Introducción a la PCR

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Introducción a la técnica de PCR 
(reacción en cadena de la polimerasa)
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
Premio Nobel de Química 1993
Kary B. Mullis (1/2)
“por inventar la técnica de PCR”
Kary B. Mullis, 1983
Permite la amplificación (clonado) de un segmento de 
ADN in vitro
El resultado es la amplificación de un segmento 
específico en una mezcla compleja de ADN
La importancia de los primers (cebadores)
Las secuencias de los primers determinan la región que se va a amplificar
Los segmentos de ADN que pueden ser clonados eficientemente 
tienen un tamaño de 50 a 5000 pb (pares de bases)
Tamaño primers: 18-25 nt (son de ADN)
Cada ciclo de amplificación consta de tres pasos:
Primer paso:
Desnaturalización del ADN doble cadena, a 93º-95º C 
La reacción de PCR consta de múltiples ciclos de amplificación 
(frecuentemente entre 20 y 40)
Segundo paso:
Hibridación de los primers (annealing), a 50º-70ºC 
dependiendo de la composición de los primers
Cada ciclo de amplificación consta de tres pasos:
La reacción de PCR consta de múltiples ciclos de amplificación 
(frecuentemente entre 20 y 40)
Tercer paso:
Síntesis de ADN, a 70º-75ºC
Cada ciclo de amplificación consta de tres pasos:
La reacción de PCR consta de múltiples ciclos de amplificación 
(frecuentemente entre 20 y 40)
Para generar los cambios cíclicos de temperatura se utiliza un termociclador
Algunos aspectos técnicos importantes:
Algunos aspectos técnicos importantes:
¿Cómo evitar la desnaturalización de la ADN polimerasa en cada ciclo?
Thermus aquaticus
Taq polimerasa
ADN polimerasa termoresistente
La Taq polimerasa no tiene actividad 3’ exonucleasa
(proofreading o lectura de prueba)
La amplificación es exponencial:
Después de 25 ciclos, habrá aprox 105 moléculas de ADN 
específicamente amplificadas
Ventajas de la PCR
Rapidez: El clonado por PCR puede realizarse en unas pocas horas, con 
equipos relativamente no sofisticados
Sensibilidad: La amplificación puede llevarse a cabo partiendo de 
cantidades muy pequeñas de ADN, incluso de una única célula
Limitaciones de la PCR
Se necesita información previa de la secuencia que se quiere amplificar, 
para poder sintetizar los primers
La secuencia a amplificar no puede ser muy larga
¿Cómo se visualizan los productos de amplificación?
Electroforesis de ácidos nucleicos
El objetivo de esta técnica es separar moléculas de ADN 
según su tamaño 
Electroforesis de ácidos nucleicos
Tinción con bromuro de etidio, que 
posee alta afinidad con el ADN para 
permitir la visualización
¿Cómo se visualizan los productos de amplificación?
Si comparamos dos moléculas de ADN de tamaño distinto que migran durante 
el mismo tiempo en el gel, observaremos que la molécula de menor tamaño 
ha migrado mayor distancia, quedando más cerca del ánodo (polo positivo del 
aparato de electroforesis)
-
+
M
M: marcador de peso 
molecular. Compuesto por 
fragmentos de ADN de 
tamaño conocido