Clase enzimas curso bacterias 2019

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Curso de Posgrado
BACTERIAS BENÉFICAS, SUS METABOLITOS Y 
APLICACIONES TECNOLÓGICAS
Enzimas 
Dra. Mirta Daz (mdaz@unsa.edu.ar), Facultad de 
Ciencias Exactas, INIQUI, UNSa.
Dra. María Julia Torres, Facultad de Ciencias Exactas, 
INIQUI, UNSa. 
Dra. Carolina Ibarguren, Facultad de Ciencias de la 
Salud, INIQUI, UNSa.
¿Qué son las enzimas?
Catalizadores de naturaleza proteica que intervienen 
en todas las reacciones sintéticas y degradativas 
llevadas a cabo por los organimos vivos. 
Como cualquier catalizador una enzima disminuye la 
energía de activación de una reacción sin afectar la 
posición de equilibrio y afectando a las reacciones 
directa e inversa en la misma extensión. 
 : Energía de activación de la reacción no catalizada
 : Energía de activación de la reacción catalizada por la 
enzima
Usos de las enzimas
Como productos finales: 
Detergentes
Agentes de limpieza
Industria farmacéutica
Alimentos de animales
Como ayuda en procesamientos:
 
Industria textil
Industria del cuero
Industria de pulpa y papel
Industria de azúcar
Industria del café
En la producción de alimentos y bebidas:
 
Industria lechera
Industria de la cerveza
Industria del vino y jugos
Industria de alcohol
Industria de proteínas
Industria de la carne
Panificación
Industria de grasas y aceites
Como catalizadores industriales: 
Industria del procesamiento de almidón
Industria de antibióticos
Industria de química fina
Estructura de la enzimas: 
Todas las enzimas contienen un esqueleto proteico. En 
algunas enzimas éste es el único componente en la 
estructura.
Algunas enzimas tiene partes no proteicas que pueden 
o no participar en la actividad catalítica, como por ej. 
grupos carbohidratos unidos covalentemente que 
afectan la estabilidad y solubilidad.
Otros constituyentes importantes de las enzimas son 
iones metálicos (cofactores) o moléculas orgánicas de 
bajo peso molecular (coenzimas). Contribuyen a la 
actividad y estabilidad de la enzimas. 
Nomenclature Committee of the International Union of 
Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) 
In consultation with the IUPAC-IUBMB Joint Commission on 
Biochemical Nomenclature (JCBN) 
Enzyme Nomenclature
Recommendations of the Nomenclature Committee of the 
International Union of Biochemistry and Molecular Biology on 
the Nomenclature and Classification of Enzyme-Catalysed 
Reactions
https://www.qmul.ac.uk/sbcs/iubmb/enzyme/
Clasificación de enzimas: 
EC 1 Oxidorreductasas
EC 2 Transferasas
EC 3 Hidrolasas (glicosidasas, lipasas, proteasas)
EC 4 Liasas
EC 5 Isomerasas
EC 6 Ligasas
 
EC 3. Hydrolase Nomenclature
EC 3.1 
Acting on Ester Bonds
EC 3.1.1
Carboxylic Ester Hydrolases
Contents: 
EC 3.1.1.1 carboxylesterase
EC 3.1.1.2 arylesterase
EC 3.1.1.3 triacylglycerol lipase
EC 3.1.1.4 phospholipase A2
EC 3.1.1.5 lysophospholipase
EC 3.1.1.6 acetylesterase
EC 3.1.1.7 acetylcholinesterase
EC 3.1.1.8 cholinesterase
EC 3.1.1.3
Accepted name: triacylglycerol lipase
Reaction: triacylglycerol + H2O = diacylglycerol + a carboxylate
Other name(s): lipase; triglyceride lipase; tributyrase; butyrinase; glycerol ester hydrolase; 
tributyrinase; Tween hydrolase; steapsin; triacetinase; tributyrin esterase; Tweenase; amno N-
AP; Takedo 1969-4-9; Meito MY 30; Tweenesterase; GA 56; capalase L; triglyceride hydrolase; 
triolein hydrolase; tween-hydrolyzing esterase; amano CE; cacordase; triglyceridase; 
triacylglycerol ester hydrolase; amano P; amano AP; PPL; glycerol-ester hydrolase; GEH; meito 
Sangyo OF lipase; hepatic lipase; lipazin; post-heparin plasma protamine-resistant lipase; salt-
resistant post-heparin lipase; heparin releasable hepatic lipase; amano CES; amano B; 
tributyrase; triglyceride lipase; liver lipase; hepatic monoacylglycerol acyltransferase
Systematic name: triacylglycerol acylhydrolase
Comments: The pancreatic enzyme acts only on an ester-water interface; the outer ester links 
are preferentially hydrolysed.
