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Química Biológica PROTEÍNAS I. ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA PROTEICA Jefas de Trabajos Prácticos: Dra. Julieta Marino SEMINARIOS Y TRABAJOS PRÁCTICOS Clase 1. Estructura y secuenciación de proteínas. Clase 2. Seminario y TP. Determinación de la concentración de proteínas. Clase 3. Seminario y TP. SDS-PAGE. PROTEÍNAS TEÓRICOS Teórico 1. Aminoácidos, péptidos y proteínas. Niveles de organización estructural. Teórico 2. Estructura tridimensional. Plegamiento. Teórico 3. Función de las proteínas: Estructura cuaternaria. MÓDULO: PROTEÍNAS Libro Lehninger http://www.cefybuba.com.ar/quimica-biologica/ Material requerido para los trabajos prácticos Condiciones de regularidad: Cumplir con las actividades obligatorias: - Asistir al 75% de las clases (seminarios, talleres, y trabajos prácticos) - Aprobación del 75% de los informes de laboratorio APROBACIÓN de 2 regulatorios. Si desaprueban alguno, tienen dos oportunidades para recuperarlo. En el caso de desaprobar los dos, tendrán que recuperar ambos regulatorios. - Primer regulatorio: Proteínas y Cinética enzimática (seminarios y TPs) Semana 18-23/9 (antes del seminario de Ácidos nucleicos) - Segundo regulatorio será evaluado en dos instancias: Parte I: Purificación de proteínas, Hidratos de carbono y Ácidos nucleicos. Semana 30/10 al 4/11 (antes del seminario de Lípidos). Parte II: Lípidos, Metabolismo. Semana del 13-18/11 (al finalizar el taller de Metabolismo) Proteínas- Estructura y secuenciación Clasificación de aminoácidos Niveles de organización de las proteínas Características del enlace peptídico Desnaturalización. Agentes desnaturalizantes Ruptura de puentes disulfuro. Concepto de accesibilidad de grupos químicos Caracterización de la estructura proteica Métodos para determinación del peso molecular Anfotericidad de proteínas- punto isoeléctrico (pI) Procedimientos utilizados para obtener la estructura primaria de una proteína Proteómica Trabajo científico (Integración) Niveles de organización de las proteínas Uniones que estabilizan a las proteínas Uniones covalentes: - enlace peptídico - puente disulfuro Interacciones débiles: - puente hidrógeno - interacción electrostática - interacción hidrofóbica - fuerzas de van der Waals DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS Desnaturalizantes: Métodos Físicos: agitación, calor Métodos Químicos: Ácidos y Bases Solventes orgánicos Agentes caotrópicos: Urea, Cloruro de Guanidinio Detergentes urea guanidinio SDS ureaurea guanidinioguanidinio SDSSDS Desnaturalización de las proteínas DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS Desnaturalizantes: Métodos Físicos: agitación, calor Métodos Químicos: Ácidos y Bases Solventes orgánicos Agentes caotrópicos: Urea, Cloruro de Guanidinio Detergentes urea guanidinio SDS ureaurea guanidinioguanidinio SDSSDS Desnaturalizantes Métodos físicos: agitación, calor Métodos químicos: • Ácidos y bases • Sales • Solventes orgánicos DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS Desnaturalizantes: Métodos Físicos: agitación, calor Métodos Químicos: Ácidos y Bases Solventes orgánicos Agentes caotrópicos: Urea, Cloruro de Guanidinio Detergentes urea guanidinio SDS ureaurea guanidinioguanidinio SDSSDS DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS Desnaturalizantes: Métodos Físicos: agitación, calor Métodos Químicos: Ácidos y Bases Solventes orgánicos Agentes caotrópicos: Urea, Cloruro de Guanidinio Detergentes urea guanidinio SDS ureaurea guanidinioguanidinio SDSSDS • Detergentes: dodecilsulfato de sodio • Agentes caotrópicos CH2I C=O O- Iodoacético (IA) CH2I C=O NH2 Ácido perfórmico 2-Mercaptoetanol (2ME) Ditiotreitol (DTT) OXIDANTE REDUCTORES Si se reducen los puentes disulfuro, es necesario bloquearlos para evitar que se vuelvan a formar Ruptura de puentes disulfuro 4-Vinil Piridina (4VP) Iodoacetamida (IAA) BLOQUEANTES Carboximetilcisteína http://en.labs.wikimedia.org/wiki/File:Mercaptoethanol.png Caracterización de la estructura proteica Proteína nativa PURA 1. REDUCCIÓN 2. BLOQUEO 3. HIDRÓLISIS – ANÁLISIS DE AA Cys (-SH libres y S-S) accesibles 1. DESNATURALIZACIÓN 2. REDUCCIÓN 3. BLOQUEO 4. HIDRÓLISIS – ANÁL. DE AA Cys (-SH y S-S) accesibles e inaccesibles 1. OXIDACIÓN PERFÓRMICA 2. HIDRÓLISIS – ANÁL AA 1. BLOQUEO 2. HIDRÓLISIS – ANÁLISIS DE AA Cys (–SH libres) accesibles 1. DESNATURALIZACIÓN 2. BLOQUEO 3. HIDRÓLISIS – ANÁLISIS DE AA Cys (–SH libres) accesibles e inaccesibles CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR (CEM) desnaturalizante o nativa según las condiciones Determinación del PM Utilizando patrones de PM conocido se puede obtener una curva de calibración. Al evaluar la elución de la proteína de interés, se puede conocer el PM de la proteína nativa o desnaturalizada, según el buffer utilizado en la cromatografía CEM ESPECTROMETRÍA DE MASA desnaturalizante o nativa según las condiciones NÚMERO DE AMINOÁCIDOS X 110 ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN PRESENCIA DE SDS (SDS-PAGE) es desnaturalizante A. PM 60 KDa Uniones débiles S S S S Uniones covalentes B. PM 40 KDa A SDS-PAGE B A SDS-PAGE con βME B ¿Qué resultado obtendríamos si las subunidades o cadenas fueran iguales? 10 KDa 20 KDa 7,5 15 30 50 15 KDa 25 KDa 7,5 15 30 50 (KDa) (KDa) DESNATURALIZACIÓN (separación de subunidaddes) • Determinar si tiene estructura cuaternaria • Conocer el número de subunidades RUPTURA DE S-S (separación de cadenas) • Determinar el número de cadenas • Presencia de S-S DETERMINACIÓN DEL PM DE LA PROTEÍNA NATIVA Y LUEGO DE LOS TRATAMIENTOS Caracterización de la estructura proteica Para caracterizar la estructura de una proteína de 400 aminoácidos, se realizaron los siguientes ensayos: a) SDS-PAGE sin 2-mercaptoetanol: 1 banda de 22.000 Da y una banda de 11.000 Da b) SDS-PAGE con 2-mercaptoetanol: 1 banda de 11.000 Da. Según los resultados obtenidos, indique: i. Si la proteína presenta estructura cuaternaria. ii. Si posee puentes S-S intercatenarios iii. ¿Cómo evaluaría la presencia de Cys con SH libres? i. 400 aa x 110= 44.000 Da Al realizar un SDS-PAGE sin reductor se observan bandas por la presencia de subunidades unidas por uniones débiles. Son 3 subunidades, 1 de 22.000 Da y 2 de 11.000 Da ii. Al realizar un SDS-PAGE con reductor se obtiene una sola banda de 11.000 Da. Esto es porque la subunidad de 22.000 Da se separó en dos cadenas de 11.000 Da, las cuales están unidas por S-S iii. Se hace una reacción con ácido iodoacético en condiciones nativas para ver SH libres accesibles o en presencia de desnaturalizante para detectar todas las Cys con SH libres (accesibles e inaccesibles) S S 11.000 Da 11.000 Da La proteína tiene estructura cuaternaria formada por 3 subunidades: dos de 11.000 Da y una de 22.000 Da (formada por dos cadenas de 11.000 Da unidas por al menos 1 puente disulfuro). Las subunidades interaccionan entre sí por uniones débiles 11.000 Da 11.000 Da 22.000 Da Subunidad 1 Subunidad 2 Subunidad 3 Determinación del punto isoeléctrico de las proteínas q+ q- pH Anfotericidad de las proteínas pI ISOELECTROENFOQUE ¿Agrego SDS? Grupos ionizables R NH2 terminal COOH terminal 1. Una solución de anfolitos permite formar un gradiente de pH en el gel. 2. Se siembra la muestra proteica y se aplica un campo eléctrico. 3. Las proteínas presentan diferentes cargas según el pH en el que se encuentran, y en función de esto migran hacia el polo opuesto. 