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Universidad Autónoma de Madrid 
Facultad de Medicina 
Departamento de Bioquímica 
 
 
 
 
Papel del sistema del glutatión en 
la adaptación y resistencia de los 
tumores linfoides al estrés oxidativo 
 
 
 
Tesis Doctoral 
Omar Kourani Méndez 
Madrid, 2019 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA 
FACULTAD DE MEDICINA 
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE MADRID 
 
 
 
TESIS DOCTORAL 
Papel del sistema del glutatión en la adaptación y resistencia de 
los tumores linfoides al estrés oxidativo 
 
Memoria de Tesis Doctoral presentada por 
Omar Kourani Méndez 
Licenciado en Bioquímica y Biología 
Para optar al grado de Doctor por la Universidad Autónoma de Madrid 
Director de Tesis 
Miguel R. Campanero García 
 
 
Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols 
CSIC-UAM 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Esta tesis doctoral se ha desarrollado bajo la dirección del Dr. Miguel R. Campanero García 
en el Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”, centro mixto CSIC-UAM y ha 
sido financiada por el Ministerio de Economía y Competitividad y posteriormente por el 
Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades mediante un contrato predoctoral para la 
formación de doctores; así como por la Comunidad de Madrid mediante un contrato para 
personal investigador de apoyo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A mis padres 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agradecimientos 
 
En primer lugar me gustaría agradecer a mi director de tesis, Miguel Campanero, por 
haberme dado la oportunidad de realizar este trabajo en su laboratorio. Por su ayuda, guía y 
consejo y por la confianza depositada en mí a lo largo de estos años. 
A mis compis de labo por toda su ayuda y por los buenos momentos que hemos pasado 
juntos. Especialmente a Alberto y Patri, agradeceros toda la ayuda que me habéis dado 
durante estos dos últimos años y por el buen ambiente que hemos tenido en el labo. Un 
agradecimiento especial para Yuri, que tan bien me recibió cuando llegue al laboratorio. No 
me olvido de todos los estudiantes que han pasado por el labo y de los que tanto he 
aprendido. En especial quiero mencionar a Henar y a Gonzalo por su ayuda durante la 
realización de este proyecto y por supuesto a Manuela, con la que he compartido muchas 
risas, confidencias y algún batido de chocolate. 
A Teresa Iglesias por toda la ayuda, consejos y ánimo que me ha dado durante estos años. A 
todos los miembros actuales y pasados de su laboratorio, con los que tantos momentos de 
risas hemos compartido: Julia, Lucia, Ana, Álvaro, Ana Simón, Marina, Andrea y todos los 
estudiantes que han pasado por allí… (Incluida la estudiante fantasma de la cámara de 
seguridad…). 
A todos los jefes de laboratorio y sus equipos que en mayor o menor medida me han echado 
una mano cuando lo he necesitado, ya sea con consejos, dejándome usar algún equipo o 
material o simplemente interesándose por mi progreso. En particular me gustaría 
agradecérselo a Ricardo Sánchez, Alberto Muñoz, María Jesús Larriba, Gema Domínguez, 
Benilde Jiménez, Luis del peso y Miguel Quintanilla. Por supuesto también a mis tutores 
Jaime Renart e Isabel Sánchez por las firmas y validaciones de última hora. 
Al personal de recepción por su sonrisa, simpatía y amabilidad. A todo el personal de los 
diferentes servicios (administración, cultivos, medio de cultivo, imagen, genómica, 
animalario…), sin los cuales el trabajo diario sería prácticamente imposible, además de 
aburrido. En particular tengo muchísimo que agradecer, no solo por toda la ayuda que me 
han prestado en sus respectivas áreas, sino también por su simpatía y amabilidad durante 
todos estos años a Leti, nuestra técnico de animalario, y a Laura, responsable del servicio de 
citometría de flujo de la Facultad de Medicina de la UAM. 
A todos los profesores que durante mi formación académica me han ido guiando por este 
camino. En particular a Pepe Almendral, Ángeles Juarranz y al Dr. Regadera (espero que no 
se enfade por referirme al resto de investigadores y profesores por su nombre de pila…). 
A todos los compañeros que han ido pasando por los laboratorios y con los que he 
compartido muchos momentos de risas y buen rollo: Elvira, María Tiana, María Gómez, 
Laura Deguiz, Javi, Jorge, Anuska, Carmen, Patricia… 
A Lucia, mi compañera de fatigas durante estos dos últimos años. Siempre con una sonrisa y 
unas palabras de ánimo. 
A mis amigas Olga y Gemma, con las que las largas jornadas en el laboratorio se hacían 
mucho más llevaderas, compartiendo meriendas-casi-cenas. Gracias también por toda la 
ayuda y consejos que me habéis dado durante estos años. 
A mis amigos de la carrera: Miguel, Antonio y Silvia. Aunque nos veamos prácticamente de 
año en año, cuando nos reunimos por navidad para comer sushi y agua del grifo, es como si 
realmente no hubiese pasado el tiempo. 
A mi vieja amiga Silvia (no lo digo por la edad), una de las personas que mejor me conoce y 
me entiende. Gracias por ser mi confidente y estar siempre dispuesta a ayudarme. 
A toda la gente maravillosa que he conocido en este último año, de la que tanto he 
aprendido, con la que tan buenos ratos paso y con la que espero construir una fuerte 
amistad. 
A Javi y su familia, por estar siempre cerca, apoyándome y confiando en mí. 
A mi madre y a mi padre, las personas más importantes de mi vida. Gracias a vosotros soy lo 
que soy. Gracias por habérmelo dado todo. Os quiero. 
 
 
 
 
 
 
Resumen/ 
/Abstract 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Resumen 
La transformación tumoral es un proceso complejo que implica varios cambios en el 
funcionamiento normal de la célula. Entre las habilidades que adquiere una célula en su 
transición a un estado maligno se encuentra la capacidad de crecimiento independiente de 
anclaje, íntimamente relacionada con los mecanismos que permiten evadir la muerte celular 
inducida por pérdida del anclaje a un sustrato rígido. El ensayo más empleado para 
determinar la capacidad de crecimiento independiente de anclaje es el de formación de 
colonias en agar blando. Mientras que los linfomas, tumores sólidos resultado de la 
malignización de células linfoides, forman colonias en agar blando, los linfocitos inmortales 
no tumorales no crecen. Los linfocitos normales requieren de anclaje a sustratos y a otras 
células para llevar a cabo sus funciones biológicas. Sin embargo, en este trabajo hemos 
observado que, in vitro, tanto las líneas celulares linfoides tumorales como las inmortales no 
tumorales son capaces de proliferar en ausencia de interacción directa con otras células o 
con el sustrato rígido. El estudio en profundidad del papel restrictivo que ejerce el cultivo en 
agar blando sobre las líneas inmortales, pero no sobre las líneas tumorales, reveló que es 
capaz de inducir estrés oxidativo en las células a través del aumento de los niveles de 
especies reactivas de oxígeno (ROS). Las células linfoides tumorales, a diferencia de las 
inmortales no tumorales, son capaces de hacer frente al estrés oxidativo inducido por el 
cultivo en agar gracias al incremento en los niveles de glutatión reducido (GSH), uno de los 
principales mecanismos de defensa antioxidante de la célula. La pérdida de la producción de 
GSH en células tumorales, mediante la inhibición farmacológica o mediante el silenciamiento 
de la expresión de la subunidad catalítica de la enzima limitante en su síntesis (GCLC), 
aumentó el estrés oxidativo e inhibió drásticamente elcrecimiento de las células tumorales 
en agar blando. El silenciamiento de GCLC también inhibió el crecimiento de linfomas en un 
modelo de xenotrasplante subcutáneo en ratones inmunodeficientes NOD-SCID. Los tejidos 
linfoides tumorales de un modelo de ratón que sobre-expresa MYC en linfocitos B (lambda-
MYC) muestran mayores niveles de GSH que los tejidos linfoides de ratones sanos y el 
tratamiento de los ratones lambda-MYC con un inhibidor farmacológico de GCLC previno la 
linfomagénesis en este modelo animal, lo que junto con el resto de resultados obtenidos en 
este trabajo sugiere la posibilidad de dirigir futuros tratamientos contra los mecanismos 
responsables de proporcionar resistencia al estrés oxidativo de las células tumorales. 
Abstract 
Tumor transformation is a complex process that involves several changes in cell physiology. 
Among the abilities that a cell acquires in its transition to a malignant state is the capacity for 
anchorage-independent growth, a capacity intimately related to the mechanisms that 
prevent cell death induced by loss of anchorage to a rigid substrate. Colony formation in soft 
agar hydrogels is the gold-standard assay for anchorage-independent growth. While 
lymphomas, solid tumors resulting from malignancy of lymphoid cells, form colonies in soft 
agar, immortal non-tumor lymphocytes do not grow. Lymphocytes anchor to the 
extracellular matrix and other cells while carrying out their biological function. However, we 
have observed that both tumor lymphoid and immortal non-tumor cells proliferate in the 
absence of direct interaction with other cells or with a rigid substrate. Research of the 
mechanisms involved in the restrictions imposed by soft agar on the growth of immortal 
lymphoid cell lines, but not on that of lymphoid tumor cell lines, revealed that of the culture 
in soft agar induces oxidative stress through of the increase of reactive oxygen species (ROS). 
Tumor lymphoid cells, unlike non-tumor immortal lymphoid cells, are able to cope with 
oxidative stress induced by culture in soft agar through the increase in reduced glutathione 
levels (GSH), one of the main antioxidant defense mechanisms of cells. The loss of GSH 
production in tumor cells, through pharmacological inhibition or by silencing of the catalytic 
subunit of the limiting enzyme of its synthesis (GCLC), markedly inhibited their growth in soft 
agar. Moreover, GCLC knockdown also inhibited lymphoid tumor growth in a model of 
subcutaneous xenograft in immunodeficient NOD-SCID mice. Lymphoid tumor tissues in the 
lambda-MYC mouse model, that overexpresses MYC in B-lymphocytes, show higher GSH 
levels than lymphoid tissues from wild-type littermates, and pharmacological inhibition of 
GCLC in lambda-MYC mice prevented lymphomagenesis. Together, our results strongly 
encourage directing lymphoid tumor treatments against mechanisms responsible for 
oxidative stress resistance in tumor cells. 
 