Links to other databases: BRENDA, EXPASY, GTD, KEGG, Metacyc, PDB, CAS registry number: 
9001-62-1
References:
1. Korn, E.D. and Quigley, T.W. Lipoprotein lipase of chicken adipose tissue. J. Biol. Chem. 226 
(1957) 833-839.
2. Lynn, W.S. and Perryman, N.C. Properties and purification of adipose tissue lipase. J. Biol. 
Chem. 235 (1960) 1912-1916.
[EC 3.1.1.3 created 1961]
EC 3.2 Glycosylases
EC 3.2.1 Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl 
compounds
EC 3.2.1.1 α-amylase
EC 3.2.1.2 β-amylase
EC 3.2.1.3 glucan 1,4-α-glucosidase
EC 3.2.1.4 cellulase 
EC 3.2.1.5 deleted
EC 3.2.1.6 endo-1,3(4)-β-glucanase
EC 3.2.1.7 inulinase
EC 3.2.1.8 endo-1,4-β-xylanase
EC 3.2.1.9 deleted
EC 3.2.1.10 oligo-1,6-glucosidase
EC 3.2.1.11 dextranase
EC 3.2.1.12 deleted, included in EC 3.2.1.54
EC 3.2.1.13 deleted, included in EC 3.2.1.54
EC 3.2.1.14 chitinase
EC 3.2.1.15 polygalacturonase
EC 3.2.1.16 deleted
EC 3.2.1.1
Accepted name: α-amylaseamylase
Reaction: Endohydrolysis of (1→4)-amylaseα-amylaseD-amylaseglucosidic linkages in polysaccharides 
containing three or more (1→4)-amylaseα-amylaselinked D-amylaseglucose units
Other name(s): glycogenase; α amylase, α-amylaseamylase; endoamylase; Taka-amylaseamylase A; 
1,4-amylaseα-amylaseD-amylaseglucan glucanohydrolase
Systematic name: 4-amylaseα-amylaseD-amylaseglucan glucanohydrolase
Comments: Acts on starch, glycogen and related polysaccharides and oligosaccharides 
in a random manner; reducing groups are liberated in the α-amylaseconfiguration. The term ‘α’ α’ 
relates to the initial anomeric configuration of the free sugar group released and not to 
the configuration of the linkage hydrolysed.
Links to other databases: BRENDA, EXPASY, GTD, KEGG, PDB, CAS registry number: 
9000-amylase90-amylase2
References:
1. Fischer, E.H. and Stein, E.A. α-amylaseAmylases, in Boyer, P.D., Lardy, H. and Myrbäck, K. 
(Eds.), The Enzymes, 2nd edn., vol. 4, Academic Press, New York, 1960, pp. 313-amylase343.
Cambios en las concentraciones de sustrato y 
producto en función del tiempo de reacción 
La velocidad de la reacción (pendiente de las curvas) 
decrece con el tiempo. Alguna causas: 
La enzima se inactiva durante el curso de la reacción.
La reacción inversa se vuelve más importante a medida 
que se acumula el producto.
El producto de la reacción inhibe a la enzima. 
