03_Cap 3_Modulo10

Vista previa del material en texto

capítulo
 3
APLICACIÓN DE 
TÉCNICAS DE 
RADIOINMUNOANÁLISIS
????
Sumario
1. Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis
2. Concepto y fundamentos teóricos de los inmunoanálisis
3. Fundamentos teóricos de los radioinmunoanálisis
4. Recepción, conservación y almacenamiento de muestras 
biológicas
5. Reactivos principales: anticuerpos, trazadores, calibradores 
y métodos de separación de las fracciones unida y libre
6. El procedimiento analítico
7. Contadores de pozo. Características
8. El control de calidad del radioinmunoanálisis
9. Conclusión
80 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
1. APLICACIÓN DE TÉCNICAS 
DE RADIOINMUNOANÁLISIS
Gran parte del progreso alcanzado por la biología y la medicina actua-
les se debe al perfeccionamiento de los métodos analíticos de medi-
da. La introducción de los procedimientos basados en las reacciones 
inmunológicas ha representado un importante avance en el análisis de 
las sustancias de interés biológico, difíciles de medir empleando los 
métodos bioquímicos habituales. Dentro de los procedimientos inmu-
nológicos, los más útiles y prácticos son aquellos que se basan en la 
especifi cidad de la unión antígeno-anticuerpo (Ag-Ac). Existen diversos 
métodos basados en procedimientos distintos para visualizar la unión 
Ag-Ac (Tabla 1). El RIA es uno de los principales y permite el análisis 
cuantitativo de sustancias biológicas (proteínas séricas, hormonas y 
otras de índole variada, como ácido fólico, vitamina B12, eritropoyetina, 
interferones, endorfi nas, etc.) que se encuentran en muy baja concen-
tración (del orden de los ng/ml o pg/ml) en diversos fl uidos biológicos 
(sangre, orina, saliva, etc.).
Combina la especifi cidad de las reacciones inmunes (reacción entre antí-
geno Ag y anticuerpo Ac) y la sensibilidad de los métodos radioisotópicos. 
La medicina nuclear no solo se dedica al diagnóstico in vivo por la imagen, sino que también 
tiene una faceta terapéutica (ver capítulo 4 del presente libro) y una faceta de estudios in 
vitro. Estos últimos permiten realizar diagnósticos de bioquímica analítica (análisis clínicos) 
o estudios de la cinética del isótopo radiactivo administrado al individuo a partir de los datos 
obtenidos de muestras biológicas, obtenidas in vivo, pero cuantifi cadas in vitro.
La técnica in vitro más importante es el radioinmunoanálisis (RIA, del inglés radioimmunoas-
say), aunque existen otras técnicas in vitro que se estudian en el libro Técnicas de imagen 
por medicina nuclear.
El RIA combina 
la especificidad 
de las reacciones 
inmunes (reacción 
entre antígeno -Ag- 
y anticuerpo -Ac-) 
y la sensibilidad 
de los métodos 
radioisotópicos.
Método de detección Denominación
Técnica de precipitación 
– Técnica de precipitación propiamente dicha
– Técnica de difusión radial de Ouchterlony
– Técnica de inmunoelectroforesis
– Técnica de difusión radial simple de Mancini
Principales métodos analíticos basados 
en la unión Ag-Ac
TABLA 1
(Continúa en la página siguiente)
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 81
2. CONCEPTO Y FUNDAMENTOS 
TEÓRICOS DE LOS INMUNOANÁLISIS
El radioinmunoanálisis (RIA) fue desarrollado de forma simultánea por 
Yalow y Berson en Estados Unidos y Ekins en Inglaterra a fi nales de los 
años 50 del pasado siglo XX (Figura 1).
Método de detección Denominación
Técnica de aglutinación 
– Técnicas de inmunoaglutinación 
(hemaglutinación directa e indirecta y otras 
técnicas con látex, etc.)
Técnica de inmunofl uorescencia
– Técnicas inmunofl uorimétricas y citometría 
de fl ujo
Técnica de inmunoensayo
– Técnicas inmunorradiológicas 
(radioinmunoensayo RIA y ensayo 
inmunorradiométrico IRMA)
– Técnicas inmunoenzimáticas: ELISA, EIA
Cromatografía de afi nidad
Inmunoprecipitación e 
inmunoblotting
– Técnicas nefelométricas
Principales métodos analíticos basados 
en la unión Ag-Ac
TABLA 1
Yalow y Berson 
desarrollaron el RIA 
competitivo en 1960 
y Miles desarrolló el 
IRMA en 1968.
Figura 1. Los padres del RIA: Rosalyn S. Yalow y Solomon 
A. Berson. 
Previamente, Ekins había desarrollado el concepto de análisis de satu-
ración en el que la cantidad de una sustancia problema se hace reac-
cionar con una cantidad limitada de un reactivo con el que se combina 
82 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
de forma específica, de tal forma que el reactivo es saturado por la 
sustancia problema quedando una parte sin reaccionar. De esta for-
ma, tras la reacción, la sustancia problema queda en parte en una for-
ma combinada y otra no combinada o libre que se encuentran en una 
determinada proporción, dependiendo de la cantidad inicial de sustancia 
problema. La proporción en que se encuentran ambas fracciones no 
se determina directamente, sino que se hace utilizando una pequeña 
cantidad de sustancia marcada que reacciona de forma similar con el 
reactivo y cuya distribución en forma combinada o libre permite calcular 
la proporción en que estas se encuentran.
Como reactivo de unión específica se pueden utilizar distintas sustan-
cias (proteínas, anticuerpos, receptores citoplasmáticos, receptores de 
membrana celular, etc.) que permiten desarrollar, utilizando además una 
sustancia marcada, diversos tipos de pruebas analíticas denominadas 
respectivamente análisis proteico competitivo, radioinmunoanáli-
sis, análisis de radioligadura y análisis de radiorreceptores.
Posteriormente, en 1968 y ante la posibilidad de marcar el anticuerpo 
sin alterarlo, Miles desarrolló una modalidad de RIA, denominado análi-
sis inmunorradiométrico (IRMA), en el que la proteína de enlace es un 
anticuerpo, está marcado (Ac*) y se añade en exceso. De tal forma que, 
tras la reacción con la sustancia problema, la fracción que no ha reac-
cionado es separada y se determina la actividad de la fracción restante.