 
 
 
Índice 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Abreviaturas ........................................................................................................................................ 1 
Introducción ........................................................................................................................................ 5 
1. Cáncer .............................................................................................................................................. 7 
1.1. Transformación tumoral .......................................................................................................... 7 
1.2 Crecimiento independiente de anclaje ................................................................................... 10 
1.3 la teoría de las CSC: situación actual ....................................................................................... 11 
1.4 Investigación del cáncer: ensayo de tumorigenicidad ............................................................ 13 
2. Neoplasias linfoides ....................................................................................................................... 14 
2.1 clasificación ............................................................................................................................. 14 
2.2 Linfoma no-Hodgkin ................................................................................................................ 16 
2.3 Aspectos moleculares y genéticos del NHL ............................................................................. 17 
2.4 Tratamiento e investigación del NHL ...................................................................................... 18 
3. Estrés oxidativo ............................................................................................................................. 19 
3.1. Especies Reactivas de Oxígeno: funciones fisiológicas .......................................................... 19 
3.2 Estrés oxidativo: daño celular, enfermedad y cáncer ............................................................. 21 
3.3 Mecanismos de defensa antioxidante .................................................................................... 22 
3.4 Glutatión .................................................................................................................................. 22 
Objetivos ............................................................................................................................................. 25 
Materiales y Métodos ..................................................................................................................... 29 
1. Líneas celulares ............................................................................................................................. 31 
2. Ensayo de formación de colonias en agar blando ......................................................................... 31 
3. Recuperación de células sembradas en agar ................................................................................ 32 
4. Ensayos de impedimento de anclaje ............................................................................................. 32 
4.1 Poly-HEMA............................................................................................................................... 32 
4.2 Metilcelulosa ........................................................................................................................... 33 
4.3 Bloqueo con anticuerpos y tratamiento con compuesto A-286982 ...................................... 33 
4.4 Ensayo clonogénico ................................................................................................................. 34 
5. Análisis de proliferación y ciclo celular ......................................................................................... 34 
6. Extracción de RNA y qPCR ............................................................................................................. 35 
7. Western blot .................................................................................................................................. 35 
8. Tratamiento con BSO, NAC y Z-VAD .............................................................................................. 36 
9. Análisis de viabilidad celular ......................................................................................................... 36 
10. Detección de ROS y GSH por citometría de flujo ........................................................................ 37 
11. Generación de vector de expresión de GCLC ............................................................................. 37 
12. Transfección celular y producción de lentivirus .......................................................................... 37 
13. Transducción lentiviral................................................................................................................ 38 
14. Xenotrasplante en ratones NOD-SCID ......................................................................................... 38 
15. Detección de ROS en tejidos de ratones λ-MYC .......................................................................... 39 
16. Tratamiento con BSO de ratones λ-MYC ..................................................................................... 39 
17. Generación de la línea híbrida de ratón LXG ............................................................................... 40 
18. Genotipado de ratones ................................................................................................................ 40 
19. Elaboración de figuras y análisis estadístico. .............................................................................. 41 
Resultados .......................................................................................................................................... 43 
1. Las líneas celulares linfoides, tanto inmortales no tumorales como tumorales, son capaces de 
proliferar en ausencia de anclaje a sustrato rígido ........................................................................... 45 
2. El bloqueo de la interacción LFA1-ICAM1, principal responsable de las interacciones 
intercelulares entre linfocitos, no afecta a la capacidad proliferativa de estos ............................... 47 
3. las líneas celulares linfoides inmortales proliferan en ausencia total de anclaje ......................... 49 
4. El cultivo celular en agar blando induce muerte celular ............................................................... 53 
 ........................................................................................................................................................... 57 
5. El cultivo celular en agar blando induce estrés oxidativo ............................................................. 58 
6. Las líneas linfoides tumorales incrementan la síntesis de glutatión en respuesta al cultivo en agar 
blando ................................................................................................................................................ 61 
7. Glutatión es fundamental para la viabilidad de las líneas linfoides tumorales ............................. 62 
8. NAC protege a las células del estrés oxidativo inducido por agar blando de forma independiente 
a GSH ................................................................................................................................................. 64 
9. La expresión de GCLc en células de linfoma de Burkitt y de Leucemia T aguda es necesaria para 
el mantenimiento de su fenotipo tumoral ........................................................................................ 70 
10. Aumento de ROS y GSH en un modelo múrido de linfoma de Burkitt ....................................... 74 
11. La inhibición farmacológica de GCLC previene la formación de linfomas ................................... 76 
Discusión ............................................................................................................................................. 77 
1. Requisitos de anclaje de las líneas linfoides inmortalizadas y tumorales ..................................... 79 
2. Utilidad del cultivo en agar blando para el estudio de los tumores linfoides ............................... 81 
3. Indicios de la presencia de CSC en los tumores linfoides .............................................................. 83 
4. Adaptación y resistencia al estrés oxidativo en los tumores linfoides .......................................... 84 
5. Mecanosensibilidad y estrés mecánico en las líneas linfoides ...................................................... 87 
6. Perspectivas de nuevos tratamientos frente al linfoma ............................................................... 88 
Conclusiones ..................................................................................................................................... 91 
Bibliografía .......................................................................................................................................... 96 
1 
 
Abreviaturas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Abreviaturas 
3 
 
ACS: Sociedad Americana Contra el Cáncer (EEUU) 
BL: Linfoma de Burkitt 
BSO: L-Butionina-(S, R)- sulfoximina 
CHOP: Ciclofosfamida, Hidroxidaunorubicina, Oncovin, Prednisona. 
CSC: Célula troncal de cáncer 
DCFDA: 2´,7´-Diclorofluoresceina diacetato 
DHE: Dihidroxietidio 
DLBCL: Linfoma difuso de células B grandes 
DNA: Ácido desoxirribonucleico 
EBV: Virus de Epstein-Barr 
EdU: 5-ethynyl-2´-deoxyuridine 
FBS: Suero fetal bovino 
GCL: Glutamil cisteína ligasa 
GS: Glutatión sintasa 
GSH: Glutatión 
GSSG: Glutatión disulfuro 
HIF: Factor inducible por hipoxia 
HL: Linfoma de Hodgkin 
ICAM1: Molécula de adhesión intercelular 1 
IP: Ioduro de propidio 
LCL: línea celular linfoblastoide B 
LFA1: Antígeno de función linfocitaria 1 
LM: Lamda-MYC/ λ-MYC 
mBCI: Monoclorobimano 
MEC: Matriz extracelular 
NAC: N-acetil cisteína 
NCI: Instituto Nacional del Cáncer (EEUU) 
NHL: Linfoma no Hodgkin 
NOD-SCID: Diabético no obeso con inmunodeficiencia combinada severa 
OMS: Organización Mundial de la Salud 
PI3K: Fosfoinositol 3-quinasa 
REAL: Clasificación revisada de linfomas europeo-americana 
RNA: Ácido ribonucleico 
Abreviaturas 
4 
 
ROS: Especies reactivas de oxígeno 
RTq-PCR: reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real 
SA: Agar blando 
SOD: Súper óxido dismutasa 
TEM: Transición epitelio-mesénquima 
TGF-β: Factor de crecimiento transformante β 
VEGF: Factor de crecimiento de endotelio vascular 
VHC: Virus hepatitis C 
VIH: Virus inmunodeficiencia humana 
WHO: Organización Mundial de la Salud 
λ-MYC: Lamda-MYC/ LM 
Z-VAD: Z-Val-Ala-DL-Asp-fluorometilcetona 
 
 
 
 
 
 
5 
 
Introducción 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Introducción 
7 
 
1. Cáncer 
 
El término cáncer engloba un conjunto heterogéneo de enfermedades que se caracterizan 
por la proliferación incontrolada de células que han sufrido un proceso de transformación 
maligna. Potencialmente, cualquier tipo celular puede sufrir transformación, siendo cada 
tipo de cáncer una entidad patológica con características, causas, evolución y tratamiento 
diferente al resto. 
1.1. Transformación tumoral 
La conversión de una célula normal en una célula de cáncer es un proceso de varias etapas 
en las que esta adquiere las características típicas de una célula maligna a través del 
acúmulo de mutaciones en oncogenes y genes supresores de tumores, cambios epigenéticos 
y aberraciones cromosómicas. Ninguno de estos eventos es suficiente por sí mismo para el 
desarrollo del fenotipo maligno (Hanahan and Weinberg 2000, Hanahan and Weinberg 2011) 
(figura 1). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Al contrario que las células normales, las células transformadas no dependen de señales de 
crecimiento externas, sino que generan señales proliferativas de forma autosuficiente 
mediante, por ejemplo, la activación constitutiva de las rutas moleculares implicadas en el 
Figura 1. Características de la transformación tumoral. El proceso de transformación tumoral 
requiere del acumulo de varias alteraciones que proporcionan a las células diferentes 
habilidades. (Adaptado de Hanahan y Weinberg, 2011). 
Introducción 
8 
 