Determinación de velocidades iniciales
Se obtiene de las pendientes de las curvas por regresión lineal
 Muy a menudo los investigadores 
usan un solo punto para 
determinaciones de velocidades 
lo que puede conducir a medidas 
incorrectas. 
 Las velocidades iniciales deben 
obtenerse de las curvas del 
progreso de la reacción. 
 Estas curvas dependen de pH, 
temperatura fuerza iónica, tipo de 
sustrato, concentraciones de 
enzimas y de coenzima, etc. 
Para una medida de actividad correcta:
La enzima debe permanecer estable durante el tiempo de 
medición usado para calcular las velocidades iniciales 
La velocidad de la reacción debe ser proporcional a la 
concentración de enzima 
 Cuando esta relación no es lineal , es necesario usar una 
concentración de enzima que produzca una velocidad 
prefijada (ejemplo: FPU estandarizadas por IUPAC para 
celulasas) 
Unidad de enzima : se define como la “cantidad” (amount) de 
enzima que produce la desaparición de un micromol de sustrato 
(o la aparición de un micromol de producto) por minuto bajo 
condiciones determinadas.
1U = 1µmol / min
La unidad del SI es el katal
1kat = 1mol/s
1kat = 6.107 U
A veces se usan unidades arbitrarias, por ejemplo basadas en 
cambiós físicos que produce la enzima tal como una disminución 
de viscosidad. 
Nota: si el sustrato es por ejemplo un polisacárido y la enzima una 
glicosidasa la unidad de refiere al número de uniones hidrolizadas 
por unidad de tiempo. 
Actividad específica : se define como el número de unidades de 
enzima por unidad de masa (masa de enzima pura, cantidad de 
proteína de un aislado, masa total del tejido de donde fueobtenida la enzima, masa de polvo de una enzima comercial, etc) 
Se debe establecer claramente qué masa se usó. 
Cuáles son las condiciones para medir actividad?
Generalmente se refiere a las condiciones óptimas con respecto a 
pH , fuerza iónica, temperatura, concentración de sustrato, 
presencia y concentración de cofactores y coenzimas.
Estas condiciones varían entre laboratorios y entre proveedores.
Cuáles son las condiciones óptimas, cómo elegirlas?
 
Cinética enzimática: Modelo de Michaelis and Menten 
Equilibrio rápido: se supone que la reacción de formación del 
complejo ES está en equilibrio y la etapa determinante de la 
velocidad es la de ruptura del complejo ES (k-amylase1 >> k2 ) 
(v = k2 [ES])
Estado estacionario: se supone que la concentración del 
complejo ES es invariante con el tiempo 
 Si se cumple : entonces
Gráfico v vs [S]: hipérbola rectangular
Km = [S] correspondiente a una velocidad igual a la mitad de la 
velocidad máxima.
Sólo cuando Km es igual a la constante de disociación 
del complejo ES y en ese caso se interpreta como una medida de 
la afinidad de la enzima por el sustrato. 
A menor Km mayor afinidad 
Determinación de Km y Vmax
1) Midiendo velocidades iniciales para un amplio rango de 
concentraciones de sustrato.
El uso de velocidades iniciales asegura que la [S] es la 
concentración inicial conocida y que la reversibilidad y la 
inhibición por producto se pueden considerar despreciables.
Durante el período de medición
Mucho cuidado si se usa un 
solo punto!!
Es especialmente importante a 
bajas [S]. 
En la práctica se puede tolerar 
hasta un 5-amylase10 % de desaparición 
de S. 
Significado de las constantes :
1) Km es una constante característica de la enzima y sustrato y 
de las condiciones del entorno (pH, temp, fuerza iónica, etc.)
Valores : 10-amylase1 – 10-amylase7 M
La ecuación de Michaelis–Menten se puede aplicar también a 
reacciones con mecanismos más complejos que el descripto. 
En ese caso Km probablemente será una relación de constantes 
de velocidad mucho más compleja, pero se suele interpretar 
como una medida de la afinidad por el sustrato
2) kcat : número de recambio (turnover number) de una enzima y 
representa el número de moléculas de sustrato convertidas a 
producto por una molécula de enzima por unidad de tiempo 
cuando la enzima está totalmente saturada con el sustrato
Vmax = kcat [ET] 
Efecto del pH en la velocidad de reacción enzimática
Efecto de la temperatura en la actividad enzimática
En condiciones de saturación: 
A T bajas: v = k2 [ET] Actividad: k2 = A2 exp (-amylaseEa / RT) 
A T altas: E  D KD = [D] / [E] inactivación térmica reversible
[ET] = [E] + [D] = [E] (1 + KD) 
Actividad : k2 = v / [ET] = k2 / (1+KD) 
Actividad: A2 exp (-amylaseEa / RT) / ( 1 + AD exp(-amylaseED/RT) 
Selección de condiciones para la medida de actividad
Selección del pH: en el valor óptimo
Selección de temperatura: cercana pero debajo de la 
temperatura óptima. 
Selección de la concentración de sustrato: debe seleccionarse 
de manera tal que la velocidad sea lo más cercana posible a Vmax 
(los errores en la [S] por preparación no afectan la medida) 
Se deben medir velocidades iniciales (la enzima permanece 
estable, reversibilidad e inhibición despreciables)
La velocidad debe ser proporcional a la [E] o se debe fijar un 
porcentaje de reacción y medir siempre al mismo. 
Fuerza iónica controlada
Tener en cuenta detalles experimentales (metales pesados, 
formación de espuma, suciedad, reactivos de buena calidad, etc) 
Preparación de enzimas para su uso
Fuentes de enzimas
Las enzimas actualmente utilizadas por la industria proviene de 
hongos, levaduras y bacterias. Muy pocas de animales y plantas. 
Se prefieren las de origen microbiano por: 
Son más baratas para producir
La cantidad de enzima es más predecible y controlable
Existe materia prima confiable de composición constante para la 
producción
Los tejidos de animales y plantas pueden ser peligrosos
La gran mayoría de la enzimas microbianas provienen de un 
número limitado de géneros: 
Aspergillus species
Bacillus species
Kluveromyces species
Los productores y consumidores de enzimas buscan: 
Economía
Efectividad 
Seguridad
Esto implica:
Cepas que produzcan una enzima constitutiva y la segreguen 
en el medio de crecimiento (enzimas exo celulares). Si la enzima 
es inductiva, que el inductor sea rápido y barato.
Microorganismos seguros
El consumidor busca una enzima estable en el proceso y en el 
almacenamiento.
Tanto el productor como el usuario buscan que haya mínimo 
peligro tanto en el manejo como en el consumo del producto. 
La preparación de una enzima requiere de las siguientes etapas: 
Screening para buscar enzimas nuevas o mejoradas, o bien para 
decubrir qué enzimas es capaz de producir una cepa. 
Producción de la enzima (optimización del proceso)
Purificaciones adecuadas para el uso.
Estabilidad y estabilización de enzimas
La estabilidad de enzimas y proteínas in vitro es todavía una 
cuestión crítica en Biotecnología. 
Estabilidad de almacenamiento se refiere al mantenimiento de 
la actividad catalítica de la enzima en el período entre la 
manufactura y el uso. 
Estabilidad operacional describe la persistencia de la actividad 
catalítica durante un proceso, es decir bajo condiciones de uso de 
la enzima. 
Agentes que pueden afectar la estabilidad de una enzima 
 Temperaturas altas 
 Temperaturas bajas 
 Congelamiento 
 Liofilización 
 Presencia de proteasas 
 pHs extremos
 Oxígeno
 Calidad del solvente 
 Agentes específicos desnaturalizantes (detergentes,urea,etc.)
 Presiones altas
 Adsorción
 Estrés de corte
 Metales pesados
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