A partir del desarrollo del RIA original hubo una verdadera revolución en 
el desarrollo de inmunoanálisis sensibles y ultrasensibles, empleando 
isótopos o sin utilizarlos, que en la actualidad han devenido en una 
amplia variedad de sistemas de inmunoanálisis, cuya base común está 
en la utilización de anticuerpos como reactivo analítico específico.
Los inmunoanálisis pueden subdividirse en dos clases principales: en 
los análisis tipo I se emplea un exceso de anticuerpo sobre el elemento 
analizado y se marca el anticuerpo reactivo; mientras que en los de tipo 
II la cantidad de anticuerpo es menor que la del elemento analizado y 
se marca la sustancia analizada (Tabla 2).
Ensayo tipo I Ensayo tipo II
La sensibilidad máxima se alcanza 
cuando la cantidad de anticuerpo 
tiende al infinito
La sensibilidad máxima se alcanza cuando 
la concentración del anticuerpo tiende a 
cero
Características de los ensayos tipo I y tipo IITABLA 2
(Continúa en la página siguiente)
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 83
Por otro lado, los inmunoensayos pueden ser:
❱ Homogéneos, si el compuesto marcado se comporta de forma dife-
rente según esté libre o ligado y, por tanto, no es necesaria la sepa-
ración física de las dos fracciones.
❱ Heterogéneos, si es necesaria la separación de fracciones, al no 
comportarse de forma diferente. 
Métodos inmunoanalíticos análogos al RIA, pero utilizando marcadores 
enzimáticos (o sus sustratos), compuestos fluorescentes, compuestos 
luminiscentes o quimioluminiscentes sobre el analizado o el anticuerpo 
han dado lugar a una amplia variedad de inmunoensayos denominados 
enzimoinmunoanálisis (EIA) o análisis inmunoenzimático (IEMA), fluo-
roinmunoanálisis (FIA), luminoinmunoanálisis (LIA) o quimioluminoin-
munoanálisis (QIA), respectivamente (Tabla 3 y Figura 2). 
Ensayo tipo I Ensayo tipo II
La sensibilidad teórica del método se 
corresponde a la de una molécula de 
la sustancia a determinar
La sensibilidad teórica máxima es de 
1x10-14 mol/l
Los antígenos de reacción cruzada 
serán equipotentes en un sistema con 
exceso de anticuerpo
El antígeno de reacción cruzada tiene una 
potencia relativa que depende de la tasade constantes de equilibrio de la sustancia 
analizada y dicho antígeno
La reacción Ag-Ac está poco influida 
por sustancias ajenas (sales, urea, 
etc., presentes en la muestra y 
reactivos) 
El análisis está regulado por la constante 
de equilibrio de la reacción entre la 
sustancia determinada, y el anticuerpo y 
la sensibilidad depende de la constante de 
afinidad del anticuerpo
El tiempo de análisis es relativamente 
rápido
La reacción analítica es lenta, ya que debe 
alcanzarse el equilibrio
Modificado de Ekins.
Características de los ensayos tipo I y tipo II TABLA 2
Homogéneo Heterogéneo
Isotópico (RIA)
RIAc 
IRMAnc
Tipos de inmunoensayos TABLA 3
(Continúa en la página siguiente)
84 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
Homogéneo Heterogéneo
Enzimático (EIA) EMIT
ELISAc y nc
MEIA
Fluorogénico (FIA)
FPIAc 
SLFIAc
FETIc
DELFIAc y nc
Luminiscente (LIA)
SPALTc
ICMAnc
c = competivivo; nc= no competitivo
EIA: Enzimo Inmuno Ensayo
EMIT: Enzyme Mediated Immunoassay Technique
FPIA: Fluorescent Polarization Immunossay
SLFIA: Substrate Label Fluorescent Immunoassay
FETI: Fluorescent excitation Transfer Immunoassay
RIA: Radio Immuno Assay
IRMA: Immuno RadioMetric Assay
ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay
MEIA: Microparticle Enzyme assay
DELFIA: Dissociation Enhaced by Lanthanum Fluoro Immuno Assay
SPALT: Solic Phase Antigen Luminescent Technique
ICMA: Immunochemil Immunometric Assay
Tipos de inmunoensayosTABLA 3
Figura 2. Tipos de inmunoensayos.
INMUNOENSAYO
RADIACTIVO NO RADIACTIVO
COMPETITIVO
RIA equilibrio
CPBA
RRA.
NO COMPETITIVO
RIA secuencial
IRMA equilibrio
IRMA secuencial
HETEROGÉNEO
CIA
FIA
ICMA
EIA
ELISA
IEMA
HOMOGÉNEO
CIA
FIA
FPIA
EIA
EMIT
SLFIA
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 85
En el RIA existen dos categorías: radioinmunoanálisis (RIA) com-
petitivo y ensayo inmunorradiométrico o IRMA. El primero es un 
inmunoensayo tipo II que sigue la ley de acción de masas que especifi ca 
las relaciones ente la sustancia problema y el anticuerpo. Los análisis 
inmunorradiométricos (IRMA) son inmunoensayos de tipo I. 
3. FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LOS 
RADIOINMUNOANÁLISIS 
El principio en el que se basa el RIA competitivo, directo, clásico o 
en equilibrio es el siguiente: una cantidad desconocida de sustancia, 
denominada ligando nativo (L), que en RIA se corresponde con la 
sustancia antigénica presente en la muestra que hay que determinar, y 
una cantidad conocida de la misma sustancia antigénica pero marcada 
con el radioisótopo, denominada ligando marcado (L*) o trazador, 
compiten por una limitada cantidad de anticuerpos específi cos (Ac) 
contra los antígenos. Después de una incubación, y de acuerdo con la 
ley de acción de masas, se establece el equilibrio entre las distintas 
fracciones de ligando nativo no marcado (L), ligando marcado (L*), ligan-
dos nativos unidos a anticuerpos (L-Ac) y ligandos marcados unidos a 
anticuerpos (L*-Ac) y anticuerpos libres (Ac) según muestra la reacción 
siguiente (Figura 3): 
L + L* + Ac ç=====è L + L* + Ac + L-Ac + L*-Ac
RECUERDA QUE
Existen dos 
categorías de RIA: 
RIA competitivo y 
RIA no competitivo, 
y como variantes 
del RIA competitivo 
encontramos el RIA 
secuencial y el RIA de 
desplazamiento.
RECUERDA QUE
En el RIA competitivo, 
el ligando nativo (L) 
compite con el ligando 
marcado (L*) por 
unirse al anticuerpo 
(AC). En el RIA no 
competitivo, el ligando 
nativo (L) reacciona 
con dos anticuerpos 
(Ac1 y Ac2*).