control de la proliferación, como la de las MAPK o la de PI3K (Sever and Brugge 2015, 
Hanahan and Weinberg 2000). Puesto que muchas de estas vías dependen dela 
transducción de señales mediada por moléculas de adhesión a sustrato, como las integrinas 
(Schwartz 1997), la capacidad de autosuficiencia proliferativa de las células tumorales se 
relaciona con su capacidad de crecimiento independiente de anclaje, tema que se tratará 
con más detalle en el siguiente apartado. 
El mantenimiento de la homeostasis en un individuo adulto requiere que la mayoría de las 
células permanezcan en un estado no proliferativo o quiescente, lo que se consigue 
mediante señales supresoras de la proliferación, como la mediada por la vía de TGF-β. Sin 
embargo, durante la transformación tumoral, las células adquieren la capacidad de evadir 
dichas señales (Hanahan and Weinberg 2000, Hanahan and Weinberg 2011). De igual modo, 
el mantenimiento de la homeostasis requiere un ajuste fino de la proliferación celular en su 
contexto tisular, lo que se consigue mediante mecanismos de inhibición de contacto entre 
células. Las células tumorales adquieren la capacidad de abolir estos mecanismos, lo que les 
permite proliferar de forma aberrante e indiscriminada (Hanahan and Weinberg 2011, 
Ribatti 2017). 
Una de las propiedades más relevantes del cáncer es su capacidad de invasión y metástasis, 
pudiendo colonizar y crecer en regiones y tejidos diferentes a su lugar de origen. En esto 
juega un papel fundamental la transición epitelio-mesénquima (TEM), un proceso normal 
durante el desarrollo embrionario, que el tumor es capaz de activar de forma transitoria o 
estable (Mittal 2018). Otras alteraciones bien caracterizadas implicadas en invasión y 
metástasis son la pérdida de expresión de E-cadherina y la ganancia de función de N-
cadherina (Cavallaro and Christofori 2004, Hanahan and Weinberg 2011, Berx and van Roy 
2009, Onder et al. 2008). 
Normalmente, ante alteraciones en el funcionamiento normal de la célula se activan 
mecanismos de muerte celular inducida, mediados por caspasas. Sin embargo, las células 
transformadas son capaces de evadir estas señales de diversas formas, por ejemplo 
mediante la pérdida de función del supresor tumoral TP53, sensor de daño de DNA, o 
modulando los niveles de expresión de moléculas pro y anti-apoptóticas, principalmente 
miembros de la familia BCL-2 (Hanahan and Weinberg 2011). 
Introducción 
9 
 
Otra característica típica del cáncer es la adquisición de inmortalidad replicativa, es decir, la 
capacidad de dividirse de forma indefinida evitando el programa celular que limita y regula 
los ciclos de división de una célula normal mediante inducción de senescencia y de muerte 
celular. En la adquisición de esta capacidad juegan un papel fundamental los telómeros, 
estructuras que protegen el extremo de los cromosomas y que se van acortando con cada 
división celular. Mientras que en células normales el acortamiento de los telómeros define el 
número de veces que la célula puede dividirse, las células inmortalizadas son capaces de 
mantener la longitud e integridad de estos mediante la acción de la enzima telomerasa 
(Hanahan and Weinberg 2011). 
Los tumores adquieren también la capacidad de inducir la formación de nuevos vasos 
sanguíneos, garantizando así el aporte de oxígeno y nutrientes. La construcción de esta red 
vascular aberrante se consigue mediante el equilibrio entre señales inductoras y señales 
inhibidoras, entre las que destacan las reguladas por el factor de crecimiento de endotelio 
vascular A (VEGF-A) y trombospondina 1 (TSP-1) respectivamente. La expresión del inductor 
VEGF-A es promovida tanto por hipoxia, habitual en el foco tumoral primordial, como por 
señalización oncogénica, como la llevada a cabo por RAS o MYC (Hanahan and Weinberg 
2011). 
En los últimos años ha recobrado especial importancia el concepto de reprogramación o 
desregulación del metabolismo energético como un factor clave en la iniciación y progresión 
de ciertos tipos de tumores. Mientras que las células normales basan su metabolismo 
energético en la oxidación aeróbica del piruvato (en la mitocondria), muchos tipos de células 
de cáncer obtienen energía en un proceso de glicólisis anaerobia, aun en presencia de 
oxígeno, lo que implica altas tasas de consumo de glucosa (Hanahan and Weinberg 2011). 
Otro aspecto de la biología del cáncer que está recibiendo especial atención es la capacidad 
que pueden adquirir las células transformadas de evadir al sistema inmune, el cual podría 
potencialmente reconocerlas y eliminarlas. Existe evidencia de que esta evasión ocurre tanto 
a nivel de respuesta adaptativa como de respuesta innata. Los mecanismos implicados son 
complejos y no totalmente conocidos, pero todos ellos parecen converger en la exclusión del 
infiltrado de células T y otras células inmunitarias del microambiente tumoral, así como en la 
pérdida de inmunogenicidad, lo que dificultaría su reconocimiento por parte del sistema 
inmunitario (Hanahan and Weinberg 2011). 
Introducción 
10 
 
1.2 Crecimiento independiente de anclaje 
Como se ha comentado anteriormente, una de las habilidades que debe adquirir una célula 
en su transición a un estado maligno es la de crecimiento independiente de anclaje 
(Schwartz 1997, Guadamillas, Cerezo and Del Pozo 2011). Las células normales requieren 
anclaje a un sustrato para proliferar y sobrevivir y para ello se unen a la MEC y a otras células 
a través de las integrinas y otras moléculas de adhesión, como los miembros de la 
superfamilia de las inmunoglobulinas. Esto no consiste en un simple anclaje mecánico, sino 
que además forma parte de las complejas redes de transducción de señales a través de las 
cuales las células reciben información sobre su localización, el ambiente que las rodea y su 
estado adhesivo, mediante señales y estímulos procedentes de la MEC y de otras células. 
Estas señales desencadenan respuestas apropiadas como migración, diferenciación, 
proliferación y supervivencia (Assoian 1997, Okayama 2012). 
En células epiteliales se ha demostrado que la pérdida de anclaje y, por tanto, de las señales 
de supervivencia principalmente mediadas por integrinas, lleva a la activación de una serie 
de mecanismos que resultan en un tipo particular de muerte programada denominada 
anoikis. Esto constituye un mecanismo esencial para mantener a las células en su correcto 
contexto tisular (Taddei et al. 2012, Ishikawa et al. 2015) (Figura 2). Como excepción a esto, 
las células del linaje hematopoyético pueden sobrevivir en ausencia de anclaje, tal como 
ocurre durante su circulación por el torrente circulatorio; pero su actividad biológica sigue 
siendo dependiente de la unión a otras células o a la MEC. Así por ejemplo, la diferenciación, 
maduración y proliferación de las células linfoides ocurre en tejidos sólidos, en los que las 
células están en estrecho contacto unas con otras. Su función biológica depende de la 
interacción directa con diferentes tipos celulares, como la adhesión a células endoteliales 
durante la extravasación, a células presentadoras de antígenos o a células diana dañadas 
que deben ser eliminadas (Abbas, Litchman and Pillai 2014). 
La capacidad de crecimiento independiente de anclaje adquirida durante la transformación 
tumoral requiere que las células sean capaces de adaptarse a la pérdida de la señalización 
mediada por el anclaje de las integrinas y otras moléculas de adhesión a la MEC, de forma 
que sean capaces de sobrevivir y proliferar en su ausencia. Entre las estrategias que se han 
descrito para tal fin, se encuentra la activación constitutiva de la señalización mediada por 
integrinas o la activación de vías de señalización independientes de integrinas. También 
Introducción 
11 
 
requiere esquivar los mecanismos inductores de muerte celular que se activan por la 
ausencia de anclaje (Schwartz 1997, Guadamillas et al. 2011) (Figura 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Estudios recientes indican que la adquisición de la capacidad de crecimiento independientede anclaje por parte de las células tumorales requiere de adaptaciones metabólicas. Así por 
ejemplo, el metabolismo oxidativo de la glucosa, sustrato fundamental del metabolismo 
celular, es reemplazado por un metabolismo reductor de la glutamina en células de cáncer 
de pulmón y por la oxidación de ácidos grasos en células cancerosas de epitelio mamario. 
Esto ocurriría porque la incorporación de glucosa es altamente dependiente de la 
señalización mediada por anclaje (Schafer et al. 2009, Stalnecker, Cluntun and Cerione 2016, 
Jiang et al. 2016, Yang et al. 2018). 
La capacidad de crecimiento independiente de anclaje se ha correlacionado clásicamente 
con el potencial tumorigénico evaluado in vivo (xenotrasplante en ratones 
inmunodeficientes) e in vitro (formación de colonias en agar) (Borowicz et al. 2014, Shin et 
al. 1975). 
 
