T11 y T12_ TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LAS CÉLULAS REESCUCHAR Y VER DIAPOS_

Vista previa del material en texto

TÉCNICAS PARA EL ESTUDIO DE LAS CÉLULAS (MUESTRAS BIOLÓGICAS)
AISLAMIENTO Y CULTIVO DE CÉLULAS: 
Sistema libre de células: Estudió una función de las células sin tener las células. Ej: Mitocondrias en un tubo de ensayo. 
Conceptos básicos: 
· Sistemas biológicos de estudio: Muestras o un paciente in vivo (hay vida) o in vitro (algo muerto). No son iguales, en in vitro no tengo el entorno (células vecina) pero me va a dar una aproximación de lo que está sucediendo, para in vitro necesito tecnicas de cultivo celular. 
· Cultivo primario: Tipo celular aislado mantenido en condiciones de cultivo. 
· La senescencia replicativa es un fenómeno que se observa tanto in vivo como in vitro y es cuando la célula deja de dividirse y permanece en G0 o G1 y no responde a factores mitógenos permaneciendo viva. Se inicia cuando la célula alcanza el límite de Hayflick: cantidad de veces que una célula puede dividirse antes de entrar en senescencia replicativa. Cuando sale del límite de Hayflick ya no se divide. 
· Sin nutrientes las células se mueren 
· Línea celular: transformación espontánea NO oncogénica
· Ciclo celular: Para que la célula lo atraviese necesitamos factores de crecimiento 
· suero=/= cultivo celular
TÉCNICAS DE CULTIVO CELULAR: Conjunto de técnicas que permiten el crecimiento y el mantenimiento de las células fuera de un organismo, "in vitro”, preservando sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. 
ANÁLISIS Y MANIPULACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: 
· Para diagnóstico de enfermedades
· Para antígenos y vacunas
· Para hacer proteínas recombinantes y biofármacos
· Desarrollo de terapia génica (todavía no es efectiva)
· Para utilizar al DNA como un sistema de almacenamiento de información (como en una computadora)
DNA repaso: 
-Complementariedad de bases Watson y Crick
- Estructura de los Ácidos nucleicos
- Desnaturalización
Cuando se quiere estudiar alguna molécula de la célula puedo querer estudiar el DNA o los productos de expresión (que se transcribió), como puede ser un RNA o una proteína.
Técnicas para estudiar el DNA: 
· aislamiento 
· corte (+ unión) 
· separación
· Identificación de fragmentos 
· Clonación
Aplicaciones:
· Secuencias de Genoma
· Transcriptoma 
· Actividad de genes 
· DIagnóstico 
· Medicina forense
· Producción de proteínas 
· Función de genes 
· puedo cortar parte del adn y evitar que se exprese un gen. 
CORTE: Hidrolizar las uniones para qué la molécula se transforme con una más pequeñas. Esto se hace con enzimas de restricción (restringen ingreso de un patógeno), son de origen bacteriano, degradan al adn foráneo y pueden agregar un metilo al adn lo cual evita que se degrade, son endonucleasas,cortan las secuencias palio
indronica qué son las que se leen igual en ambas heras (son simétricas). Pueden cortar a la hebra de forma recta y generar extremos romos o cortar entre adeninas y guaninas y generar extremos escalonados (sticky ends) 
CORTE + UNIÓN: Sí los fragmentos de dna fueron recortados por la misma enzima de restricción se reconocen y su unen por medio de una unión covalente, esto lo hace la enzima ligasa (normalmente la DNA T4 ligasa). El ADN resultante tiene una mezcla de dos DNA de diferente origen, eso se denomina DNA recombinante. (in vitro) 
SEPARACIÓN: utilizó una electroforesis en gel 
IDENTIFICACIÓN DE FRAGMENTOS: me permite ver secuencias de genes
Los cromosomas no tiene forma de X
Cariotipo: clasificación de los cromosomas según forma y tamaño
FISH: fluorescence in situ hybridization
Micromatrices: en cada cuadrícula hay muchos dna insertado, Luego voy a hacer probes para cada gen qué quiero estudiar. Se coloca un fluorocromo, sí se adhiere al adn uno puede ver qué gen tenes en cada cuadrícula, ósea cual gen tenes alterado. 
Secuenciar: decir la secuencia de las bases en una estructura de adn. uno de estos métodos es el método de Sanger. En la actualidad se utiliza ilumina (plataforma de secuenciación que permite procesar adn en gran cantidad) 
el método de sanger se basa en utilizar un azúcar (ribosa) a la que le faltan los dos oxhidrilos (desoxirribosa), utilizó distintos tubos con las distintas bases, la cadena lo va a incorporar pero la síntesis va a quedar truncada ya que la ribosa no tiene el OH para qué la siguiente base se una. Cuando terminó el proceso de síntesis veo qué fragmento estaba al frente de todo y por lo tanto cuál era el orden de bases.
Hoy en día se secuencia el ADN de manera electrónica. 
Video de facebook de la cátedra.DIVISIÓN DE CÉLULAS EN UN CULTIVO
T12
Para averiguar qué hace un gen, se lo muta o anula para ver qué sucede. En general lo que se hace es reemplazarlo por una secuencia que codifique alguna enzima que degrade antibióticos, como el Amp del plásmido. ¿Cómo se reemplaza? Mediante primers, que tienen el gen. Es una secuencia más larga, que va a coincidir con los extremos del gen que quiero sacar: se van a homologar con el locus de la secuencia que quiero reemplazar. Luego por recombinación homóloga en la célula se saca ese gen y entra el otro. El cebador va a hibridar en cada ciclo. Así obtengo finalmente muchas construcciones interruptoras, las cuales reemplazan al gen que yo NO quería que aparezca.
