecular involucra la separación de un fragmento de ADN 
específico, unirlo a una molécula de ADN acarreador y luego amplificar este ADN 
modificado millones de veces. 
El resultado es una amplificación selectiva de un gen o de un segmento en particular. 
El clonado molecular involucra los siguientes pasos: 
Aislamiento de ADN 
Análisis del ADN 
Lisis celular y de núcleos en caso de eucariontes 
(detergentes, proteasas, cambios de presión) 
Separación del ADN del resto de los componentes 
celulares (principalmente proteínas) 
(agentes desnaturalizantes de proteínas, solventes 
orgánicos: fenol, cloroformo) 
Recuperación de la fase acuosa y 
precipitación con etanol o isopropanol 
Resuspensión del ADN concentrado 
Análisis y cuantificación del ADN por espectrofotometría 
Los ácidos nucleicos absorben eficientemente la luz ultravioleta debido a sus bases 
nitrogenadas que forman anillos aromáticos. 
Cuantificación por espectrofotometría: 
ADN dc = 50 ug/ml 
ADN sc = 33 ug/ml 
ARN ss = 40 ug/ml 
La relación A260/A280 sirve para 
determinar qué tan contaminado 
está el ADN con proteínas 
A260/A280 = 1,8 o 2 
Es una buena preparación de ADN 
La relación A260/230 sirve para 
determinar qué tan contaminado 
está con polisacáridos 
Concentración de ácido 
 nucleico (ug/ml) 
= valor O.D. x factor de dilución x factor de corrección 
(según A.N.) 
Ya tenemos el ADN purificado y cuantificado, ahora lo podemos procesar o modificar 
Enzimas necesarias para la manipulación del ADN: 
ADN polimerasas: DNA polimerasa I, Fragmento de Klenow (marcación del ADN). 
Secuenasa (DNA polimerasa modificada del fago T7) (secuenciación). 
Taq polimerasa (DNA pol I de Themous aquaticus) (para PCR). 
Endonucleasas o enzimas de restricción: se obtienen de bacterias pero también se 
 producen de forma recombinante. 
 Su función natural es proteger contra DNA extraño. 
DNA ligasa 
Enzimas de restricción: 
Reconocen secuencias específicas en el ADN y cortan únicamente en esos sitios. 
Las secuencias blanco son palíndromos de 4, 6 u 8pb. 
Las enzimas de restricción pueden cortar 
el ADN dejando extremos romos: 
O pueden cortar el ADN dejando extremos 
cohesivos o protuyentes: 
Se han purificado y caracterizado más de 100 enzimas de restricción. 
Se nombran con una abreviatura de tres letras que se refieren al organismo hospedador, 
seguido por otra letra (para indicar alguna cepa específica) y un número romano (en caso 
de que se hayan identificado varias E.R. en la misma cepa). 
EcoRI (de Escherichia coli, cepa RY13, enzima 1) 
EcoRV (de Escherichia coli, cepa RY13, enzima 5) 
HaeIII (de Haemophilus aegyptius, enzima 3) 
BamHI (de Bacillus amyloliquefaciens, cepa H, enzima 1) 
Los extremos cohesivos pueden aparearse con otros semejantes: 
Finalmente, una DNA ligasa sella la unión entre las dos moléculas de ADN. 
La DNA ligasa es más eficiente al unir dos fragmentos con extremos cohesivos que con 
extremos romos. 
Extremos cohesivos compatibles 
Son extremos cohesivos cuyas secuencias son complementarias, a pesar de 
ser producidas por enzimas de restricción distintas. 
¿Se podría digerir el ADN recombinante obtenido con BamHI? 
Transformación 
Introducción en 
una bacteria. 
Preparación de bacterias competentes y transformación: 
Crecimiento 
bacteria 
Resuspender en 
una solución de 
CaCl2 
Mantener 
en hielo 
Guardar 
 a -80°C 
Agregar el ADN 
en frío 
Choque 
térmico 
42°C 90seg 
Recuperación 
Plaqueo en 
LB agar 
Marcadores de selección: 
Marcadores de selección: 
-Selección de transformantes: Permite diferenciar las bacterias que recibieron el vector 
de las que no lo recibieron. 
Antibióticos 
-Selección de recombinantes: Permite diferenciar las bacterias que recibieron el vector 
religado de aquellas que recibieron el vector+inserto. 