1.3 la teoría de las CSC: situación actual 
Las células troncales de cáncer (cancer stem cells, CSC) son una subpoblación de células 
dentro de la masa tumoral que comparten características con las células madre normales y 
Figura 2. Las células tumorales adquieren la capacidad de supervivencia y crecimiento 
independiente de anclaje. En ausencia de anclaje a la MEC, una célula normal sufre muerte 
programada (anoikis). Las células tumorales adquieren la capacidad de sobrevivir en estas 
condiciones, lo que le permite invadir regiones distales y metastatizar. (Adaptado de Taddei et al, 
2012). 
Introducción 
12 
 
que actualmente se consideran mediadoras de la iniciación y progresión tumoral, así como 
responsables de las metástasis, la recidiva tras tratamiento debido a su resistencia a drogas y 
de la heterogeneidad de los tumores (Nassar and Blanpain 2016, Yu et al. 2012). Las CSC 
fueron descritas por primera vez en leucemia mieloide aguda como una subpoblación de 
entre el 0.1 y 1% de la población tumoral total (Bonnet and Dick 1997). Estas presentaban 
marcadores típicos de precursores hematopoyéticos pero, a diferencia de estos, eran 
capaces de promover la iniciación tumoral al ser inoculadas en ratones inmunodeficientes, 
propiedad actualmente considerada característica de las CSC (Bonnet and Dick 1997). Desde 
entonces son muchos los tipos de cáncer en los que se han identificado subpoblaciones CSC, 
cada una de ellas caracterizada por la presencia de marcadores de superficie celular 
específicos (Yu et al. 2012). 
Actualmente se desconoce si las CSC se originan a partir de células madre normales que han 
sufrido un proceso de transformación o si por el contrario provienen de células diferenciadas 
y transformadas que han adquirido capacidad de auto renovación (Mohiuddin, Wei and Kang 
2019). De cualquier forma, al igual que en las células madre normales, en las CSC actúan las 
vías de señalización responsables de sustentar la troncalidad, como Wnt, Hedgehog y Notch; 
expresándose también marcadores clásicos como los factores de transcripción NANOG, 
OCT4 y MYC (Wang, Sullenger and Rich 2012, Koury, Zhong and Hao 2017, Yu et al. 2012). 
Actualmente se está investigando el papel del nicho tumoral en el mantenimiento y 
reposición de la población CSC a partir de células no CSC, concepto denominado plasticidad 
celular; la importancia de la TEM en la adquisición de un fenotipo migratorio que permite a 
células epiteliales invadir y colonizar nuevos tejidos; los cambios en el metabolismo que 
permiten la adaptación de las CSC y el papel de los cambios epigenéticos sobre la regulación 
de estas (Zhao et al. 2018). 
De forma general, la terapia empleada actualmente en el tratamiento del cáncer se basa en 
la administración de fármacos quimioterapéuticos anti proliferativos, frente a los que las CSC 
parecen ser resistentes. Esto explicaría el fenómeno de relapso tras un tratamiento 
aparentemente efectivo (Dawood, Austin and Cristofanilli 2014). Los mecanismos descritos 
como responsables de la resistencia a fármacos son principalmente la sobre regulación de 
las bombas y transportadores de expulsión, la capacidad de reparación del DNA, mayor 
resistencia frente al estrés oxidativo y capacidad de entrar en quiescencia (Zhao et al. 2018, 
Koury et al. 2017). No es de extrañar por tanto que actualmente se estén investigando y 
Introducción 
13 
 
desarrollando nuevos fármacos encaminados a destruir selectivamente a las CSC. Entre estas 
terapias destacan las encaminadas a inhibir las vías de señalización maestras de las CSC (Wnt 
y Notch), la eliminación selectiva de las CSC mediante conjugados droga-anticuerpo, capaces 
de reconocer los marcadores de superficie específicos de las CSC, la terapia epigenética, la 
eliminación selectiva de CSC en quiescencia y la terapia dirigida al nicho tumoral, con el 
objetivo de impedir la reposición de las CSC (Koury et al. 2017, Zhao et al. 2018). 
1.4 Investigación del cáncer: ensayo de tumorigenicidad 
El estudio del cáncer se basa en el entendimiento a nivel celular y molecular de los 
mecanismos subyacentes a la transformación tumoral, que le permiten adquirir sus 
capacidades fenotípicas y funcionales. Conocer estos mecanismos en profundidad permitirá 
desarrollar terapias cada vez más específicas y eficaces. 
La tumorigenicidad es definida oficialmente por la Organización Mundial de la Salud (OMS-
WHO, World Health Organization) como la capacidad de una población celular inoculada en 
un modelo animal de producir un tumor por proliferación celular en el sitio de inoculación 
y/o en un sitio distal mediante metástasis (2013, WHO 2013). Se hace, sin embargo, 
extensible a modelos in vitro como el ensayo de formación de colonias en agar blando y más 
recientemente los ensayos de formación de esferoides tumorales. El interés de este tipo de 
ensayos in vitro radica en la posibilidad de usarlos, no solo como test de potencial 
tumorigénico, sino también para evaluar el efecto terapéutico de diversos fármacos (Rotem 
et al. 2015, Horibata et al. 2015). Es además un ensayo requerido para evaluar la calidad y 
seguridad de productos terapéuticos derivados de células (WHO 2013). 
El ensayo de formación de colonias en agar blando fue desarrollado en 1964 por 
Macpherson y Montagnier tras proponer que células transformadas por infección viral 
podrían adquirir la capacidad de formar colonias en agar y que esa habilidad podría ser 
usada como base de un ensayo selectivo (Macpherson and Montagnier 1964). 
Posteriormente se demostró correlación entre el crecimiento independiente de anclaje en 
agar de células transformadas por infección viral con la tumorigenicidad al ser inoculadas en 
ratones inmunodeficientes (Shin et al. 1975). Desde entonces ha sido ampliamente 
empleado, aceptándose además de forma general que este ensayo evalúa el potencial 
tumorigénico de las células a través de su capacidad de crecimiento independiente de 
anclaje a un sustrato (Borowicz et al. 2014, Horibata et al. 2015, Rotem et al. 2015). Un 
estudio reciente mostró que mientras que células linfoides tumorales son capaces de 
Introducción 
14 
 
proliferar en agar blando, células inmortalizadas no son capaces (Jiménez-P et al. 2018) 
(Figura 3). Pese a la evidencia ampliamente observada de que solo una pequeña parte de la 
población celular tumoral sembrada en agar es capaz de proliferar dando lugar a colonias, no 
ha sido hasta hace poco que se ha comenzado a aceptar que esa subpoblación se 
correspondería con células CSC (Morata-Tarifa et al. 2016). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. Neoplasias linfoides 
 
Los linfomas son un tipo de cáncer producto de la transformación maligna de células 
linfoides. A diferencia de la leucemia, que afecta a los mismos tipos celulares pero se origina 
en la medula ósea o directamente en la sangre, el linfoma se origina en el sistema linfático, 
pudiendo aparecer en cualquier región del cuerpo donde exista tejido linfoide, pero 
principalmente en los nódulos linfoides, bazo, médula ósea, timo y tracto digestivo. Ellinfoma es por tanto considerado un tumor sólido (Shankland, Armitage and Hancock 2012). 
2.1 clasificación 
Existe consenso en aceptar la clasificación de las neoplasias linfoides propuesta por la OMS, 
basada en la clasificación REAL (Revised European-American Lymphoma), que en su última 
revisión, publicada en 2016, los clasifica como linfoma o enfermedad de Hodgkin (HL, 
Hodgkin lymphoma), neoplasias de células B maduras, neoplasias de células T y NK maduras, 
Figura 3. Ensayo de siembra en agar blando. Líneas celulares linfoides inmortalizadas (JY y X50-7) 
no son capaces de proliferar cuando son sembradas en agar blando, mientras que las líneas 
tumorales DG-75 y Toledo si lo son, dando lugar a la formación de colonias. (A) Observación a 
simple vista de pocillos de placa de 6 pocillos. (B) Observación por microscopia de contraste de 
fase. Barra escala, 200 μm. (Adaptado de Jiménez et al. 2018) 
Introducción 
15 
 
neoplasias histocíticas y dendríticas y desordenes linfoproliferativos postrasplante (Figura 4). 
Cada una de estas categorías engloba a su vez diferentes entidades patológicas (Swerdlow et 
al. 2016). Las neoplasias linfoblásticas de precursores de células B y T se incluyen dentro de 
la clasificación de la OMS de neoplasias mieloides y leucemia aguda (Arber et al. 2016). 
 
 
 
 
 
 
El HL representa entre el 10% y el 20% de todos los linfomas y se caracteriza por la presencia 
de una masa tumoral-inflamatoria de localización ganglionar con un bajo porcentaje de 
células propiamente malignas, denominadas células Reed-Sternberg. Los ganglios más 
frecuentemente afectados son los de cuello, axilas o ingles. La causa del HL es desconocida, 
sin embargo son factores de riesgo la infección por el virus Epstein-Barr (EBV), sistema 
inmunitario debilitado por enfermedad o tratamiento farmacológico y antecedentes 
familiares. EL HL es un cáncer relativamente agresivo que puede diseminarse rápidamente a 
otras regiones del cuerpo, sin embargo, detectado a tiempo presenta altas tasas de curación 
y supervivencia. El principal tratamiento es la quimioterapia, complementada 
ocasionalmente con radioterapia (Ansell 2015a, Ansell 2018, Gobbi et al. 2013, NCI 2019). 
El resto de linfomas se conocen en su conjunto como linfomas no Hodgkin (NHL, Non-
Hodgkin lymphoma). Estos representan el 3% de todos los canceres y ocupan la 8º y 10º 
posición en frecuencia a nivel mundial en hombres y mujeres respectivamente. Las 
estimaciones para el año 2018 mostraron unos 509590 nuevos diagnósticos de NHL a nivel 
mundial (55 % hombres y 45% mujeres) y 248724 muertes (58% hombres y 42% mujeres) 
(NCI 2019, Miranda-Filho et al. 2019, Bray et al. 2018). 
Figura 4. Clasificación de las neoplasias linfoides según la OMS. La agrupación en linfoma no 
Hodgkin (NHL) no está establecida por la OMS, pero es de consenso general. 
Introducción 
16 
 
2.2 Linfoma no-Hodgkin 
Los NHL se pueden clasificar en base a su agresividad o velocidad de crecimiento como 
linfomas indolentes o de bajo grado y linfomas agresivos o de alto grado. Los primeros se 
caracterizan por la habitual ausencia de los síntomas típicos de NHL, típicamente llamados 
sintomatología B (nódulos linfáticos agrandados, fiebre, sudoración nocturna, pérdida de 
peso inexplicable y fatiga), con la excepción de linfoadenopatía de lenta evolución. Entre los 
más frecuentes se encuentra el linfoma folicular, el linfoma linfoplasmocítico, el linfoma 
marginal y los linfomas cutáneos. Los linfomas de alto grado se caracterizan, además de por 
su elevada agresividad, por la presencia de la sintomatología característica. Entre estos 
últimos destacan como especialmente agresivos el linfoma difuso de células B grandes 
(DLBCL, Diffuse Large B Cell Lymphoma) y el linfoma de Burkitt (BL, Burkitt Lymphoma) (NCI 
2019, Ansell 2015b, Shankland et al. 2012). 
El DLBCL es el NHL más frecuente a nivel mundial (25% de todos los NHL). Aunque puede 
originarse a cualquier edad, el riesgo aumenta con esta. Existen varios subtipos atendiendo a 
características morfológicas, inmunohistoquímicas y moleculares, siendo estas últimas las 
que aportan información de mayor valor de cara al tratamiento y pronóstico. En este sentido 
se pueden clasificar como de tipo centro germinal o de tipo célula B activada (ACS 2018, NCI 
2019) . 
El BL es una neoplasia relativamente infrecuente que afecta principalmente a pacientes 
jóvenes. Se clasifica en 3 subtipos con características clínicas diferentes. La variante 
endémica es característica de África ecuatorial, afecta sobre todo a niños y se asocia a 
infección por EBV. La variante asociada a inmunosupresión afecta a individuos con sistemas 
inmunitarios deficientes. La variante esporádica, siendo la forma más habitual de LB a nivel 
mundial, solo representa el 2% de todos los NHL (Velasco et al. 2018, ACS 2018, NCI 2019). 
De forma general podemos hablar de diversos factores de riesgo para el desarrollo del NHL 
como la edad (más de la mitad de los pacientes son mayores de 65 años en el momento del 
diagnóstico), el sexo (mayor frecuencia en hombres que en mujeres), etnicidad (más 
frecuente en población blanca de países desarrollados), historial familiar (se considera factor 
de riesgo tener un familiar de primer grado con NHL, no necesariamente por motivos 
genéticos), ambiente (exposición a ciertos químicos, fármacos y radiación), estado 
inmunitario (sistema inmunitario debilitado de forma hereditaria o adquirida) e Infecciones, 
incluyendo aquellas que directamente están implicadas en transformación de linfocitos 
Introducción 
17 
 
(HTLV-1, EBV, HHV-8), las que debilitan el sistema inmunitario, como VIH; y las que 
estimulan de forma crónica el sistema inmunitario (Helicobacter pylori, Chlamydophila 
psittaci, Campylobacter jejuni, VHC) (ACS 2018). 
2.3 Aspectos moleculares y genéticos del NHL 
En los NHL son frecuentes mutaciones en proto-oncogenes, alteraciones epigenéticas y 
anormalidades cariotípicas. Como se ha comentado anteriormente, NHL comprende un 
grupo heterogéneo de enfermedades malignas. 
El DLBCL puede originarse de novo o progresar a partir de un linfoma B de bajo grado. En 
prácticamente el 100% de los DLBCL el gen BCL-6, que codifica un represor transcripcional 
imprescindible para la formación del centro germinal, presenta alguna mutación o 
reordenamiento. Así por ejemplo, el reordenamiento que deja a BCL-6 bajo el control de 
regiones promotoras de genes de inmunoglobulinas, desregula su expresión, contribuyendo 
al desarrollo del linfoma al bloquear la diferenciación de los linfocitos B (Pratap and Scordino 
2019, Freedman and Nadler 2003). 
El BL se caracteriza por la translocación del gen MYC desde su posición normal en el 
cromosoma 8 a otros cromosomas, donde queda yuxtapuesto a genes de inmunoglobulinas. 
La translocación resulta en la expresión desregulada de este gen, lo que se traduce en una 
síntesis aumentada o inapropiada de la proteína que codifica, MYC. Esta es una proteína de 
unión a DNA encargada de regular la expresión de diferentes genes implicados en el control 
de la proliferación celular y por tanto su expresión alterada conduce a una proliferación 
acelerada e incontrolada. La translocación más habitual, presente en el 80% de los casos de 
LB, es la que sitúa a MYC en el cromosoma 14, en el locus del gen de la cadena pesada de las 
inmunoglobulinas. Otras variantes implican a los cromosomas 2 o 22. Esto lleva a considerar 
a MYC como un oncogén (Hecht and Aster 2000, Nguyen, Papenhausen and Shao 2017). 
La translocación del oncogén BCL2 desde el cromosoma 14 hasta la región 
transcripcionalmente activa del gen de inmunoglobulina en el cromosoma 18 está presente 
en el 85% de los linfomas foliculares y en el 30% de los LNH difusos. El producto del gen BCL2 
es un inhibidor de apoptosis y por tanto, su expresión incontrolada y aberrante proporciona 
a las células la capacidadde esquivar el programa de muerte celular, que de otra manera 
funcionaría como barrera frente a la transformación tumoral (Freedman and Nadler 2003, 
Pratap and Scordino 2019). 
Introducción 
18 
 
La translocación del gen BCL1 desde el cromosoma 11 hasta el cromosoma 14 provoca la 
expresión desregulada de su producto, la ciclina D1. Esta participa en el control de la 
transición G1/S del ciclo celular. Aunque esta alteración se emplea como marcador 
molecular de linfoma de células del manto, probablemente son necesarias mutaciones 
adicionales en otros genes, como P53 y P21, para dar origen a este tipo de linfoma 
(Freedman and Nadler 2003). 
Otras translocaciones implicadas en el desarrollo de NHL son las que afectan a los genes 
PAX5, BCL10 y AP12. PAX5, localizado en el cromosoma 9 y susceptible de ser translocado al 
cromosoma 14 (bajo control del promotor de inmunoglobulina H), codifica la proteína BSAP, 
implicada en la diferenciación y proliferación de linfocitos B. la translocación de BCL10 desde 
el cromosoma 1 al 14 causa la sobreexpresión de su producto, una proteína reclutadora de 
caspasas, bloqueando la cascada apoptótica. De forma análoga y con igual resultado, la 
transposición de AP12 desde el cromosoma 11 hasta el 18 resulta en la sobreexpresión de 
un inhibidor de apoptosis (Freedman and Nadler 2003, Pratap and Scordino 2019). 
2.4 Tratamiento e investigación del NHL 
El tratamiento de elección dependerá del tipo y subtipo de NHL, así como del estadio de la 
enfermedad. Es por esto que resulta fundamental un correcto diagnóstico. Este se basa 
principalmente en el estudio de muestras de biopsia e incluye generalmente análisis de 
inmunofenotipo, análisis citogenético y perfiles de expresión génica (Ansell 2015b, ACS 
2018). 
Clásicamente, el tratamiento del NHL ha consistido en el uso de quimioterapia, 
complementada en ocasiones con radioterapia. Es común el uso de regímenes 
quimioterapéuticos en los que se combinan fármacos con diferentes dianas celulares, de 
modo que se intenta atacar a la célula tumoral proliferativa desde diferentes frentes con el 
objetivo de incrementar el éxito del tratamiento. Las dianas a las que se suele dirigir la 
terapia son la replicación del DNA y la polimerización de los microtúbulos; todo ello 
necesario para la división celular. Estos tratamientos suelen ser bastante agresivos y generan 
numerosos efectos secundarios puesto que son muchos los tipos celulares no transformados 
que también se ven afectados. Entre los regímenes más empleados en el tratamiento de NHL 
destacan CHOP y CVP, en los que drogas quimioterapéuticas (3 y 2 respectivamente) se 
combinan con prednisona, un fármaco esteroideo (NCI 2019, Ansell 2015a, Ansell 2015b, LLS 
2013). 
Introducción 
19 
 
Cuando el tratamiento es efectivo, habitualmente se consigue prolongar el periodo libre de 
progresión tumoral en el paciente, pero no la erradicación completa del tumor. Actualmente 
se están dedicando grandes esfuerzos a determinar e investigar eventos o mecanismos que 
ocurran en el tumor y que permitan dirigir la terapia de forma aún más directa y específica, 
logrando la completa remisión de la enfermedad. En este sentido cabe destacar la 
importancia que ha adquirido el estudio del microambiente tumoral como diana terapéutica 
(LLS 2013). Existe evidencia de que el nicho en el que el tumor se encuentra participa 
activamente en su origen y desarrollo, proporcionando un ambiente inmunosupresor que 
permite a las células malignas evadir la respuesta inmunitaria, y aportando factores de 
supervivencia y crecimiento, los cuales emplean estas células en su beneficio (Spranger 
2016, Binnewies et al. 2018). 
Actualmente se encuentran bajo desarrollo clínico nuevos fármacos, combinaciones y 
regímenes de aplicación. Otras modalidades terapéuticas en desarrollo son los trasplantes 
de células madre y la terapia biológica, que engloba a la terapia con anticuerpos 
monoclonales, la inmunoterapia, el desarrollo de vacunas terapéuticas, la terapia 
antiangiogénica y la terapia génica (ACS 2018, NCI 2019, LLS 2013). 
 