Figura 3. Etapas de un RIA competitivo. El Ag y el Ag* compiten por el Ac. Estable-
cido el equilibrio existen formas libres (Ag, Ag*) y formas unidas (Ag-Ac y Ag*-Ac). Se 
separan las fracciones libre y unida, y se cuenta una de las fracciones.
Ag Ag
Ag*
Ag
Ag*Ag*
Ac
Ac
Ac
Ka
Kd
+ +
B = fracción ligada
CONTATAR
F = fracción libre
DESECHAR
Después de separar los ligandos unidos (L-Ac + L*-Ac) (bound, B) de los 
ligandos libres (L + L*) (free, F), se determina la relación existente entre 
ellos (B/F). Con cantidades constantes de ligandos marcados (L*) y de 
anticuerpos (Ac), la fracción de ligandos marcados unidos a anticuerpos 
(L*-Ac) es tanto más pequeña cuanto más elevada sea la concentra-
ción de ligando nativo (L) que exista en la muestra. Por comparación 
86 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
con diferentes estándares (curva de calibración) puede determinarse 
la cantidad desconocida de la sustancia problema. 
Una presentación sobre el fundamento del RIA está disponible en:
http://www.youtube.com/watch?v=xEZew476-GI
Como variantes del RIA competitivo encontramos los RIA de no equi-
librio: RIA secuencial y RIA de desplazamiento. El primero se realiza 
en dos pasos: primero se incuba el ligando nativo (L) con el anticuerpo 
(Ac) en exceso, y después el ligando marcado (L*) para completar la 
saturación del Ac. En el segundo método, se incuba el ligando marcado 
(L*) con el anticuerpo (Ac) y posteriormente se añade el ligando nativo 
(L) que desplaza al ligando marcado del complejo.
En el RIA clásico, la radiactividad presente en el complejo Ag-Ac* (B) 
es inversamente proporcional a la cantidad de ligando nativo (L) o Ag 
de la muestra.
En el caso del IRMA, el ligando nativo (L) reacciona con dos anticuerpos 
(Ac1 y Ac2) que se fi jan a distintas partes (epítopos) del antígeno. Uno 
de los Ac generalmente está fi jado a un soporte sólido (tubo, bolita) 
(Ac1) para facilitar la posterior separación de la fase unida o ligada, y 
el otro es el que está marcado (Ac2*). Después de una incubación se 
produce la reacción siguiente (Figura 4):
L + AC1 + AC2* ß=======à AC1-L-AC2* + AC2*
http://www.youtube.com/
watch?v=xEZew476-GI
Figura 4. Etapas de un RIA no competitivo IRMA. El Ag se une al Ac fi jado en el tubo 
y al 2º Ac marcado por distintos epítopos. Tras la incubación existen formas libres (Ag, 
Ac*) y formas unidas (Ac1-Ag-Ac y Ac1-Ag-Ac*). Con el lavado se separan las fracciones 
libre y unida, y se cuenta la fracción fi jada (unida) al tubo.
Ac
Ac
Ag
AgAc*
Ac*
Ac*
Ka
Kd
++
Como variantes del IRMA tenemos el IRMA competitivo o de inhi-
bición y el IRMA no competitivo tipo sándwich. En el primero, el 
Ag está unido al tubo de reacción, y al añadir tanto la muestra como el 
Ac*, se produce la competición entre los Ag por el Ac*, formándose 
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 87
dos tipos de complejos, el Ac*-Ag del tubo y el Ac*- Ag de la muestra. 
De tal forma que, tras el lavado, la actividad del complejo en fase sólida 
(B) es inversamente proporcional a la cantidad de ligando nativo (L) de 
la muestra. En el segundo método, se dispone de un Ac unido en fase 
sólida (Ac1), y al añadir el Ag de la muestra y un segundo anticuerpo 
marcado (Ac2*), se formaran tantos complejos Ac1-Ag-Ac2* como 
sean posibles, y la actividad presente en el tubo tras el lavado (B) será 
directamente proporcional a la cantidad de ligando nativo (L) existente 
en la muestra. 
4. RECEPCIÓN, CONSERVACIÓN Y 
ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS 
BIOLÓGICAS
Todo proceso analítico se compone, en principio, de tres fases: (1) toma 
de muestra, (2) proceso analítico propiamente dicho y (3) comprobación 
de los resultados analíticos.
La primera fase sirve para obtener una muestra aleatoria (cantidad par-
cial) que puede aceptarse como representativa del espécimen, que es 
el material liquido, sólido o gaseoso que se envía al laboratorio para su 
análisis. Por otro lado, se entiende por muestra la parte del espécimen 
que se utiliza para el análisis.
Cada técnica analítica necesita que la muestra reúna una serie de condi-
ciones. Por ello, se debe conocer qué tipo de muestra (sangre comple-
ta, plasma, suero) es necesaria para una determinación dada, la cantidad 
y las condiciones de extracción y conservación. 
En los análisis de RIA la toma de muestra será, habitualmente, la extrac-
ción de sangre, que se hará mediante venopunción y, en algunas oca-
siones, la recogida de orina; y la muestra, la mayor parte de las veces, 
debe ser de suero o plasma y, algunas veces,de orina. 
Podemos decir que el plasma es la “sangre” a la que le hemos quitado 
las células sanguíneas, mientras que el suero es la “sangre” a la que 
se le han quitado las células sanguíneas y el fibrinógeno, ya que se ha 
dejado coagular. Por tanto, para obtener el plasma hace falta que, al 
extraer la sangre, se añada un anticoagulante (oxalato, citrato o hepari-
na) al tubo de recogida y, posteriormente, separar los dos componentes 
mediante centrifugación. Para obtener el suero hay que dejar que la 
sangre extraída se coagule en el tubo de recogida y, posteriormente, 
proceder a separar los dos componentes mediante centrifugación. Una 
vez separado el suero o el plasma, debemos extraerlo mediante aspi-
http://www.youtube.com/
watch?v=2rYbvmDxEYQ
88 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
ración para colocarlo en tubos de ensayo identificados para su análisis 
o conservación. 
La conservación del material de examen es un problema difícil para un 
laboratorio. El suero y el plasma pueden conservarse hasta 24 horas, sin 
que se presenten modificaciones significativas, si se hace a 4 °C y con 
el recipiente cerrado. En caso de que las muestras de suero o plasma 
pretendan conservarse durante más de 24 horas se deben congelar, ya 
que en caso contrario, hay que contar con el desarrollo bacteriano y la 
propia degradación de la muestra.
Una vez que las muestras han sido preparadas y almacenadas quedarán 
congeladas hasta que se vaya a realizar el proceso analítico. Para reali-
zar este habrá que descongelar las muestras para que estén en estado 
líquido y a temperatura ambiente en el momento de su utilización.
Hay que recordar que todo material de examen que llega al laboratorio 
está potencialmente infectado y constituye un foco de riesgo para el 
personal. Por ello, como principal medida preventiva solo puede reco-
mendarse la máxima limpieza, el uso de guantes y la prohibición de 
comer y beber en el laboratorio. 
5. REACTIVOS PRINCIPALES: 
ANTICUERPOS, TRAZADORES, 
CALIBRADORES Y MÉTODOS DE 
SEPARACIÓN DE LAS FRACCIONES 
UNIDA Y LIBRE
De lo expuesto hasta ahora es fácilmente deducible que en la ejecución 
práctica de un RIA necesitamos una serie de reactivos o componentes 
básicos que, aparte de la muestra, son el trazador, el anticuerpo, los 
estándares que constituyen la curva de calibración y los reactivos para 
efectuar la separación de la fracción libre de la unida, una vez desarro-
llada la reacción.
5.1. El ligando nativo (L)
Hasta ahora, cuando nos hemos referido al ligando nativo lo hemos 
hecho en referencia a la sustancia a determinar. A partir de ahora, al 
utilizar esta denominación nos referiremos, por un lado, a la sustancia 
que queremos determinar en la muestra (Lm) y, por otro, a los patro-
nes o estándares (Lp) que nos van a permitir construir la curva de 
calibración del ensayo y, por tanto, conocer la cantidad de sustancia 
analizada presente en la muestra.
En la ejecución 
práctica de un RIA 
necesitamos una 
serie de reactivos 
o componentes 
básicos: la muestra, 
el trazador, el 
anticuerpo, los 
estándares de la 
curva de calibración 
y los reactivos para 
efectuar la partición.
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 89
En relación con el ligando nativo (Lm) presente en la muestra, no vamos 
a repetir lo indicado previamente en relación con la muestra, aunque sí 
conviene añadir ahora que, en ocasiones, las muestras (suero, plasma, 
orina) no pueden ser utilizadas directamente en el ensayo y deber 
ser sometidas a unos procesos previos como extracción del ligando 
deseado (por ejemplo, en la determinación de la 1-25-hidroxi-vitamina 
D) o hidrolización de la orina (por ejemplo, en la determinación de aldos-
terona en orina).
Los patrones o estándares (Lp) son soluciones de concentraciones 
conocidas frente a las que se van a comparar las muestras y a las que 
se les va a someter al mismo proceso que a las muestras (Figura 5).
RECUERDA QUE
La curva patrón 
o estándar está 
constituida por 
una serie de viales 
de concentración 
conocida de la 
sustancia a determinar 
en el ensayo.
Figura 5. Imagen de un kit comercial de RIA. 
5.2. El ligando marcado (L*)
Como hemos visto previamente, en el RIA clásico el L* es una sus-
tancia similar a la que se quiere determinar, salvo que está marcada 
con un radioisótopo, mientras que en el IRMA es el anticuerpo frente 
a la sustancia a determinar la que está marcada con el radioisótopo. En 
ambos casos, en la rutina diaria lo denominamos trazador o marcada.
El radioisótopo a utilizar para marcar este ligando se elige en función 
de diversos factores como la disponibilidad del antígeno en forma pura, 
fácil reproducibilidad del marcaje, estabilidad del marcaje, etc. Por ello, 
los marcadores radioisotópicos más utilizados son el 125I (para antígenos 
proteicos) y el 3H (para antígenos no proteicos y sobre todo hormonas 
esteroideas), aunque para ensayos concretos pueden utilizarse otros 
90 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
como el 57Co para la determinación de la vitamina B12. El 125I es el radio-
núclido de elección por ser un emisor gamma, tener buena eficiencia 
de contaje y tener un largo periodo de semidesintegración (60 días).
El ligando marcado (ya sea el Ag o el Ac marcados) debe ser de gran 
pureza y tener una alta actividad específica (Bq/g).
Una vez marcado el antígeno con el radionúclido es preciso conocer la 
cantidad de ligando marcado que es necesaria para el ensayo de alta 
sensibilidad, debido a que la cantidad debe ser reducida al mínimo. Esto 
se hace mediante las denominadas curvas de titulación que veremos 
más adelante. 
Por otro lado, se debe valorar su inmunorreactividad del ligando marca-
do ya que su disminución indicaría que ha sufrido algún tipo de degra-
dación durante el marcaje. En la practica rutinaria, la degradación de los 
ligandos marcados se hace perceptible porque en el ensayo aumenta la 
unión inespecífica, que es determinada en cada serie por la inclusión en 
el ensayo de un tubo sin adición de anticuerpos y equivale a la fracción 
de trazador que, en ausencia de anticuerpo en el sistema, se comporta 
de la misma manera que si estuviese unido o ligado al anticuerpo.
5.3. El anticuerpo (Ac)
El anticuerpo empleado en RIA (que en la practica cotidiana del RIA 
clásico se suele denominar antisuero) debe ser altamente específico 
y, pese a ello, ser incapaz de discriminar entre el ligando nativo y el 
ligando marcado, además de tener alta afinidad de combinación, ya que 
la sensibilidad del ensayo depende de esta. 
Para conseguir anticuerpos con alta especificidad y afinidad, la produc-
ción de los mismos debe ser muy cuidadosa. Estos anticuerpos pueden 
ser producidos in vivo (inmunizando a un animal de experimentación 
y obteniendo los anticuerpos generados por el sistema inmune del 
animal) o in vitro, siendo actualmente esta última la más empleada, ya 
que utiliza la técnica del hibridoma, desarrollada por Kohler y Milstein 
en 1975. Esta técnica permite obtener gran cantidad de anticuerpos 
monoclonales y de gran especificidad a partir de células híbridas obte-
nidas por fusión de células linfocíticas B, obtenidas del bazo de ratón 
con células de mieloma de ratón.
Los antisueros deben reunir unas características:
❱ Título de anticuerpo: es aquella dilución del anticuerpo que liga el 
50 % del antígeno marcado (L*) bajo unas condiciones determinadas. 
http://www.youtube.com/watch?v=c_
krTc9M1WU
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 91
Para calcularlo se hacen diluciones seriadas del anticuerpo y se incuba 
con una cantidad fija de antigeno marcado; después de la incubación, 
se separan las fases libre (F) y unidas o ligadas (B) y se realiza el con-
taje para conocer aquella dilución que ligue entre el 30-50 % o bien 
presente un cociente B/F de 0,7-1,5.
❱ Afinidad del anticuerpo: es la fuerza con la que el anticuerpo liga al 
antígeno y normalmente se expresa como constante de afinidad, que 
se define como la inversa de la concentraciónmolar de antígeno que 
liga o satura el 50 % del anticuerpo. La afinidad del anticuerpo puede 
medirse mediante la gráfica de Scatchard o mediante la hipérbola de 
Michaelis-Menten.
❱ Especificidad del anticuerpo: es la capacidad de un anticuerpo de 
distinguir entre varios antígenos de estructuras similares. La especifi-
cidad del anticuerpo se prueba mediante estudios de reacción cruza-
da con otros antígenos de estructura química muy similar o parecida.
5.4. Los métodos de partición
Una vez que se ha establecido la reacción entre el ligando nativo (L), el 
ligando marcado (L*) y el anticuerpo (Ac) formando complejos, las fases 
libres (F) y ligadas (B) deben ser separadas para contar su radiactividad. 
Esta separación es una parte esencial de los RIA y se realiza mediante 
el proceso denominado partición.
Se dispone de múltiples métodos para lograr la partición y su elección, 
que influye poderosamente sobre la ejecución práctica del ensayo. Se 
debe basar en una serie de requisitos. El método ideal debe: (1) con-
seguir una completa separación de la fracción ligada (B) y libre (F), (2) 
que no se vea influenciado por las diversas sustancias presentes en 
la reacción, (3) que sea reproducible, sencillo, barato y técnicamente 
rápido y (4) que no interfiera en la reacción Ag-Ac.
Los numerosos métodos que consiguen estos objetivos se basan en 
las diferentes propiedades fisicoquímicas existentes entre el antígeno 
y el complejo antígeno-anticuerpo y los más empleados son descritos 
a continuación de forma concisa (Tabla 4).
Adsorción del antígeno libre
Carbón activo
Carbón revestido de dextrano
Silicatos (talco, fluorisil) 
Resinas de intercambio iónico
Diferentes métodos para realizar la partición TABLA 4
(Continúa en la página siguiente)
92 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
❱ Métodos de adsorción del antígeno libre: consiste en la adsorción 
del antígeno libre en la superficie porosa de diversas sustancias como 
el carbón activo, carbón revestido de dextrano, silicatos (talco, fluo-
risil) y resinas de intercambio iónico. La separación de ambas fases 
se produce mediante una posterior centrifugación y decantación del 
sobrenadante.
❱ Métodos de precipitación inespecífica del complejo Ag-Ac: con-
centraciones elevadas de sales inorgánicas (SO4NH4, SO4Na2), polieti-
lenglicol (PEG), etanol, etc. atrapan las moléculas de agua de la solu-
ción, insolubilizando el complejo Ag-Ac y precipitando. Como en el 
método anterior, la separación de ambas fases se produce mediante 
una posterior centrifugación y decantación del sobrenadante.
❱ Métodos de precipitación específica del complejo Ag-Ac (método 
del doble anticuerpo y método de la proteína A): el método del 
segundo anticuerpo es la técnica de separación con mayor éxito en 
RIA. Consiste en la adición de un segundo anticuerpo (Ac2) dirigido 
contra el anticuerpo del antisuero (Ac1) de tal forma que se produce 
un complejo Ag*-Ac1-Ac2 que es insoluble y precipita. La separación 
de ambas fases se produce mediante una posterior centrifugación y 
decantación del sobrenadante.
El método de la proteína A es muy similar pero utiliza una proteína 
adosada a la pared celular de la bacteria Estafilococus aureus que se 
une a la región Fc de la IgG humana formando complejos que hacen 
que este precipite y se pueda separar mediante centrifugación y 
decantación.
❱ Métodos de separación en fase sólida: En estos métodos el anticuer-
po está adsorbido o ligado químicamente a una matriz sólida insoluble. 
Precipitación inespecífica del 
complejo Ag-Ac
Sales inorgánicas: SO4NH4, SO4Na2 
Polietilenglicol (PEG)
Precipitación específica del complejo 
Ag-Ac
Método del doble anticuerpo 
Método de la proteína A
Separación en fase sólida
Tubos recubiertos
Bolas recubiertas
Filtración en gel
Cromatografía
Gel de poliacrilamida
Diferentes métodos para realizar la particiónTABLA 4
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 93
Los sistemas más empleados son los tubos revestidos de anticuerpo 
(tubos coated) y los anticuerpos adsorbidos a esferas o discos de plás-
tico. La separación física de las fracciones libre (F) y ligada (B) se hace 
mediante el lavado de los tubos, las bolitas o los discos.
❱ Otros métodos: aunque actualmente menos usados, la separación 
de la fracción unida y libre puede hacerse mediante filtración en gel, 
electroforesis, gel de poliacrilamida, etc.
En definitiva, en la partición se separarán la fracción libre (F) de la unida 
(B) con objeto de poder “contar” una de ellas de forma individualizada.
6. EL PROCEDIMIENTO ANALÍTICO
Aunque en los primeros años de existencia del RIA todos los reactivos 
debían ser creados ex profeso, en la actualidad utilizamos kit comer-
ciales que nos aportan todos los reactivos que hemos descrito en los 
párrafos anteriores y que permiten realizar los ensayos de forma cómo-
da, e incluso semiautomatizar el proceso (Figura 5).
Veamos, a continuación, los distintos pasos en la realización del ensayo, 
que incluye la preparación de la curva de calibración, la dispensación 
de cada una de las muestras problema y reactivos, y el cálculo de los 
resultados.
Todo el proceso de la realización de los ensayos RIA e IRMA puede ser 
realizado mediante un simulador de RIA:
6.1. Preparación de la muestra 
y de los reactivos
Antes de la realización del ensayo la muestra debe ser descongelada, si 
así estaba conservada y almacenada, y puesta a temperatura ambien-
te (¡ojo! hay ensayos en los que las muestras deben estar en otras 
condiciones), los reactivos deben ser reconstituidos, ya que suelen 
venir liofilizados para una mejor conservación hasta su uso y se deben 
identificar los tubos de ensayo.
6.2. Dispensación de los volúmenes 
de muestras y reactivos
En los tubos de ensayo en los que se ejecuta el RIA se dispensarán 
(pipetearán) los diferentes componentes del ensayo: dispensación de 
http://recursostic.educacion.es/
fprofesional/simuladores/web/index.
php?xml=i-sanidad-ria&xsl=simulador-
idiomas
94 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
un volumen determinado de la alícuota de la muestra problema (Lm) o 
de la curva patrón (Lp), de un volumen constante del antígeno marcado 
(L*) y de un volumen del antisuero (Ac).
Como en cualquier método analítico, hay una variabilidad experimental 
debida a numerosos factores (reactivos, aparatos, operador, etc.), por 
lo que todas las determinaciones se harán por duplicado y, además, 
es imprescindible disponer de un “blanco” (en un análisis cuantitativo 
se llama “blanco” a una preparación con la que se pretende evaluar lo 
que de inespecífico tenga el ensayo) en el que se valore la unión no 
específica del antígeno marcado. Se consigue incubando el ligando 
marcado (L*) con suero que no contiene anticuerpo (Ac). En la Tabla 5 
se muestra un esquema de la secuencia del protocolo típico de un RIA.
# Tubo Función
Patrón o 
muestra
Tampón Trazador Anticuerpo
1,2
Actividad 
Total T
------- ------- 100 μL ------
3,4 NSB ----- 100 μL 100 μL -------
5,6 Patrón 0 25 μL ------- 100 μL 100 μL
7,8 Patrón A 25 μL 100 μL 100 μL
9,10 Patrón B 25 μL 100 μL 100 μL
11,12 Patrón C 25 μL 100 μL 100 μL
13,14 Patrón D 25 μL 100 μL 100 μL
15,16 Patrón E 25 μL 100 μL 100 μL
17,18 Control 25 μL 100 μL 100 μL
19,20 Muestra 1 25 μL 100 μL 100 μL
21,22 Muestra 2 25 μL 100 μL 100 μL
… , … … , …
Esquema del protocolo típico de un RIA. 
La curva patrón incluye tubos de actividad total, 
NSB, patrón cero, patrones de concentración 
creciente y, a continuación, 
las muestras problema
TABLA 5
La curva patrón se prepara al mismo tiempo que el análisis de las mues-
tras problema, aplicando la técnica a una serie de tubos que contienen 
cantidades conocidas de la sustancia a determinar (antígeno no mar-
cado patrón Lp) y las mismas cantidades de L* y de Ac que se usan 
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 95
en el análisis: en el primer tubo no hay antígeno no marcado (L), por lo 
que todos los centros de unión del anticuerpo serán ocupadospor el 
antígeno marcado (L*). A este punto de máxima unión del antígeno mar-
cado se llama B0 o Bmáx, que representa la radiactividad máxima que 
se puede unir. Los siguientes tubos tienen concentraciones conocidas 
cada vez mayores de sustancia a determinar: a mayor concentración 
de antígeno no marcado (Lp), menor formación de complejos L*-Ac, ya 
que ambos antígenos compiten por unirse al anticuerpo.
6.3. Incubación
Las condiciones en que se realiza la incubación son muy variadas y 
dependen del ensayo en concreto. La temperatura a la que se produce 
la reacción entre el antígeno y el anticuerpo es muy variable y depen-
de de cada ensayo, aunque en general la unión aumenta conforme la 
temperatura aumenta. Pero como la velocidad de disociación de los 
complejos aumenta más rápidamente con la temperatura que la veloci-
dad de asociación, hay que elegir la más adecuada para cada situación.
Cada ensayo concreto requerirá unas condiciones de incubación espe-
cíficas. 
En general, a temperatura ambiente se incuba cuando se requiere obte-
ner una sensibilidad no muy importante, mientras que si se quiere obte-
ner una alta precisión y reproducibilidad, la incubación suele hacerse a 
temperatura baja y durante largo tiempo.
6.4. Separación de las fracciones libre 
y unida
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, las fracciones libre (F) 
y ligada (B) han de ser separadas, como hemos visto previamente, 
mediante el proceso de partición. Con ello se consigue separar física-
mente la fracción libre (F) de la unida (B) y poder “contarlas” de forma 
individualizada.
6.5. Contaje de la radiactividad 
de las muestras
Una vez separadas las fases, en la mayor parte de los ensayos RIA 
la fracción que se cuenta es la unida (B) y el resultado se expresa en 
cuentas por minuto (cpm) o en múltiples variantes de este. Para leer la 
96 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
radiactividad de la fase ligada se utiliza un contador gamma si el isótopo 
utilizado es 125I o un contador beta en el caso de que se utilice tritio 
3H (ver más adelante como se realiza este contaje en los contadores).
6.6. Cálculo de la curva patrón 
Para poder relacionar los valores de radiactividad obtenidos con la con-
centración de sustancia analizada hay con construir una curva patrón 
que relacione estos parámetros.
Para ello, los resultados de las medidas obtenidas con los diferentes 
patrones o estándares se relacionan con las concentraciones conocidas 
y reales de dichos patrones, con objeto de obtener una gráfi ca que no 
es más que la representación de la relación matemática existente entre 
la variable dependiente (concentración) y la independiente (radiactividad). 
El cálculo de la curva patrón se puede hacer de forma manual o utili-
zando un ordenador, siendo esta última la más utilizada ya que, en la 
actualidad, tanto los contadores gamma como los beta disponen de 
programas informáticos para hacer todos los cálculos de forma automá-
tica, representar la curva patrón y leer en ella las muestras problema, 
mostrando directamente los resultados fi nales del análisis.
De todas maneras, vamos a ver cómo se hace el cálculo de forma 
manual para el RIA clásico o competitivo. Para el ajuste manual de la 
curva se representan los resultados obtenidos con la curva estándar 
o patrón (radiactividad) frente a las concentraciones reales de dichos 
patrones. De esta forma, obtendremos una curva de distinta morfología 
en función del tipo de escala (lineal o logarítmica) que utilicemos en la 
representación. Se pueden utilizar tres tipos de representación: (1) gráfi -
ca directa, (2) gráfi ca semilogarítmica y (3) gráfi ca logarítmica (Figura 6).
RECUERDA QUE
El contaje de la 
radiactividad se hace 
en contadores de 
centelleo que pueden 
ser contadores 
gamma (para el 125I, 
57Co) o contadores 
beta (para el 3H).
Figura 6. Tipos de representación gráfi ca de la curva patrón: (a) gráfi ca directa, (b) gráfi ca semilogarítmica 
y (c) gráfi ca logarítmica.
Log concentración Ag Log concentración Agconcentración Ag
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 97
❱ En la representación gráfi ca directa se representa la radiactividad 
obtenida en el complejo unido (B) (L*-Ac) (expresada como Ag*-Ac 
o B, Ag* o F, Ag*-Ac/Ag* o B/F, %Ag*-Ac o %B, %Ag* o %F, etc.) 
frente a la concentración de L. En esta representación se obtiene una 
curva hiperbólica (Figura 6a).
❱ En la representación semilogarítmica se representa cualquiera de 
los parámetros ya citados frente al logaritmo de la concentración 
de antígeno empleada. En esta representación se obtienen curvas 
sigmoideas con una zona lineal en su centro (Figura 6b).
❱ En la representación logarítmica se representan los logaritmos de los 
parámetros antes descritos y proporciona gráfi cos en líneas rectas 
(Figura 6c).
Tanto los métodos manuales como los automáticos ajustan la curva de 
calibración mediante diversas aproximaciones matemáticas, obtenién-
dose curvas hiperbólicas, sigmoidales, recíprocas, linearización logit-log 
(que es el método de ajuste más utilizado), ajuste spline o modelo de 
cuatro parámetros logísticos.
La forma de la curva patrón va a ser distinta en el RIA clásico y sus 
variantes respecto a la obtenida 
en el IRMA. En el RIA clásico, 
al representar la curva patrón la 
relación entre la concentración y 
la radiactividad de la forma uni-
da, al aumentar la concentración 
problema (L) la cantidad de L*-
Ac (B) que se forma disminuye 
y la forma de la curva será des-
cendente (Figura 7), mientras 
que en el IRMA, a mayor con-
centración problema (L) mayor 
es la cantidad de Ac1-L-Ac2* 
(B) que se forma, la curva será 
ascendente (Figura 7).
La forma de la curva patrón 
depende de tres factores: (1) 
concentración del anticuerpo, 
(2) constante de afinidad del 
anticuerpo y (3) concentración 
total del antígeno o ligando mar-
cado. Estos tres elementos son 
Figura 7. Lectura en la curva patrón. Para obtener la concentración de la sustancia 
determinada en la muestra se calcula interpolando en la curva patrón la medida de 
radiactividad obtenida para el tubo problema. La curva de línea continua representa la 
curva obtenida en el RIA clásico, mientras que la curva de línea discontinua muestra la 
curva obtenida en IRMA. La lectura de la concentración problema se hace interpolando 
sobre la curva el valor de la actividad ligada (% Ac-Ag* en el RIA competitivo y % Ac* 
en el IRMA) y leyendo la concentración en el eje de abscisas.
concentración Ag
100
98 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
interdependientes entre sí y la concentración de cada uno de ellos debe 
establecerse durante el diseño del ensayo, de tal forma que permitan 
una determinación en condiciones optimas, permitiendo obtener RIA 
de alta sensibilidad, con rangos de dosifi cación más o menos amplios 
y con cantidades de ligando marcado que sean fácilmente medibles. 
6.7. Lectura de los resultados
Obtenida la curva de calibración, la lectura de la concentración de la 
sustancia determinada en la muestra se calcula interpolando en la curva 
patrón la medida de radiactividad obtenida para cada tubo problema 
(Figura 6).
En la actualidad y, dado el predominio de los ensayos de tipo IRMA, 
es posible automatizar o semiautomatizar todo el proceso descrito del 
ensayo. Para ello se utilizan equipos como el RIA-Mat® mostrado en 
la Figura 8, que consta de diversos módulos que permiten la dispen-
sación automática de los reactivos y las muestras, la incubación, el 
lavado de los tubos, el contaje de la radiactividad de cada uno de los 
tubos, la creación de la curva patrón y la lectura de cada una de las 
muestras. Con ello, la labor del Técnico queda reducida a colocar los 
reactivos y muestras en unas posiciones predeterminadas, programar 
el equipo, supervisar las tareas programadas y, fi nalmente, recoger 
los resultados. 
Figura 8. Equipo RIA-mat® para realización semiautomática de los ensayos IRMA. El 
equipo consta de varios módulos para la dispensación de reactivos y muestras,incuba-
ción, lavado de los tubos y contador gamma, además de un ordenador para el cálculo 
y representación de la curva patrón y la lectura de las muestras. 
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 99
6.8. Control del ensayo
En cada ensayo se debe realizar el control de la ejecución y de los resul-
tados. Estos controles cotidianos pueden realizarse utilizando muestras 
de control y a través del análisis de la curva patrón.
En el primer caso se utilizan muestras de control obtenidas comercial-
mente (control externo) o preparadas de sueros control en el propio 
laboratorio (control interno).
La evaluación de la curva control utiliza una serie de parámetros, como 
cuentas totales, unión no específica, asociación máxima (Bo/T), inter-
sección en la curva para una unión del 10, 50 y 90 % ( 10 %B/Bo, 50 
% B/Bo y 90 % B/Bo), pendiente de la curva y coeficiente de varia-
ción. Estos parámetros deben mantenerse constantes en evaluaciones 
repetidas y son índices del estado y comportamiento de los distintos 
reactivos, condiciones ambientales, equipos y técnicas usadas en los 
procedimientos.
7. CONTADORES DE POZO. 
CARACTERÍSTICAS
Nuestros sentidos no pueden percibir la radiación. Por eso necesitamos 
recurrir a equipos que puedan detectarla y, además, permitan conocer 
su intensidad y energía, ya que conocer su intensidad nos permite 
discriminar entre la mayor o menor existencia de sustancia radiactiva 
y conocer su energía nos permite discriminar la radiación primaria de 
la radiación dispersa.
Los equipos que permiten detectar y medir las emisiones radiactivas 
se denominan contadores y la detección de la radiación se basa en 
los efectos que, directa o indirectamente, produce esta al atravesar 
la materia (interaccionar con la materia). Es decir, no detectaremos 
la radiación, pero sí sus efectos, y estos nos permiten detectarla y 
medirla. 
Existen multitud de tipos de contadores en función de tipo de radiación 
que pueden detectar, el mecanismo de detección y el tipo de utilización 
o uso del detector. 
En RIA se utilizan los contadores centelleo que están basados en la 
propiedad que tienen algunas sustancias de ser fluorescentes. Es decir, 
la propiedad de emitir en forma de luz la energía absorbida procedente 
de la radiación. Los fotones de la radiación incidente ceden su energía 
100 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
a electrones de los átomos del material fl uorescente saltando a un 
orbital de mayor energía. Como esta situación es inestable, el electrón 
regresa a su órbita inicial emitiendo el remanente energético en forma 
de fotón de luz visible.