Esa secuencia interruptora la coloca en un vector, que entra a la célula por transfección. Así los extremos van a homologarse y por recombinación homologa se va a localizar en el lugar del genoma que yo quería. Cuando la célula llega a meiosis, las células que tengan el fenotipo mutante reciben el alelo mutado y las células con fenotipo salvaje o silvestre el gen normal; así se puede ver que impacto tiene en la célula
¿Pero qué impacto tiene en el animal completo? Eso no se puede estudiar específicamente en un cultivo celular; así surgen los animales transgénicos. Los animales knock out no tienen o fue anulado el gen en particular que quiero estudiar. Luego con ese animal puedo estudiar cómo afecta ese gen. Para crear estos animales knock out, el vector se coloca en células madres embrionarias. El gen neo codifica para la neomicina, degrada antibiótico. También esta el tk HSV: hace pasar el ganciclovir al ganciclovir fosfato. Es un análogo de base (muy parecido, pero no lo es) del ADN. Se va a meter donde la DNA Polimerasa debería tomar el nucleótido, pero esto se une con mas afinidad. Así se va a inhibir la DNA polimerasa, no se duplica el DNA y las células van a morir. 
Por recombinación homologa, sólo va a entrar al fragmento el gen que yo quiero, NO el tk HSV. (Esto es una estrategia experimental). También puede meterse en el genoma de manera no homologa, no necesariamente reemplazando al gen, sino agregándose. Si ocurre una recombinación no homologa, se expresa la tk HSV generando que el ganciclovir fosfato inhiba la DNA polimerasa y mueren estas células. Si ocurre una recombinación homologa, las células están a salvo y degradan neomicina. Cuando las coloque en medio de cultivo con neomicina, van a sobrevivir mis células y si agrego un medio de cultivo con ganciclovir, éste no se va a convertir en ganciclovir fosfato. 
En una placa de cultivo, entonces, sólo sobreviven las células que incorporaron a la construcción interruptora. Son células madre embrionarias de ratón, puedo introducirlas en el blastocisto de un ratón embarazado. Las células mutadas no son la totalidad. La primera generación de ratones no va a estar totalmente mutado, sólo cierta parte. Se llama mosaicos a los seres vivos que tienen células con diferentes genomas. Pseudo preñado significa que se le dan hormonas para hacer creer al ratón fisiológicamente que está embarazado, ya que el útero tiene que estar listo para recibir el embrión. Para obtener finalmente al ratón knock out, tengo que cruzar (endocría) a los ratones mosaico, hasta que con un análisis yo tengo un fenotipo - - (ósea con ambos alelos mutados). 
La leptina es una hormona que regula la saciedad: si se muta, el ratón nunca deja de comer y engorda. No se sabía cual era su función 
En otro caso; voy a agregarle al ratón un gen queno está en su genoma, sin anular nada. Ese gen mutado será dominante, es decir que siempre se va a expresar. Esto NO lo inyecto en el blastocisto, sino directamente en los pronúcleos de un huevo fertilizado. En uno de esos pronúcleos se inyecta la construcción, ocurre in vitro. Se pone en el útero de una madre sustituta preparada hormonalmente. El gen tiene que tener un promotor para expresarse, no puedo usar el de la célula porque es una recombinación no homóloga. Ademas ese promotor es regulable: yo puedo administrarle a la rata alguna medicación que va a hacer que se vuelva activo o no. Entonces el gen se expresa cuando yo quiero. Si ese gen genera la muerte del animal, nunca nacerían las ratas y no puedo hacer estudios. Entonces dejo que nazca, hago lo estudios para ver si fue incluido el gen y agrego el regulador para que se expresa. Eficacia del 30%, esa es la cantidad que incluye el gen, el resto no. Por eso luego se hace endocría para tener una progenie completa de ratas mutadas.
GEF es un factor intercambiador de factores de guanina. Va a favorecer que la proteína que intercambia GTP por GDP. Si yo quiero estudiar la GEF, sin saber su función, o si quiero estudiar cómo es responsable de que se produzcan x enfermedades, puedo aplicar una construcción a la célula y que cuando se exprese sea una proteína que se una al GEF y la inhiba. Esta es una manera de ver qué ocurre cuando un gen no se exprese (por inhibición).
Degradación del mRNA. Nuestro genoma expresa micro RNA. Es codificado por un gen, que no codifica a proteínas. Luego de su maduración, se hibrida sobre sí mismo. Por medio de una enzima Dicer, se cortan los extremos del RNA. Cada una de las secuencias son complementarias de algún RNA mensajero en el citoplasma. Se produce en el citoplasma una enzima, el complejo silenciador inducido por RNA; va a separar las hebras. Una de las hebras va a hibridar perfectamente con una RNA mensajero en el citoplasma, y cuando esto ocurre es degradado completamente. Entonces el gen se silencia porque se noqueó su RNA mensajero. Estos RNA que yo generé son RNA de interferencia. Hoy se generan para el tratamiento de enfermedades.