4. Cuando la carga neta se hace nula, las proteínas dejan de migrar = punto isoeléctrico (pI) Por ej. Si sabemos quela proteína está constituida por 2 cadenas de igual PM y contiene 4 Cys formando S-S S S S S S S S S Es posible diferenciar la distribución de Cys dentro de una proteína SO3 - SO3 - SO3 - O3 - S Resultado: A B A = 2 bandas SO3 - SO3 - O3 - S O3 - S Ácido perfórmico B = 1 banda ¿QUÉ INFORMACIÓN ADICIONAL PUEDE APORTAR EL ISOELECTROENFOQUE SI SE TRATA PREVIAMENTE UNA PROTEÍNA CON ÁCIDO PERFÓRMICO? Según los resultados experimentales que siguen, indique: a. el número de cadenas en cada proteína, el número de -SH libres y la cantidad de puentes -S-S-, señalando si los mismos son accesibles o no. b. ¿qué resultado se observaría si se hiciera una reducción con DTT en presencia de urea 6 M y posterior bloqueo con ácido iodoacético ( IAA) PROCEDIMIENTO RESULTADOS (Proteína I) RESULTADOS (Proteína II) 1) Cromatografía de exclusión molecular a) Medio no disociante b) Medio disociante PM 46.000 PM 46.000 PM 46.000 PM 23.000 2) Bloqueo con IAA Posterior análisis de aminoácidos. 2 CMCys/moléc. 2 CMCys/moléc. 3) Bloqueo con IAA en urea Posterior análisis de aminoácidos. 4 CMCys/moléc. 2 CMCys/moléc. 4) Oxidación perfórmica a) Análisis de aminoácidos b) CEM en medio disociante c) Isoelectroenfoque 10 Ác. cisteico/moléc. PM 23.000 (un pico) una sola banda 10 Ác. cisteico/moléc. PM 23.000 (un pico) una sola banda 5) Reducción con 2-ME y bloqueo con IAA a) Análisis de aminoácidos b) CEM en medio disociante 4 CMCys/moléc un pico, PM 23.000 2 CMCys/moléc un pico, PM 23.000 Proteína I 1) Cromatografía de exclusión molecular a) Medio no disociante b) Medio disociante PM 46.000 PM 46.000 El PM de la proteína no varía en las dos condiciones ensayadas. Si el método desnaturalizante no modifica el PM, esto indica que no hay interacciones débiles estabilizando subunidades. Podemos inferir que no hay estructura 4° en la proteína. 2) Bloqueo con IAA Posterior análisis de aminoácidos. 2 CMCys/moléc. El agente bloqueante en condiciones nativas da origen a 2 carboximetil cisteínas (CMCys). Este resultado demuestra que hay 2 Cys con SH libres accesibles 3) Bloqueo con IAA en urea Posterior análisis de aminoácidos. 4 CMCys/moléc. El agente bloqueante en condiciones desnaturalizantes (presencia de urea) da origen a 4 carboximetil cisteínas. Este resultado demuestra que hay 2 Cys con SH libres inaccesibles, que solo se pueden identificar en presencia de un desnaturalizante. 4) Oxidación perfórmica a) Análisis de aminoácidos b) CEM en medio disociante c) Isoelectroenfoque 10 Ác. cisteico/moléc. PM 23.000 (un pico) una sola banda a. El tratamiento con ácido perfórmico oxida todas las Cys (libre y las que forman S-S, accesibles e inaccesibles). Al detectar 10 ácidos cisteicos luego del análisis de aa, podemos inferir que la cantidad total de Cys de esta proteína es 10. b. La cromatografía de exclusión molecular, luego de la oxidación perfórmica permite identificar un pico de 23.000 Da. Esto nos demuestra que la proteína está formada por 2 cadenas y que deben estar unidad por al menos 1 S-S. c. El isoelectroenfoque separa a las cadenas que se obtuvieron por la oxidación perfórmica por su pI. Dentro de los aa que pueden aportar cargas están las Cys oxidadas. Como no tenemos información de otros aa, nos podemos centrar en las Cys. Dado que se obtuvo una única banda, podemos decir que el pI de cada cadena es el mismo, y por lo tanto la cantidad de Cys también. Serían 5 Cys en cada cadena. Hay 4 Cys con SH libre, 2 accesibles y 2 inaccesibles 5) Reducción con 2-ME y bloqueo con IAA a) Análisis de aminoácidos b) CEM en medio disociante 4 CMCys/moléc PM 23.000, un pico a. El agente reductor (2-mercaptoetanol) en condiciones nativas (ya que no aclara que esté presente un desnaturalizante) y luego el bloqueo dan origen a 4 carboximetil cisteínas. Este resultado da cuenta de los S-S accesibles que tiene la proteína. Sin embargo, al usar un bloqueante, hay que considerar a las Cys con SH accesibles que también pueden ser modificadas. Entonces de las 4 CMCys, ya sabíamos que 2 tenían SH libres, por lo tanto hay otras 2 Cys formando 1 S-S accesible. b. Como se hace una cromatografía de exclusión molecular luego de la reducción y bloqueo y se separaron las 2 cadenas dando origen a 1 pico de 23.000 Da, se deduce que el único puente intercatenario es accesible. Si hubiera otro S-S tendría que ser inaccesible y no se hubieran separado las cadenas. S S S S SH SH Accesible Inaccesible S S S S SH SH Inaccesible Accesible Accesible Inaccesible Inaccesible PROCEDIMIENTO RESULTADOS (Proteína II) 1) Cromatografía de exclusión molecular a) Medio no disociante b) Medio disociante PM 46.000 PM 23.000 2) Bloqueo con IAA Posterior análisis de aminoácidos. 