ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS

Vista previa del material en texto

Físico Química de Biomoléculas Licenciatura en Biotecnología 
1 
 
PRACTICA 4 
 
 
ELECTROFORESIS EN PAPEL DE AMINOACIDOS 
 
1.- OBJETIVO: 
 
El objetivo fundamental de la practica es la comprobación de la migración 
electroforética de los aminoácidos sometidos a un campo eléctrico en función de su 
carga y PI 
 
2.- FUNDAMENTO: 
 
a) PUNTO ISOELECTRICO 
 
Los aminoácidos son moléculas que poseen, al menos, dos grupos ionizables, un 
amino y un carboxilo. A un pH adecuado (pH 7,4) toman la forma de ion dipolar. Para 
el aminoácido más sencillo, la glicina (Gly), la estructura ion dipolar se le denomina 
glicina isoeléctrica, por tener igual número de cargas positivas y negativas: 
 
 
 
 
En medio ácido, la forma dipolar puede aceptar un protón (H+) en el grupo 
carboxilato (- COO-), y también puede en medio alcalino, perder un protón (H+) del 
grupo (- NH3+). 
 
Al pasar de pH muy ácido a pH muy alcalino, la evolución de las cargas en la 
representación de Bronsted del aminoácido glicina, sería: 
 
Físico Química de Biomoléculas Licenciatura en Biotecnología 
2 
 
 
El aminoácido glicina es un ácido diprótico, que se caracteriza por tener dos constantes 
de ionización y por consiguiente dos pKs: 
 * El primero (pK1) corresponde a la disociación del grupo carboxilo (- COOH). 
* El segundo (pK2) corresponde a la disociación del grupo amino (-NH3+). 
 
Entre estos dos pK se sitúa el punto de equivalencia de las dos disociaciones iónicas: se 
conoce como punto isoeléctrico (pHi), para el cual las cargas (+) y (-) se encuentran en 
equilibrio. A este pHi, la movilidad del aminoácido es nula cuando se encuentra situado 
en un campo eléctrico. 
 
 
 
 
Físico Química de Biomoléculas Licenciatura en Biotecnología 
3 
 
 
Para la glicina: 
 
 
 
 pH < pI pH=pI pH > pI 
⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅ 
 R-CH-COOH R-CH-COO- R-CH-COO- 
 
 NH3+ NH3+ NH2 
⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅ 
carga neta: 
 
 +1 0 -1 
 
 
Para un aminoácido básico, serían: 
 
pH << pI pH < pI pH = pI pH > pI 
⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅ 
 
NH3+ NH3+ NH3+ NH2 
| | | | 
R-CH-COOH R-CH-COO- R-CH-COO- R-CH-COO- 
 | | | | 
 NH3+ NH3+ NH2 NH2 
⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅⋅ 
carga neta: 
 
+2 +1 0 -1 
 
 
b) Electroforesis 
 
Por electroforesis se entiende el método basado en el movimiento de iones o 
moléculas cargadas por acción de un campo eléctrico. En la Bioquímica y Biología 
Molecular sirve para la separación e identificación de biomoléculas. La electroforesis se 
aplica en el campo de la Bioquímica a la separación de compuestos que poseen grupos 
ionizables (aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos) teniendo en cuenta que la 
carga neta de estas sustancias depende del pH del medio en que se encuentren. 
 
Físico Química de Biomoléculas Licenciatura en Biotecnología 
4 
Una partícula cargada en un campo eléctrico intenso esta sometida a dos fuerzas 
importantes, la fuerza eléctrica proporcional a la carga y al campo eléctrico, y una 
fuerza hidrodinámica de frenado debido a la viscosidad del medio, obtenida mediante la 
ley de Stokes. En cambio, se puede despreciar en este análisis otra fuerza debida a la 
agitación térmica llamada fuerza browniana y que causa la difusión de las partículas. 
ezEFel = , 
donde e es la carga elemental, z la carga iónica, y E el campo eléctrico igual a 
�V/d, con �V la diferencia de potencial aplicada y d la distancia entre electrodos. 
avFStokes πη6= , 
donde � es la viscosidad del medio, a el radio de la partícula supuesta esférica y v 
su velocidad. 
La fuerza de Stokes es proporcional a la velocidad, por lo que al someter la 
partícula al campo eléctrico, ésta acelera en un lapso de tiempo muy breve hasta que las 
dos fuerzas queden iguales, la partícula ha alcanzado la velocidad límite. Equiparando 
las dos fuerzas se obtiene la expresión para la velocidad límite: 
uEE
a
ez
v ==
πη6
, 
donde se ha introducido u, la mobilidad electroforética. La velocidad de migración 
de la partícula es proporcional al campo eléctrico aplicado y a la mobilidad 
electroforética: 
a
ez
u
πη6
= 
De esta última fórmula, se deduce que la mobilidad electroforética es proporcional 
a la carga de la molécula, pero es inversamente proporcional a su tamaño (a) y a la 
viscosidad de la solución (�). 
 
