Técnicas de Biología Molecular

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FUNDAMENTO TIPOS APLICACIÓN 
ENZIMAS DE 
RESTRICCIÓN 
Se denominan también 
nucleasas de restricción, 
endonucleasas de 
restricción y en ocasiones 
restrictivas. Pertenecen a 
este grupo una gran 
diversidad de endo 
desoxirribonucleasas, 
descubiertas como 
enzimas propias de 
distintas bacterias. 
Tipo I. Las enzimas 
reconocen una secuencia 
específica de nucleótidos 
y hacen un corte aleatorio 
en la doble cadena en 
cualquier secuencia del 
ADN. 
Tipo II. Enzimas que 
reconocen secuencias 
específicas y hacen el 
corte de la doble cadena 
de ADN en el mismo sitio 
de reconocimiento. 
Tipo III. Estas enzimas 
reconocen una secuencia 
específica y cortan el 
ADN de doble cadena 
fuera de la secuencia 
diana. 
- Son una herramienta 
básica en clonación e 
ingeniería genética; 
para hacer mapas de 
restricción de 
plásmidos o genomas. 
- En estudios de 
determinación de 
polimorfismos, como 
la técnica de RFLP 
VECTORES 
Un vector se define como 
una molécula de ADN de 
doble cadena (DNAds), con 
capacidad de albergar un 
fragmento de ADN 
exógeno (de otro origen). 
Vectores de clonación. 
Su finalidad es el 
almacenamiento de 
secuencias y la obtención 
de grandes cantidades 
del ADN insertado o de la 
molécula recombinante. 
Vectores de expresión. 
Aquellos cuyo objetivo es 
producir un transcrito 
(ARN) o la proteína 
producto de ese 
transcrito. 
Puede emplearse para la 
producción de proteínas 
eucariotas en bacterias 
(proteínas 
recombinantes, así como 
para el establecimiento 
de librerías genómicas o 
genotecas (de ADNc o 
ADNg, que han permitido 
secuenciar por completo 
el genoma humano y el 
de otros organismos. 
ELECTROFORESIS 
La electroforesis, es una 
parte importante del 
procedimiento sistemático 
del análisis (separación, 
purificación, preparación) 
de los ácidos nucleicos y 
las proteínas. 
 
Electroforesis 
horizontal. Se lleva a 
cabo con gel de agarosa 
para ácidos nucleicos. 
Electroforesis vertical. 
Empleada 
exclusivamente con gel 
de poliacrilamida, se 
utiliza para proteínas o 
ácidos nucleicos de 
pequeño tamaño. 
 
Es crucial en técnicas 
como la secuenciación, 
donde tras un 
corrimiento 
electroforético de las 
cuatro reacciones de 
elongación con los 
dideoxinucleótidos, se 
puede deducir la 
secuencia del segmento 
de ácido nucleico 
TÉCNICAS DE 
HIBRIDACIÓN 
La obtención de 
fragmentos específicos de 
ADN fue posible mediante 
un método desarrollado a 
partir de herramientas 
propias de ciertos 
organismos. 
Los cromosomas, incluso 
los de las células 
eucarióticas más simples, 
contienen una enorme 
cantidad de ADN, por lo 
que localizar un segmento 
específico es como tratar 
de encontrar la proverbial 
aguja en el pajar. Para 
localizar fragmentos 
específicos se utiliza la 
técnica de hibridación de 
ácidos nucleicos. 
Southern blot. Es una 
estrategia estándar para 
analizar ADN 
previamente digerido con 
enzimas de restricción. 
Northern blot. Es la 
contraparte del Southern 
blot y como ácido 
nucleico se utiliza ARN en 
lugar de ADN. 
Dot/slot blot. Tras el 
aislamiento y separación 
de los ácidos nucleicos, 
éstos se aplican 
directamente a la 
membrana sin separarlos, 
según su peso molecular. 
Hibridación in situ. Es 
un método histoquímico, 
utiliza los métodos de la 
inmunología. 
 
Técnica de Southern 
blot. Para identificar 
genes asociados con 
enfermedades de 
transmisión genética, e 
identificar mutaciones. 
Técnica de Northern 
Blot. Muy útil para el 
estudio de los productos 
de la transcripción 
génica (ARNm) y de su 
regulación. 
Hibridación In situ. 
Permite la localización 
de secuencias génicas a 
nivel cromosómico, con 
lo que se pueden 
detectar translocaciones 
y otras alteraciones 
cromosómicas, así como 
el estudio de expresión 
de genes (ARNm) a nivel 
celular y subcelular 
PCR (SUS 
VARIANTES) Y 
SECUENCIACIÓN 
Esta técnica se basa en 
una replicación 
exponencial in vitro de una 
molécula de ADN 
genómico (ADNg) o ADN 
complementario (ADNc), 
mediante ciclos repetitivos, 
que constan de tres 
temperaturas. En cada uno 
de los ciclos las moléculas 
se duplican hasta que los 
reactivos se agotan. 
La longitud del producto 
amplificado la delimitan los 
iniciadores, de cuyo diseño 
adecuado depende el éxito 
de la PCR. Los iniciadores 
deben ser específicos, no 
formar estructuras 
secundarias entre ellos ni 
hibridaciones inespecíficas 
entre ellos u otra parte de la 
cadena. 
PCR Convencional. Se 
basa en la detección del 
producto de amplificación 
mediante una 
electroforesis en gel de 
agarosa o acrilamida. 
PCR Cuantitativa. El 
producto de PCR es 
cuantificable, lo que 
permite reportar en 
números absolutos la 
cantidad de un 
microorganismo o del 
ARNm de un gen en una 
muestra. 
PCR Selectiva. Se 
diseñan primers capaces 
de hibridar solamente en 
secuencias con presencia 
de una mutación, por lo 
que, en caso de estar 
ausente, no se produce 
un producto de PCR. 
PCR in situ. Se realiza en 
una muestra de tejido 
embebida en parafi na 
Los productos de PCR 
pueden utilizarse para la 
secuenciación, 
detección de patógenos 
infecciosos (virus 
bacterias, hongos), 
amplificación de 
segmentos para su 
análisis mediante ADN 
finger-printing, o huella 
de ADN, en medicina 
forense, detección de 
mutaciones, análisis de 
la expresión génica o 
determinación de carga 
viral, entre otras muchas 
aplicaciones. 
(laminilla) o congelada y 
cortada en criostato. 
PCR anidada. 
Proporciona mayor 
sensibilidad a la técnica, 
al amplificar las 
secuencias de ADN en 
dos rondas de 
amplificación con 
distintos pares de 
iniciadores o primers en 
cada una. 
PCR en punto final. El 
producto de PCR se 
analiza después de 25 a 
35 ciclos. 
en el punto previo a la 
saturación de la reacción, 
mediante un gel de 
electroforesis.