2 CMCys/moléc. 3) Bloqueo con IAA en urea Posterior análisis de aminoácidos. 2 CMCys/moléc. 4) Oxidación perfórmica a) Análisis de aminoácidos b) CEM en medio disociante c) Isoelectroenfoque 10 Ác. cisteico/moléc. PM 23.000 (un pico) una sola banda 5) Reducción con 2-ME y bloqueo con IAA a) Análisis de aminoácidos b) CEM en medio disociante 2 CMCys/moléc un pico, PM 23.000 Responder si la proteína tiene Estructura terciaria: Estructura cuaternaria: S-S intercatenarios: S-S intracatenarios: SH libres accesibles: SH libres inaccesibles: Con una solución de una proteína (concentración 3 mg/mL) se realizan los siguientes procedimientos experimentales: 1 mol -SH ----- 1 mol CMCys CMCys/molécula, es necesario expresar los moles de CMCys/ mol de proteína. PROCEDIMIENTO RESULTADOS 1)Cromatografía de exclusión molecular (CME) en condiciones disociantes y no disociantes 1 pico PM 37.000 2) Proteína + IAA/ urea. Análisis de aminoácidos 0 CMCys/molécula 3) 2,5 mL de solución proteica + β-ME/urea. Luego se agrega IAA 0,81 moles CMCys 4) Proteína SDS-PAGE + 2-ME 2 bandas: PM 10.000 y PM 27.000 5) 2 ml de sol. de prot. + DTT + IAA. Análisis de aminoácidos CME 6) Oxidación perfórmica e isoelectroenfoque 0,324 moles de CMCys 1 pico de 37.000 2 bandas Calcule: a) Número de grupos -SH accesibles e inaccesibles / molécula de proteína. b) Número de puentes -S-S- accesibles e inaccesibles, inter y/o intracatenarios por molécula de proteína. c) Realice un esquema de la probable estructura de la proteína estudiada, indicando si la proteína tiene estructura cuaternaria y la cantidad de cadenas. Estrategia para secuenciar una proteína Secuenciación de proteínas Determinar cuántas subunidades polipeptídicas componen la proteína; si hay más de una, separarlas (desnaturalización) Romper los puentes –S-S- y bloquear los grupos –SH. Separar las cadenas Determinar la composición en aminoácidos de cada cadena / subunidad Determinar los residuos amino y carboxilo terminal de cada cadena/subunidad Proteína de interés pura (clase Purificación) Determinar de la secuencia de aminoácidos. Para cadenas polipeptídicas de más de 20- 50 aminoácidos (dependiendo de la eficiencia del secuenciador) es necesario hacer cortes por proteólisis específicas, separación de péptidos, reacción de Edman o EM tandem, ordenamiento de los fragmentos y superposición Localizar los puentes disulfuro Determinar la composición en aminoácidos de cada cadena polipeptídica Para conocer la composición en aminoácidos de una proteína es necesario romper sus enlaces peptídicos HCl 6N, 110°C, 24h Composición en aminoácidos Análisis cromatográfico de aminoácidos Composición en aminoácidos Asn Asp + NH4 + Gln Glu + NH4+Trp Determinación del residuo amino terminal DNFB: dinitrofluorbenceno Reactivo de Sanger PITC: fenilisotiocianato Reactivo de Edman Permite identificar el número de cadenas diferentes en una proteína Carboxipeptidasa (Exopeptidasa, ruptura en el grupo amino del aa C- terminal) Determinación del residuo carboxilo terminal Degradación de Edman La automatización de este proceso se conoce como degradación secuencial de Edman, se utiliza para establecer la secuencia de aminoácidos en una proteína marcación liberación marcación liberación 1° vuelta 2° vuelta Con los secuenciadores automáticos se pueden secuenciar hasta 50 aminoácidos. Secuencias más largas no se pueden obtener debido a que la eficiencia de cada ciclo es menor al 100% Determinar