3. Estrés oxidativo 
 
El estrés oxidativo consiste en el desequilibrio, en un sistema vivo, entre los niveles de 
especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxygen Species, ROS) y los sistemas antioxidantes de 
defensa, a favor de los primeros. Esto puede ocurrir bien por una sobreproducción de ROS, o 
bien por un fallo en la capacidad de neutralizarlos o de reparar el daño causado. Cabe 
destacar que además de las ROS de origen endógeno, existen fuentes exógenas como 
contaminantes del aire y agua, tabaco, alcohol, metales pesados, drogas y diferentes tipos 
de radiación. Las ROS, tanto endógenas como exógenas causan daño, mediante 
modificaciones oxidativas, a nivel de carbohidratos, lípidos, proteínas y DNA (Schieber and 
Chandel 2014, Sies 2015). 
3.1. Especies Reactivas de Oxígeno: funciones fisiológicas 
Las ROS, en el contexto de su origen endógeno, son moléculas químicamente reactivas 
derivadas de la reducción del oxígeno molecular (O2), molécula estable y poco reactiva. 
Introducción 
20 
 
Entre las principales ROS se encuentran el anión superóxido (•O2-­­), el oxígeno singlete (1O2), 
el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo (•OH). La principal fuente de ROS es la 
mitocondria, el orgánulo responsable del metabolismo respiratorio aerobio celular. El anión 
superóxido, precursor de la mayoría de ROS restantes, se produce como resultado de la 
reducción del oxígeno molecular por parte de las NADPH oxidasas, mediante la transferencia 
de un electrón. Esto tiene lugar principalmente en el complejo III de la cadena respiratoria. El 
anión superóxido es posteriormente convertido en su práctica totalidad a peróxido de 
hidrógeno por acción de las superóxido dismutasa 1 y 2 (SOD 1 y 2), de localización citosólica 
o mitocondrial respectivamente. El peróxido de hidrógeno no es un radical libre en sí mismo 
ya que no presenta electrones desapareados, pero a través de la reacción de Fenton es 
capaz de dar lugar al ion hidroxilo, una ROS altamente reactiva que oxida y daña de forma 
indiscriminada lípidos, proteína y DNA (Nickel, Kohlhaas and Maack 2014, Angelova and 
Abramov 2016). 
Las ROS se generan como productos normales del metabolismo aerobio y además de los 
efectos potencialmente nocivos derivados de su inestabilidad reactiva, que pueden llegar a 
comprometer la viabilidad celular; también cumplen importantes funciones fisiológicas, 
principalmente de adaptación a situaciones de estrés celular. El efecto fisiológico o dañino 
de las ROS depende por tanto de los niveles acumulados en la célula. Mientras que niveles 
bajos y controlados son necesarios para el mantenimiento de la homeostasis y la adaptación 
a estrés, niveles elevados son responsables de daño celular. El H2O2 es la especie 
principalmente responsable de las funciones fisiológicas. Así, en una situación de hipoxia 
(tensión de O2 por debajo del 3%), se induce la producción de ROS con el objetivo de activar 
a HIF, la molécula responsable de organizar la respuesta transcripcional que permite la 
adaptación a hipoxia. El mecanismo por el que las ROS activan HIF es mediante la inhibición 
de su hidroxilación. A nivel transcripcional las ROS también regulan la expresión de VEGF, 
una de las dianas de HIF, responsable de inducir la formación de nuevos vasos sanguíneos. 
Las ROS participan en el control de la autofagia, un mecanismo celular que permite el 
mantenimiento de la homeostasis mediante el continuo reciclado de estructuras celulares 
dañadas, así como el reciclado de nutrientes en una situación de privación de los mismos, 
mediante la oxidación e inactivación de la cisteín proteasa Atg-4. Las ROS participan también 
en los mecanismos de inmunidad innata siendo el mecanismo más conocido el de la 
destrucción oxidativa directa de patógenos, mediada por NADPH oxidasas, quetiene lugar 
Introducción 
21 
 
en los fagosomas. También participan como transductores de señales de receptores Toll Like 
(TLRs), receptores RIG-1 Like (RLRs) y de citoquinas inflamatorias. Estudios en los que se 
redujeron los niveles endógenos de ROS en células madre mostraron que la diferenciación 
de estas se veía inhibida o retrasada, lo que sugiere que las ROS también juegan un papel 
fundamental en este proceso. (Angelova and Abramov 2016, Hamanaka and Chandel 2009, 
Sena and Chandel 2012, Bartosz 2009, Schieber and Chandel 2014, Dayem et al. 2010) 
3.2 Estrés oxidativo: daño celular, enfermedad y cáncer 
Como hemos visto, es el acumulo excesivo de ROS en la célula lo que genera estrés 
oxidativo. Este puede resultar en daño a nivel de DNA, proteínas y lípidos de membrana. 
Este daño en las células y tejidos se ha relacionado con numerosas enfermedades en 
humanos incluyendo enfermedades cardiovasculares, metabólicas, desordenes cognitivos, 
enfermedades neurodegenerativas y diferentes tipos de cáncer; así como con el proceso de 
envejecimiento, tanto normal como precoz, a través de la inducción de senescencia celular 
(Ghezzi et al. 2017, Liguori et al. 2018). 
Existe abundante literatura sobre la relación entre estrés oxidativo y cáncer, pero lejos de 
llegar a un consenso parece ser que las implicaciones del estrés oxidativo en cáncer son tan 
amplias como tipos diferentes de cáncer existen. El estrés oxidativo se relaciona con el 
cáncer de forma directa e indirecta. El estrés oxidativo podría inducir transformación celular 
de forma directa a través del daño oxidativo en el DNA y su modificación química. Este daño 
en el material genético resultaría en el bloqueo de la transcripción, inducción de errores e 
inestabilidad genómica. De forma indirecta se relaciona a través de otros mecanismos como 
el envejecimiento y la inflamación, mecanismos estrechamente relacionados con el cáncer y 
en los que el estrés oxidativo también juega un papel fundamental. Se sabe que las ROS en 
particular activan el factor de transcripción NFκB, que induce la expresión de genes 
implicados en proliferación celular, apoptosis y carcinogénesis. Las ROS, producto de la 
inflamación crónica, también pueden activar los factores de transcripción c-fos y c-jun, 
implicados en transformación neoplásica e inducción de angiogénesis, de vital importancia 
para el foco tumoral, a través de factores angiogénicos (FGF, VEGF, prostaglandinas E1 y E2). 
El material genético dañado, especialmente los residuos 8-oxodG y 8-nitroguanina, se 
consideran biomarcadores de carcinogénesis inducida por inflamación (Moloney and Cotter 
2018). 
Introducción 
22 
 
3.3 Mecanismos de defensa antioxidante 
Para garantizar el correcto funcionamiento de la célula son necesarios mecanismos que 
permitan mantener el fino ajuste en los niveles de ROS que aseguren la eficacia e inocuidad 
de la señalización redox. Estos mecanismos se pueden entender como defensas 
antioxidantes en cuanto que evitan el acúmulo y acción potencialmente dañinos de las ROS. 
La célula tiene diferentes mecanismos de defensa antioxidante que se suelen clasificar como 
enzimáticos y no enzimáticos. Dentro de los enzimáticos destacan el sistema superóxido 
dismutasa (SOD), que como se ha mencionado anteriormente convierte al anión superóxido 
en peróxido de hidrogeno; La catalasa (CAT), que descompone el peróxido de hidrogeno en 
agua y oxígeno molecular; y glutatión peroxidasa (GSH-Px) que convierte peróxidos y 
radicales hidroxilo en formas no tóxicas mediante la oxidación del glutatión (GSH) reducido. 
Entre los no enzimáticos, presentes principalmente en sangre y plasma, encontramos 
bilirrubina, α-tocoferol, β-carotenos, albúmina y ácido úrico. Además de estos antioxidantes, 
llamados en su conjunto endógenos, existen antioxidantes exógenos, incorporados 
principalmente a través de la dieta o como parte de un tratamiento farmacológico. Entre 
estos encontramos vitamina C, α-tocoferol, compuestos fenólicos (resveratrol, flavonoides) y 
minerales (zinc, selenio) (Liu et al. 2018, Snezhkina et al. 2019). 
3.4 Glutatión 
El glutatión es considerado uno de los principales sistemas antioxidante y detoxificante de la 
célula. Se encuentra de forma ubicua en todos los tipos celulares del organismo y está 
ampliamente distribuido en el reino vegetal y animal. Es un tripéptido no proteico de 
cisteína, glutamina y glicina, sintetizado en el citoplasma en dos pasos dependientes de ATP. 
En primer lugar L-glutamato y cisteína se combinan para dar lugar a la glutamil-cisteína en 
una reacción catalizada por la enzima γ-glutamil-cisteína-ligasa (GCL), siendo esta la etapa 
limitante. En una segunda etapa, la enzima glutatión-sintasa (GS), cataliza la unión de 
glutamil-cisteína y glicina para dar lugar al glutatión en su forma reducida (GSH) (Forman, 
Zhang and Rinna 2009) (Figura 5). 
 