Entre los distintos métodos de electroforesis que se utilizan, cabe destacar: 
 
· La electroforesis de zona, que se realiza en distintos soportes, tales como papel, 
acetato de celulosa, almidón, agar, poliacrilamida, etc., a bajos (6 V/cm) o altos 
campos eléctricos (20 V/cm), y en presencia o ausencia de agentes 
desnaturalizantes. 
 
Físico Química de Biomoléculas Licenciatura en Biotecnología 
5 
· La inmuno-electroforesis, que combina la electroforesis en agar con la reacción 
de precipitación específica antígeno-anticuerpo. 
 
· La electrofocalización o electroenfoque, que separa en base al punto 
isoeléctrico de la biomolécula. Se emplea fundamentalmente para proteínas. 
 
La electroforesis que se va a realizar en la práctica es la zonal en papel de 
celulosa. Se va a aplicar a la separación de los aminoácidos glicina (Gly), leu (Leu), 
ácido aspártico (Asp) y lisina (Lys). 
 
En el transporte electroforético, a la fuerza del campo se opone la resistencia viscosa 
del medio, produciéndose cuando se igualan una velocidad constante de desplazamiento de 
las partículas. 
La fuerza iónica de la solución tampón tiene una importancia fundamental en la 
electroforesis, puesto que cuando es baja, permite velocidades de migración de los solutos 
más rápidas y con menor desprendimiento de calor. 
 
La fuerza impulsora de la separación es el campo eléctrico. La fuerza retardadora 
es la interacción del soporte con las moléculas cargadas a separar. A igualdad de campo 
eléctrico, tamaño de las moléculas y viscosidad de la solución, el único parámetro que 
afecta a la separación es la carga, dependiente a su vez del pH del medio. La celulosa 
del papel hace de soporte para la emigración de los iones y del medio conductor de la 
corriente entre los electrodos, a través de una solución tampón de pH. 
Los aminoácidos al situarlos en el medio tamponado de pH característico, 
adquirirán una determinada carga de acuerdo con la naturaleza ionizable de sus grupos 
funcionales. 
Por tanto, la separación de una mezcla de aminoácidos por electroforesis consistirá 
en la emigración de los aminoácidos cargados positivamente hacia el electrodo 
denominado cátodo (polo negativo), o al electrodo opuesto llamado ánodo (polo 
positivo) si están cargados negativamente, o no se desplazarán si la carga neta del 
aminoácido es nula. 
 
Puesto que el tampón de electroforesis que se va a utilizar en la práctica está 
constituido por piridina/ácido acético glacial/agua de pH = 6,1, se puede predecir la 
Físico Química de Biomoléculas Licenciatura en Biotecnología 
6 
carga que tendrá cada uno de los aminoácidos a dicho pH y si el aminoácido, por tanto, 
emigrará al cátodo, al ánodo o permanecerá en el origen o punto de aplicación de la 
muestra. 
 
 Como el parámetro que define la carga de una molécula de aminoácido es el 
punto isoeléctrico (pI), si se conocen o calculanlos valores de pI para cada aminoácido 
que se va a ensayar, la carga que mostrarán al pH de la experimentación y la emigración 
que sufrirán por acción del campo eléctrico, es fácil determinarlas para cada uno de los 
aminoácidos. 
 
Aminoácido Gly Leu Asp Lys 
pI 5,97 5,98 2,77 9,74 
Carga a 
pH=6,1 
0 0 (-) (+) 
Emigración Origen Origen Ánodo Cátodo 
Predicción del comportamiento electroforético de los aminoácidos 
 
 
 En resumen, puede decirse que cuando una molécula cargada se coloca en un 
campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su carga 
eléctrica, 2) su tamaño, 3) la intensidad del campo eléctrico y 4) la temperatura del medio. 
Si la molécula tiene carga positiva migrará hacia el cátodo; si tiene carga negativa, 
hacia el ánodo. 
 
Por tanto, a la vista de la tabla, se puede decir que al pH de 6,1 al que se realiza la 
electroforesis, los aminoácidos neutros se quedarán en el origen, los aminoácidos ácidos 
emigrarán al ánodo y los aminoácidos básicos emigrarán al cátodo. 
 
 
3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 
 
 
3.1.- MATERIALES Y REACTIVOS 
 
Físico Química de Biomoléculas Licenciatura en Biotecnología 
7 
- Aminoácidos al 1% 
o glicina 
o leucina 
o ácido aspártico 
o lisina 
- papel whatman nº 1 
- pinzas de madera 
- micropipeta 
- pulverizador 
- secador 
- solución de nihidrina (1mg/ml en acetona) 
- Tampón piridina: tampón pH 6,1, (40 ml piridina, 3,2 ml ácido acético 
glacial y agua hasta 1L) 
- tijeras 
- guantes 
- fuente de electroforesis 
- cubeta para electroforesis en papel 
- cubeta de revelado 
 
 
3.2.- DESARROLLO EXPERIMENTAL 
 
El dispositivo experimental necesario para realizar una electroforesis zonal en 
papel consiste en: 
 
- Una fuente de alimentación que suministre un potencial constante (300 V). 
- Una cubeta de electroforesis en papel de celulosa. La cubeta posee dos 
compartimentos separados, cada uno de los cuales contiene un electrodo de 
platino, que deben conectarse a la fuente de alimentación mediante los cables 
con conectores adecuados, uno para el electrodo que hace de cátodo y otro para 
el que hace de ánodo. 
 
Las principales precauciones que hay que tener son: 
 
Físico Química de Biomoléculas Licenciatura en Biotecnología 
8 
- El papel de celulosa hay que procurar no tocarlo con los dedos. El papel 
hay que manejarlo con las pinzas de madera. 
- No contaminar las soluciones de los aminoácidos patrón y de la muestra 
problema. 
- Desde el momento en que se conecte la fuente de corriente a la cubeta de 
electroforesis, hasta que termine la misma, no se deben de tocar los cables, 
conexiones o disolución que esté en contacto con la corriente. 
 
a.- Aplicación de las muestras. 
 
- Se traza con el lápiz una línea muy débil en el centro del papel. En la línea se 
señalan débilmente cinco puntos distribuidos equitativamente a lo ancho de la 
placa. 
- Al mismo tiempo se señala en el margen superior derecho de la tira de papel el 
signo (+), para indicar el extremo del papel que se va a situar en el 
compartimento de la cubeta que va a actuar como ánodo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Tira papel whatman nº 1 
 
 
b.- Electroforesis de las muestras. 
 
A1 
A2 
A4 
problema 
A3 
Físico Química de Biomoléculas Licenciatura en Biotecnología 
9 
Una vez aplicadas las muestras, se rocía ligeramente el papel con la solución 
tampón de electroforesis mediante el pulverizador, procurando no mojar directamente 
las muestras. 
Se quita la tapadera de la cubeta, se coge el papel con las pinzas y se coloca sobre 
la cubeta. Se introducen cada uno de los extremos del papel en los compartimentos de la 
cubeta, procurando que el extremo señalado en el papel con (+) sea el compartimento 
del ánodo 
Si los extremos no quedan bien sumergidos en la solución tampón de 
electroforesis, se llenan los compartimentos con más tampón. 
 
Antes de comenzar la electroforesis, hay que asegurarse que el papel está bien 
humedecido. 
Se coloca la tapadera en la cubeta, se conecta la fuente de alimentación a la red de 
alimentación y se enciende la misma. Con el mando del voltaje se ajusta el potencial a 
unos 300 V. 
 
 
Al cabo de media hora se apaga la fuente, se desconecta de la red, se quita la 
tapadera, se saca el papel de la cubeta mediante las pinzas, procurando no romperlo y se 
coloca encima del papel de filtro de la mesa del laboratorio 
 
 
c.- Secado y detección de los aminoácidos. 
 
- Se airea el papel para que se seque 
- Con las pinzas de madera se sumerge en la cubeta que contiene la solución de 
ninhidrina. Nada más que se impregne, se saca de la solución, dejando que 
escurra el exceso de la misma. 
- Se espera hasta que se produce la reacción de color 
- La detección de los aminoácidos patrón y de la muestra problema se realiza por 
la aparición de las manchas de color púrpura. 
 
La reacción que se produce entre los aminoácidos y la nihidrina es la siguiente: 
 
Físico Química de Biomoléculas Licenciatura en Biotecnología 
10 
 
 
 
 
 
 
d.- Identificación electroforética de los aminoácidos de la muestra 
problema. 
 
Los aminoácidos contenidos en la muestra problema se identifican 
mediante la comparación de los desplazamientos de las manchas con los 
correspondientes a los de los aminoácidos patrones 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A1 
A2 
A4 
problema 
A3 
a 
b 
Catodo (-) Anodo (+) 
Físico Química de Biomoléculas Licenciatura en Biotecnología 
11 
 
 
4.- BIBLIOGRAFÍA 
- Modern experimental biochemistry. Rodney Boyer : Boyer, Rodney F 
- Bioanalytical chemistry. Susan R. Mikkelsen, Eduardo Cortón. 
 
5.- CUESTIONES 
 
1. Señala de que factores depende el movimiento de los aminoácidos en la 
electroforesis en papel. 
2. ¿Qué aminoácidos están presentes en la muestra problema? 
3. Si el pH del tampón fuera 2 ¿cual sería el resultado de la electroforesis? 
4. ¿Se podría identificar mediante esta técnica una mezcla de los aminoácidos 
valina y triptofano utilizando las condiciones de la práctica?