la secuencia Ruptura proteolítica de la cadena peptídica Determinar la secuencia ¿Cómo se podrán ordenar los péptidos resultantes de la proteólisis? Ordenamiento de los fragmentos y superposición Solapamiento de péptidos Ejemplo Esquema de secuenciación Esquema de secuenciación Establecer la secuencia Microsecuenciación por Espectrometría de Masa (EM en tandem) Péptido El espectro de los iones generados es interpretado por programas. La diferencia de masas entre dos iones corresponde al aminoácido que falta en uno de ellos, y así se puede ir determinando la secuencia de aminoácidos de un péptido. COO- COO- COO- COO- +H3N COO-+H3N COO- +H3N +H3N +H3N +H3N Muestra + protesa La diferencia de masas moleculares entre dos iones corresponde al aminoácido que falta en el de menor masa. Así se puede ir determinando la secuencia de aminoácidos de un péptido. 1056-942= PM Asn -18= 114 Pérdida de una molécula de agua por cada enlace peptídico La MS/MS en tandem no reemplaza a los secuenciadores automáticos, que no es posible diferenciar la presencia de Leu e Ile en un péptido Asignación de puentes disulfuro Sólo los –SH libres aparecen alquilados - Alquilación - Hidrólisis - Reducción - Alquilación - Hidrólisis Aparecen alquilados los – SH libres y los S-S Proteína desnaturalizada con enlaces S-S intactos Digestión proteolítica Separación de los fragmentos resultantes A cada fragmento Insulina Frederick Sanger, en 1953 detereminó la primer secuencia de una proteína (insulina). Ejemplo. Obtención de la secuencia completa de una proteína Iodoacetamida La ananaína es una proteasa, y por eso primero fue necesario inactivarla para que no clivara a las proteínas (otras proteasas) que se usarían luego para fragmentarla y poder obtener la secuencia. Por ser una Cys proteasa, tiene una Cys en su sitio activo. La primer estrategia que usaron para inhibir su acción fue usar un agente alquilante, como la iodoacetamida. Esto no la inactivó por completo, por lo que usaron un agente químico (que no era susceptible a la acción proteolítica de la ananaína) para obtener los primeros fragmentos. Una vez inactiva, siguieron usando otras estrategias de clivaje, como la digestión con tripsina, LysC y BNPS (que cliva en residuos de Trp). La secuencia de aa de los péptidos obtenidos en cada caso se analizó a partir de los feniltiohidantoin-péptidos (Degradación de Edman) en un secuenciador automático. Luego, se realizaron los solapamientos de las secuencias obtenidas para obtener el orden de los péptidos. El PM obtenido por EM fue 23478 Da, mientras que el PM teórico, considerando el PM de cada aa de la secuencia propuesta fue 23464 Da. Si hiciéramos el n° de aa x 110, daría 23760 Da (muy cercano!). Resumen Buena correlación entre las masas teóricas de péptidos (secuencia propuesta) y las masas observadas Confirman la secuencia masa Ananaína experimental 23.478 Da masa Ananaína teórica 23.464 Da Una vez obtenida la secuencia probable, se analizó el PM de los fragmentos peptídicos de la digestión con Lys-C por EM. La gran correlación que encontraron entre los PM teóricos (resultantes de la estructura propuesta) y el PM experimental permitió confirmar la secuencia. PEPTIDE MASS FINGERPRINTING Es el PM obtenido por EM de cada uno de los péptidos obtenidos por digestión enzimática (es la huella peptídica de cada proteína) Por último, pero igual de importante, es que la comparación con otra Cys proteasa (bromelaína), que ya había sido caracterizada previamente, demostró que pequeños cambios en la secuencia (como una inserción entre la región 170 y 174, y la presencia de residuos hidrofóbicos cerca de la His157) hacían que la ananaína presentara distinta especificidad por sustratos y susceptibilidad a inhibidores con respecto a la bromelaína. SECUENCIA PLEGAMIENTO FUNCIÓN Esto pone en evidencia el hecho de que la secuencia determina el plegamiento y la función específica de cada proteína.