 
Introducción 
23 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
GSH es capaz de donar un equivalente de reducción a moléculas reactivas, como ROS, 
mediante la enzima peroxidasa GSH-Px. De esta forma el glutatión se convierte en una forma 
reactiva que es rápidamente neutralizada mediante su unión a otra molécula de glutatión 
reactivo, dando lugar al disulfuro de glutatión (GSSG). La enzima glutatión reductasa (GR) 
cataliza la regeneración de GSH a partir de GSSG. En condiciones normales más del 90% del 
glutatión presente en la célula se encuentra en su forma reducida (GSH), y menos del 10% se 
encuentra en forma neutralizada (GSSG). El análisis de sus niveles relativos se emplea para 
evaluar el estado redox de la célula. Además de neutralizar directamente a las ROS por el 
mecanismo descrito, GSH es capaz de regenerar antioxidantes exógenos como las vitamina C 
y E. También actúa como detoxificante al conjugarse con agentes xenobióticos (Forman et al. 
2009). 
GSH regula sus propios niveles intracelulares por un proceso de retroalimentación negativa 
de la enzima GCL de forma que frente a una situación de altos niveles de ROS o de 
sobrecarga de xenobióticos se estimula su síntesis. La deficiencia de GSH es características 
de varios estados patológicos (Forman et al. 2009). 
Se conocen varias moléculas capaces de modular la síntesis de GSH cuando son 
administradas de forma exógena. Así pues la N-acetil-cisteína (NAC) es un precursor de la 
síntesis de GSH (Aldini et al. 2018), mientras que la L-butionina (S-R) sulfoximina (BSO) es 
una molécula que inhibe de forma irreversible a la enzima GCL, bloqueando por tanto la 
síntesis de GSH en su etapa limitante (Drew and Miners 1984). 
Figura 5. Biosíntesis, actividad y 
regeneración celular del glutatión. El 
glutatión en su forma reducida se genera a 
partir de cisteína, glutamato y glicina en un 
proceso de dos etapas catalizadas por las 
enzimas γ-glutamil-cisteína ligasa (GCL) y 
glutatión sintasa (GS) respectivamente. GSH 
en su forma reducida es capaz de reducir al 
peróxido de hidrogeno a agua mediante la 
acción de la enzima glutatión peroxidasa 
(GPX) pasando así a un estado oxidado. La 
forma oxidada es reciclada nuevamente 
mediante la acción de la glutatión reductasa 
(GR). 
Introducción 
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25 
 
Objetivos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
26 
 
 
 
Objetivos 
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Las células linfoides circulan por el torrente sanguíneo en ausencia de anclaje a un sustrato 
rígido. Sin embargo, su diferenciación y proliferación ocurren en órganos sólidos, 
potencialmente en contacto con la matriz extracelular y con otras células. Su actividad 
biológica también requiere la interacción directa con otras células. El ensayo de crecimiento 
en agar blando, clásicamente empleado para evaluar in vitro la capacidad de crecimiento 
celular independiente de anclaje, y por extensión su potencial tumorigénico, muestra que 
las líneas linfoides tumorales son capaces de proliferar en agarblando, mientras que las 
líneas linfoides inmortalizadas (pero no tumorales) no crecen en este medio semisólido. 
En base a estos antecedentes nos planteamos como objetivo de este trabajo: 
- Determinar los requerimientos de anclaje intercelular y/o a sustratos rígidos de 
células linfoides inmortalizadas y de líneas de linfoma e identificar los mecanismos 
moleculares implicados. 
Los inesperados pero interesantes resultados obtenidos nos llevaron a reenfocar el 
proyecto, estableciendo un objetivo adicional: 
- Investigar el papel del estrés oxidativo en el crecimiento de los tumores linfoides. 
 
 
 
 
 
 
28 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Materiales y 
Métodos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Materiales y Métodos 
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1. Líneas celulares 
 
Las líneas celulares DG-75 y BL2 (BL), Toledo (DLBCL) y Jurkat (leucemia linfoblástica T 
aguda), así como las líneas linfoblastoides B inmortalizadas no tumorales JY y X50-7; y los 
linfocitos primarios (PBLs, Peripheral blood lympocytes,) extraídos de sangre de donantes 
sanos (procedente del Centro de Transfusiones de la Comunidad de Madrid) y estimulados 
con 5 µg/ml de leucoaglutinina y 50 U/ml de interleuquina 2, se cultivaron en medio RPMI 
1640 (Gibco, Life Technologies). Las líneas celulares NIH/3T3 (fibroblastos embrionarios de 
ratón), HeLa (adenocarcinoma de cérvix) y HEK-293T (células embrionarias de riñón humano) 
se cultivaron en medio DMEM (Gibco, Life Technologies). Ambos medios se suplementaron 
al 10% con suero bovino fetal (Gibco, Life Technologies), 2 mM glutamina (Gibco, Life 
Technologies), 100U/ml de penicilina (Penilevel, Laboratorios ERN) y 100 μg/ml de 
estreptomicina (Laboratorio Reig Jofré). Las células se mantuvieron en condiciones de cultivo 
estándar (37ºC, 5% CO2) y se testaron de forma periódica para descartar contaminación por 
micoplasma. 
2. Ensayo de formación de colonias en agar blando 
 
Estos ensayos se llevaron a cabo en diferentes soportes plásticos en función de su duración. 
Para el ensayo cásico o de tiempo largo (3-4 semanas) empleamos placas de 6 pocillos 
(MW6), mientras que para los ensayos de tiempo corto (24-72h) se emplearon tubos de 
polipropileno de 15 ml. Se preparó un stock inicial de agar (Agar noble, Difco) al 5% en agua 
miliQ mediante disolución a alta temperatura (microondas, máxima potencia a intervalos de 
15 segundos). Tras esterilización mediante autoclavado, se prepararon soluciones al 0.5% y 
al 0.33% en medio RPMI (20% FBS, 2mM glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de 
estreptomicina) y se mantuvieron a una temperatura entre 37 y 40ºC en baño para evitar su 
pronta gelificación. Se recubrió cada pocillo de la placa de cultivo con 2 ml de agar al 0.5%, 
generando una capa que impide el contacto de las células con la superficie plástica. Tras 
permitir su gelificación a temperatura ambiente, se depositó sobre ella 2 ml de agar al 0.33% 
conteniendo 5 x104 células (densidad de siembra: 2.5 x104 células/ml). Una vez gelificada la 
capa superior, las placas se mantuvieron en condiciones normales de cultivo celular. De 
forma periódica se añadió sobre la capa superior un pequeño volumen de medio RPMI para 
prevenir el desecado del gel. Para los experimentos de corta duración se puso a punto una 
Materiales y Métodos 
32 
 
versión del ensayo en la que 1 ml de agar al 0.33%, conteniendo 10 x104 células, es 
directamente depositado en un tubo de polipropileno de 15 ml. Para facilitar la rápida 
gelificación del agar, los tubos se incubaron durante 5 minutos en hielo. Los tubos se 
mantuvieron en condiciones normales de cultivo con el tapón parcialmente desenroscado 
para permitir el correcto intercambio de gases. 
3. Recuperación de células sembradas en agar 
 
Para recuperar las células sembradas en el agar blando se siguieron dos aproximaciones. 
Para los ensayos de citometría de flujo, en los que es necesario preservar la viabilidad 
celular, se recurrió a diluir el gel de agar 0.33% con PBS 1X en una proporción 1:1. Se 
procedió entonces a incubar con las correspondientes sondas durante el tiempo necesario y 
bajo las condiciones adecuadas para cada una de ellas, asegurándonos su correcto mezclado. 
Para la determinación de proliferación, ciclo celular, extracción de proteína y extracción de 
RNA, en los que la presencia de agar impide el procesamiento habitual, se puso a punto un 
método alternativo que permite la recuperación de la población total de células, pero no 
permite determinar su viabilidad. El gel de agar al 0.33% se diluyó con PBS 1X y se incubó a 
85ºC durante 3 min, tiempo suficiente para licuar el agar, permitiendo la sedimentación 
celular tras centrifugación a 1300 RPM durante 5 min a 40ºC. Tras lavado con PBS 1X, el 
pellet celular se procesó de forma normal según el tipo de análisis. 
4. Ensayos de impedimento de anclaje 
4.1 Poly-HEMA 
Se recubrieron las superficies de cultivo plástico con Poly-HEMA (Poli (2-hidroxietil 
metacrilato), Sigma-Aldrich-Merk), un polímero de metacrilato biológicamente inerte que 
impide la adhesión celular al plástico de las placas de cultivos. Se preparó a una 
concentración de 15 mg/ml en etanol 95%, manteniéndolo en agitación a 37ºC hasta su 
completa disolución. Se recubrieron pocillos de placas MW96 y MW24 con 30 µl o 200 µl 
respectivamente y se permitió su secado durante la noche en cabina de flujo laminar con 
tapa abierta, lámpara UV apagada, flujo apagado y cabina cerrada. Al día siguiente, con la 
cabina aun apagada y cerrada, la placa se irradió con luz UV durante 30 minutos. Se realizó 
posteriormente un lavado de los pocillos con PBS en condiciones de esterilidad. Finalmente, 
las células se sembraron en su medio de cultivo correspondiente a la densidad celular 
requerida para cada experimento. 
Materiales y Métodos 
33 
 
4.2 Metilcelulosa 
Se empleó metilcelulosa (1500 cps, R&D Systems) como agente viscosizante del medio de 
cultivo celular con el objetivo de limitar la movilidad celular e impedir las interacciones 
intercelulares. El stock original (3%) se diluyó al 1% en medio RPMI o DMEM conteniendo las 
células a una densidad de 1000 células/ml. Se sembró 1 ml de esta preparación por pocillo 
de placas MW24 previamente recubiertos con Poly-HEMA. La capacidad proliferativa se 
estimó como capacidad de formación de colonias. 
4.3 Bloqueo con anticuerpos y tratamiento con compuesto A-286982 
Células sembradas en pocillos de placa MW96 a una densidad de 10x105 células en un 
volumen de 100 μL, se incubaron en presencia de anticuerpos monoclonales frente a 
diferentes moléculas de membrana, esto es, integrinas y miembros de la familia de las 
inmunoglobulinas. Estos anticuerpos fueron producidos como sobrenadantes de cultivo de 
hibridomas por el grupo del Dr. Sánchez Madrid (Hospital de la Princesa, Madrid). En la tabla 
1 se indican los anticuerpos utilizados y las moléculas que reconocen. Los resultados se 
evaluaron por observación al microscopio de contraste de fases al cabo de 1 y 6 horas, en 
función de la cinética de agregación de las diferentes líneas celulares. 
El compuesto A-286982 (Sigma-Aldrich-Merk), inhibidor especifico de la interacción entre la 
integrina α1 e ICAM-1 (miembro de la familia de las inmunoglobulinas), se preparó en DMSO 
a una concentración de 10 mM. Células sembradas a una densidad de 2.5 x105 células/ml en 
500 μl por pocillo de placas MW24, recubiertos o no con Poly-HEMA, se incubaron en 
presencia del compuesto A-286982 a una concentración final de 2 µM. Tras 72h se evaluó su 
efecto funcional mediante observación al microscopio, así como su efecto sobre la capacidad 
proliferativa de las células. 
 