-complementación 
Uso de la -complementación 
Componentes de un plásmido: 
LacZ’ = fragmento -complementante del gen lacZ 
Inductor: 
Inductor 
gratuito: 
IPTG 
Sustrato 
Xgal 
-Gal 
-complementación 
El gen lacZ tiene dos mutantes: M15 y Fragmento -complementante. 
Ninguna de estas dos mutantes puede sintetizar una enzima -galactosidasa activa. 
-complementación 
Fenotipos de los mutantes LacZ en presencia de Xgal 
Cuando estos dos genes mutados se encuentran en una misma célula, el 
péptido -complementante interacciona con la mutante M15 generando una 
enzima -galactosidasa activa. 
Ninguna de estas dos mutantes por separado puede 
sintetizar una enzima -galactosidasa activa. 
Aplicación de la -complementación para la selección de moléculas recombinantes: 
1) Se trabaja con bacterias M15, AmpS 
2) El vector que utilizamos contiene una 
copia del péptido -complementante. 
Dentro de esa secuencia, posee un MCS 
que no interrumpe el ORF. 
3) Usamos uno de los sitios del MCS para 
clonar un inserto de nuestro interés. 
Fenotipo en 
presencia de 
Ampicilina y Xgal 
Si bien la metodología de la -complementación se desarrolló como marcador de 
plásmidos recombinantes, esta metodología fue trasladada al resto de los vectores 
que se utilizan para construir bibliotecas: BACs y YACs. 
Pero no todos los plásmidos que se usan en biología molecular o ingeniería 
genética tienen el sistema de -complementación. 
Hay que hacer dos reacciones 
de ligación: 
1) Vector digerido sólo + ligasa 
2) Vector + inserto + ligasa 
¿Cómo funciona la ligasa? 
Desfosforilación del vector: 
Esto aumenta la eficiencia para analizar colonias transformantes: 
1) Control de ligación (vector desfosforilado solo): muy pocas colonias. 
2) Ligación vector desfosforilado + inserto: esperamos muchas colonias. 
PCR y RT-PCR 
El descubrimiento de una DNA polimerasa termoresistente permitió el desarrollo 
de la PCR 
PCR: 
1° ciclo: 2 copias 
2° ciclo: 4 copias 
3° ciclo: 8 copias 
Crecimiento exponencial del n° 
de copias: 2n 
Los cebadores usados en una reacción de PCR se pueden diseñar de manera tal que 
incluyan un sitio blanco para una enzima de restricción. 
El producto de PCR amplificado y digerido con 
la E.R. ahora se puede clonar en un vector 
digerido con la misma E.R. 
RT-PCR: 
Extracción de RNA 
Uso de un cebador poli-dT 
Síntesis de la hebra de ADN 
complementaria con la enzima 
Transcriptasa Reversa 
Síntesis del ADN doble cadena 
(cDNA) 
 Detección de bacterias y virus utilizando cebadores específicos. Por ejemplo, la PCR 
puede detectar la presencia de virus latentes como los de la hepatitis B, C y el HIV, en el 
genoma de los individuos infectados que todavía no han desarrollado respuesta inmune a 
dichos patógenos, por lo cuales no puede ser detectado por ensayos con anticuerpos. 
Utilidad de la PCR: 
 Aplicación en la medicina forense para la identificación de personas permitiendo el 
reconocimiento de cadáveres, parentescos biológicos en casos de disputa de paternidad. 
 Establecer grupos tisulares precisos en transplantes, amplificando secuencias de los HLA 
del donante y receptor para determinar compatibilidades. 
 Detección de organismos transgénicos, por ejemplo productos de agricultura como soja o 
maíz, para su comercialización. 
 Estudio de relaciones evolutivas entre los organismos. 
Secuenciación 
(método de Sanger) 
Secuenciación automática del ADN 
En unasola reacción se 
incluyen los 4 dideoxys 
marcados con un fluoróforo 
distinto cada uno. 
Se lee con un láser y se 
almacena la secuencia en 
una computadora. 
Es posible secuencias de 
fragmentos de 800 pb 
El secuenciador automático entrega archivos con distinta información. 
Hay programas de análisis de secuencias que pueden leer cada uno de esos archivos y 
así nosotros obtenemos la información. 
Programa BioEdit 
Lectura de los archivo “.abi”: electroferograma 
Además nos entrega la secuencia de nucleótidos en un formato que podemos leer, 
copiar, procesar y analizar: 
Este programa nos permite además comparar secuencias entre sí, haciendo un 
alineamiento: