Técnicas de Biología Molecular

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FUNDAMENTO
	TIPOS
	APLICACIÓN
	ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
	Se denominan también nucleasas de restricción, endonucleasas de restricción y en ocasiones restrictivas. Pertenecen a este grupo una gran diversidad de endo desoxirribonucleasas, descubiertas como enzimas propias de distintas bacterias.
	Tipo I. Las enzimas reconocen una secuencia específica de nucleótidos y hacen un corte aleatorio en la doble cadena en cualquier secuencia del ADN. 
Tipo II. Enzimas que reconocen secuencias específicas y hacen el corte de la doble cadena de ADN en el mismo sitio de reconocimiento. 
Tipo III. Estas enzimas reconocen una secuencia específica y cortan el ADN de doble cadena fuera de la secuencia diana. 
	· Son una herramienta básica en clonación e ingeniería genética; para hacer mapas de restricción de plásmidos o genomas. 
· En estudios de determinación de polimorfismos, como la técnica de RFLP
	VECTORES
	Un vector se define como una molécula de ADN de doble cadena (DNAds), con capacidad de albergar un fragmento de ADN exógeno (de otro origen).
	Vectores de clonación. Su finalidad es el almacenamiento de secuencias y la obtención de grandes cantidades del ADN insertado o de la molécula recombinante. 
Vectores de expresión. Aquellos cuyo objetivo es producir un transcrito (ARN) o la proteína producto de ese transcrito. 
	Puede emplearse para la producción de proteínas eucariotas en bacterias (proteínas recombinantes, así como para el establecimiento de librerías genómicas o genotecas (de ADNc o ADNg, que han permitido secuenciar por completo el genoma humano y el de otros organismos.
	ELECTROFORESIS
	La electroforesis, es una parte importante del procedimiento sistemático del análisis (separación, purificación, preparación) de los ácidos nucleicos y las proteínas.
	
Electroforesis horizontal. Se lleva a cabo con gel de agarosa para ácidos nucleicos. 
Electroforesis vertical. Empleada exclusivamente con gel de poliacrilamida, se utiliza para proteínas o ácidos nucleicos de pequeño tamaño.
	Es crucial en técnicas como la secuenciación, donde tras un corrimiento electroforético de las cuatro reacciones de elongación con los dideoxinucleótidos, se puede deducir la secuencia del segmento de ácido nucleico
	TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
	La obtención de fragmentos específicos de ADN fue posible mediante un método desarrollado a partir de herramientas propias de ciertos organismos. 
Los cromosomas, incluso los de las células eucarióticas más simples, contienen una enorme cantidad de ADN, por lo que localizar un segmento específico es como tratar de encontrar la proverbial aguja en el pajar. Para localizar fragmentos específicos se utiliza la técnica de hibridación de ácidos nucleicos.
	Southern blot. Es una estrategia estándar para analizar ADN previamente digerido con enzimas de restricción.
Northern blot. Es la contraparte del Southern blot y como ácido nucleico se utiliza ARN en lugar de ADN.
Dot/slot blot. Tras el aislamiento y separación de los ácidos nucleicos, éstos se aplican directamente a la membrana sin separarlos, según su peso molecular.
Hibridación in situ. Es un método histoquímico, utiliza los métodos de la inmunología.
	Técnica de Southern blot. Para identificar genes asociados con enfermedades de transmisión genética, e identificar mutaciones.
Técnica de Northern Blot. Muy útil para el estudio de los productos de la transcripción génica (ARNm) y de su regulación.
Hibridación In situ. Permite la localización de secuencias génicas a nivel cromosómico, con lo que se pueden detectar translocaciones y otras alteraciones cromosómicas, así como el estudio de expresión de genes (ARNm) a nivel celular y subcelular
	PCR (SUS VARIANTES) Y SECUENCIACIÓN
	Esta técnica se basa en una replicación exponencial in vitro de una molécula de ADN genómico (ADNg) o ADN complementario (ADNc), mediante ciclos repetitivos, que constan de tres temperaturas. En cada uno de los ciclos las moléculas se duplican hasta que los reactivos se agotan. 
La longitud del producto amplificado la delimitan los iniciadores, de cuyo diseño adecuado depende el éxito de la PCR. Los iniciadores deben ser específicos, no formar estructuras secundarias entre ellos ni hibridaciones inespecíficas entre ellos u otra parte de la cadena.
	PCR Convencional. Se basa en la detección del producto de amplificación mediante una electroforesis en gel de agarosa o acrilamida.
PCR Cuantitativa. El producto de PCR es cuantificable, lo que permite reportar en números absolutos la cantidad de un microorganismo o del ARNm de un gen en una muestra.
PCR Selectiva. Se diseñan primers capaces de hibridar solamente en secuencias con presencia de una mutación, por lo que, en caso de estar ausente, no se produce un producto de PCR.
PCR in situ. Se realiza en una muestra de tejido embebida en parafi na (laminilla) o congelada y cortada en criostato. 
PCR anidada. Proporciona mayor sensibilidad a la técnica, al amplificar las secuencias de ADN en dos rondas de amplificación con distintos pares de iniciadores o primers en cada una.
PCR en punto final. El producto de PCR se analiza después de 25 a 35 ciclos.
en el punto previo a la saturación de la reacción, mediante un gel de
electroforesis.
	Los productos de PCR pueden utilizarse para la secuenciación, detección de patógenos infecciosos (virus bacterias, hongos), amplificación de segmentos para su análisis mediante ADN finger-printing, o huella de ADN, en medicina forense, detección de mutaciones, análisis de la expresión génica o determinación de carga viral, entre otras muchas aplicaciones.