 
 
 
 
 
 
Materiales y Métodos 
34 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4.4 Ensayo clonogénico 
Se sembraron células de forma aislada en pocillos de placas MW96 (1 célula/pocillo), 
recubiertoso no con Poly-HEMA, empleando un equipo de separación FACS Vantage 
(Becton Dickinson). Al cabo de 3 semanas se evaluó la capacidad proliferativa de las células 
aisladas mediante observación al microscopio de contraste de fases y conteo de los pocillos 
en los que hubo proliferación. La eficacia de la siembra individual de linfocitos se comprobó 
previamente mediante siembra de células marcadas con la sonda fluorescente CFSE (éster 
de carboxifluoresceína succinimidil, Thermo Fisher Scientific) a una concentración final de 1 
μM. 
5. Análisis de proliferación y ciclo celular 
 
La capacidad proliferativa de las células se evaluó tras los diferentes tratamientos empleados 
mediante tinción con azul tripán (Sigma-Aldrich-Merk) y conteo en hemocitómetro o 
mediante análisis por citometría de flujo de la incorporación de EdU, un análogo de la 
timina. Para ello las células se incubaron en medio completo con EdU 10 μM durante 2h a 
37ºC empleando el kit “Click-iT EdU Alexa fluor 488 Flow Cytometry Assay Kit” (Life 
technologies, Invitrogen) y siguiendo las instrucciones proporcionadas por la casa comercial. 
Para el análisis de ciclo celular, las células se fijaron con etanol frio al 70% y se tiñeron con 
una solución 38 mM de citrato sódico, 69 μM de ioduro de propidio (IP) y 100 μg/ml de 
ARNasa durante 30 minutos a 37ºC. Los perfiles de ciclo celular se obtuvieron mediante 
Anticuerpo hibridoma Molécula reconocida 
X63 No reconoce ninguna molécula 
W6/32 HLA clase I 
Lia3/2.1 Cadena β2 de LFA-1 
TP1/40 Cadena αL de LFA-1 
TS1/11 Cadena αL de LFA-1 
RR1/1 ICAM-1 
HP2/1 Cadena α4 de VLA-4 
TS2/16 Integrina β1 
TP1/24 ICAM-3 
Tabla 1. Anticuerpos 
empleados y moléculas 
reconocidas. 
Materiales y Métodos 
35 
 
análisis por citometría de flujo empleando el equipo FACS-Canto II (Becton Dickinson). Los 
datos se analizaron con el programa ModFit LT (Verity Software). 
6. Extracción de RNA y qPCR 
 
El RNA total de las líneas celulares se obtuvo empleando el kit “RNeasy mini Kit” (Quiagen), 
siguiendo las instrucciones de la casa comercial, o mediante extracción con trizol (Tri 
Reagent solution, Applied Biosystems). La concentración de RNA se midió con el 
espectrofotómetro Nanodrop1000 (Thermo Fisher Scientific) y su integridad se determinó 
mediante electroforesis utilizando RNA Nano Chips en el equipo 2100 Bioanalyzer (Agilent 
Technologies). El RNA se retrotranscribió a cDNA mediante RT-PCR empleando el kit 
comercial “High-CapacitycDNA Reverse Transcription Kit” (Applied biosystems). El cDNA 
obtenido se empleó como substrato de la qPCR, la cual se llevó a cabo empleando sondas 
Taqman específicas para cada gen de interés (Applied Biosystems) y la master mix 
“TaqMan™ Universal Master Mix II” (Applied biosystems). Se empleó el equipo 7900HT Fast 
Real-Time PCR System (Applied biosystems). La reacción de qPCR se inició con un paso de 
desnaturalización a 95ºC durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 
95ºC durante 15 segundos y alineamiento y elongación a 60ºC durante 1 minuto. Los valores 
de expresión de ARNm se normalizaron con respecto a la expresión del gen de referencia 
GUSB, expresado de forma constitutiva, mediante comparación de los valores CT. Se 
emplearon las sondas para los genes PGK1, GYS1, NANOG, OCT4 y CDCA7. 
7. Western blot 
 
Se obtuvieron extractos de proteína mediante lisis de pellets celulares con tampón de lisis 2X 
(125 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, 20% glicerol). La concentración de proteína obtenida se 
determinó mediante el método de Lowry (DC Protein Assay Reagent kit, Bio-Rad 500-0116). 
Las proteínas se separaron en geles de poliacrilamida al 7% en condiciones desnaturalizantes 
(SDS-PAGE), cargando 50 μg de proteína por pocillo. Posteriormente se realizó transferencia 
a membrana de nitrocelulosa (AmershamTM ProtranTM 0,45 μm NC; GE Health Care Life 
Science) durante 30 min. La membrana se bloqueó con una solución de leche desnatada al 
5% en TBS a temperatura ambiente durante 30 minutos. La incubación con anticuerpos 
primarios se realizó durante la noche a 4ºC. Tras lavado con TBS, las membranas fueron 
finalmente incubadas con el anticuerpo secundario durante una hora a temperatura 
Materiales y Métodos 
36 
 
ambiente. Las membranas se revelaron empleando la tecnología Li-COR Odyssey (LI-COR 
Biosciences). Los anticuerpos primarios empleados fueron anti-YAP/TAZ (1:1000, Cell 
Signaling Technology) y anti GAPDH (Sigma-Aldrich). Como secundario se empleó el 
anticuerpo anti-conejo conjugado con IR 680 (1:140000, LI-COR Biosciences). 
8. Tratamiento con BSO, NAC y Z-VAD 
 
Se preparó un stock inicial del inhibidor específico e irreversible de GCL, L-Butionina-
sulfoximina (BSO, Sigma-Aldrich-Merk), a 10 mM en medio RPMI. Para el tratamiento de las 
células se añadió al medio de cultivo a una concentración final de 50 μM. La N-acetil-L-
cisteína (NAC, Sigma-Aldrich-Merk), antioxidante precursor de la síntesis de glutatión, se 
preparó en medio RPMI a una concentración de 180 mM, ajustando el pH a 7,4. Se empleó 
en tratamiento a una concentración final de 5 mM. El inhibidor de caspasas Z-Val-Ala-DL-
Asp-fluorometilcetona (Z-VAD, Bachem) se preparó a una concentración de 20 mM en DMSO 
y se añadió a las células en cultivo a una concentración final de 80 μM. 
9. Análisis de viabilidad celular 
 
Para determinar la viabilidad de células sembradas en agar blando, con o sin tratamientos, 
se siguieron dos aproximaciones diferentes. Por un lado, se marcaron las células recuperadas 
del agar blando, así como sus respectivos controles en medio líquido con el marcador 
fluorescente de viabilidad celular calcina-AM (Thermo Fisher Scientific) a una concentración 
final de 0.025 μM. Tras incubación de 30 minutos a temperatura ambiente y oscuridad, se 
analizó mediante citometría de flujo la intensidad de fluorescencia de la sonda en las células. 
La otra aproximación consistió en estimar la viabilidad celular mediante citometría de flujo 
en base a las diferencias en tamaño y complejidad que presentan las células viables con 
respecto a las células muertas. Para ello se establecieron previamente las regiones 
correspondientes a células vivas y a células muertas. Se realizó una cotinción de calceína-AM 
y anexina V-PE (BD Biosciences) en células normales, en células sometidas a choque térmico 
(65ºC, 10 minutos) y en una mezcla al 50% de las anteriores. Tras analizar la incorporación 
de ambas sondas mediante citometría de flujo, los datos se volcaron sobre un plot tamaño-
complejidad. 
 
Materiales y Métodos 
37 
 
10. Detección de ROS y GSH por citometría de flujo 
 
Los niveles intracelulares de ROS se evaluaron mediante el uso de la sonda DCFDA (diacetato 
de 2′,7′-dichlorodihydrofluoresceina, Abcam). Dentro de la célula, las esterasas escinden el 
compuesto liberando el fragmento DCF, que es oxidado por las ROS intracelulares emitiendo 
fluorescencia. Las células se incubaron, a una densidad de 1x106 células/ml en 500 μl por 
pocillo de una placa MW24, con DCFDA 50 μM en ausencia de FBS a 37ºC, durante 30 
minutos y en oscuridad. A continuación las células se sembraron a una densidad de 105 
células/ml en medio líquido completo (control) o en agar blando al 0.33% durante 24 horas. 
Las células se recogieron como se ha indicado anteriormente y se analizaron por citometría 
de flujo (Cytomics FC500 MPL, Beckman Coulter). 
Los niveles intracelulares de GSH se detectaron empleando la sonda fluorescente mBCI 
(monoclorobimano, Sigma-Aldrich-Merk). Este compuesto difunde dentro de las células, 
donde se conjuga a GSH, emitiendo fluorescencia. Células sembradas en agar, con o sin 
tratamientos adicionales, y recuperadas como se ha descrito anteriormente, se incubaron 
con mBCI a una concentración final de 10 µM durante 30 minutos a 37ºC y en oscuridad. Las 
células se analizaron por citometría de flujo (FACSCanto II, Becton Dickinson).