Dependiendo de la naturaleza del sistema fl uorescente empleado, los 
detectores de centelleo pueden ser de dos tipos: de centelleo sólido 
o de centelleo líquido.
7.1. Detectores de centelleo sólido: contador 
gamma
El material fluorescente que se utiliza habitualmente en medicina 
nuclear es un cristal de yoduro sódico activado con talio INa(Tl). Cuando 
la radiación llega al cristal, se produce un efecto fotoeléctrico, se pone 
fi n al fotón incidente y la energía depositada permite la fl uorescencia 
del talio que, a su vez, emite los fotones luminosos. Estos fotones 
luminosos son recogidos por un fotocátodo creando una señal eléctrica 
medible tras ser amplifi cada por unos tubos fotomultiplicadores. Esta 
señal eléctrica medible es, en último termino, la que permite obtener 
la información necesaria.
Este tipo de detectores está especialmente indicado para el contaje 
de emisiones gamma γ y por ello también se les denomina contador 
gamma, ya que es absolutamente necesario que la radiación sea pene-
trante para alcanzar el cristal (Figura 9).
Figura 9. Imagen de un contador gamma. 
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 101
Para el contaje de la muestra radiactiva en este tipo de contador solo es 
necesario colocar la muestra en el interior del cristal de centelleo que 
tiene forma de pozo, y de aquí que también se denominen contadores 
de pozo. Para colocar la muestra en el interior del pozo se utiliza un 
tubo de ensayo o tubo de contaje.
7.2. Detectores de centelleo lÍquido: 
contador beta
Dado que las emisiones beta β tienen escaso poder de penetración, 
el centelleo sólido no permite detectarlas adecuadamente, ya que no 
alcanzarían el detector. Para solventar este inconveniente se recurre 
a la utilización de sustancias líquidas centelleantes y que, mezcladas 
con la muestra, permiten detectar la radiación emitida por esta. Estos 
contadores, por lo indicado, se denominan contador beta o contador 
de centelleo líquido (Figura 10).
Figura 10. Imagen de un contador beta de centelleo líquido.
Para el contaje de una muestra radiactiva en este tipo de contador se ha 
de preparar una disolución de la misma en un disolvente apropiado y añadir 
uno o varios líquidos centelleadores (denominados fl uoróforos primario y 
secundario) para formar una mezcla (conocida con el nombre de cocktail 
de contaje o de centelleo), que es el que realmente se introduce en el 
detector en el interior de un recipiente que denominamos vial de contaje.
102 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
El sistema funciona de la siguiente manera: la energía de la radiación 
emitida por la muestra es captada por el disolvente, que emitirá un 
fotón de luz que será captado, a su vez, por el fl uoróforo primario. El 
fl uoróforo primario emitirá un fotón de luz de diferente longitud de 
onda, que será captada por el fl uoróforo secundario, y que a su vez, 
emitirá un fotón de luz con una longitud de onda a la que sea sensible 
el fotocátodo del detector. El resto del sistema es similar al descrito en 
el contador gamma. 
El disolvente a utilizar, aparte de ser fl uorescente, debe ser aquel que 
permita la adecuada disolución de la muestra, como son el tolueno, dio-
xano, naftaleno, etc. Como fl uoróforo primario se suele utilizar el PPO 
(2,5-difeniloxazol) y como fl uoróforo secundario el POPOP (1,4-di-[2-(5-
feniloxazol)]-benceno. Pero existen muchos otros.
7.3. Valoración y consideraciones 
en la medida de la radiactividad
Cuando utilizamos un contador y efectuamos una medida de la radiac-
tividad, el contador nos proporciona un valor o una actividad relativa, 
pero se trata de una actividad observada sobre la que inciden una serie 
de factores que vamos a describir.
❱ Canal de contaje: en cualquier detector la energía de la emisión 
radiactiva se convierte en un impulso eléctrico denominado pulso. La 
intensidad de este pulso depende de la energía de la emisión emi-
tida y, como consecuencia de ello, el contaje de la actividad de una 
muestra consistirá en la medida del número de pulsos registrados 
por unidad de tiempo, que se expresará en cuentas por minuto (cpm).
Como, previo al registro, cada pulso es analizado por un dispositi-
vo eléctrico del contador que constituye el denominado canal de 
contaje (formado por tres elementos: dos discriminadores y un cir-
cuito de anticoincidencia), cada canal de contaje permite el contaje 
de emisiones con energía comprendida entre los límites fi jados por 
los discriminadores de tal forma que ajustando adecuadamente los 
valores, detectaremos exclusivamente los pulsos originados por las 
emisiones radiactivas de un determinado radionúclido.
❱ Actividad de fondo: la actividad de fondo es aquella medida de 
radiactividad que el contador detecta incluso en ausencia de radiacti-
vidad. Se debe a la radiación ambiental, la inestabilidad de los circuitos 
electrónicos o al ruido térmico del equipo contador. Siempre existe 
una actividad de fondo inevitable, por lo que para calcular la actividad 
neta de la muestra habrá que restarla a la actividad bruta de la misma, 
RECUERDA QUE
Los factores que 
inciden sobre 
la medida de la 
radiactividad en un 
contador son: canal 
de contaje, actividad 
de fondo, tiempo 
muerto, estadística 
de contaje, eficiencia 
del contador y la 
desactivación, 
autoextinción o 
quenching.
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 103
teniendoen cuenta que cuanto mayor sea la actividad de la muestra, 
menos trascendencia tendrá la actividad de fondo.
La forma practica de calcular o contar el fondo consiste en contar viales 
similares a los que después se emplean en el contaje de las muestras, 
ya sean vacíos o con agua para el contaje gamma, o conteniendo el cóc-
tel de centelleo en el contaje beta. El contaje del tubo vacío no debería 
dar más de una 70 cpm, ya que un fondo mayor indicaría contaminación 
de la fuente por isótopos, vial o tubo contaminado, situación inapropiada 
del contador o posible fallo de la electrónica del contador.
❱ Tiempo muerto: todo contador necesita un tiempo mínimo para 
poder discernir entre dos pulsos eléctricos consecutivos. Este tiempo 
se denomina tiempo muerto y supone que si durante dicho periodo 
de tiempo se produjese la llegada de una nueva emisión radiactiva, el 
contador no la detectaría y, por tanto, la medida estaría afectada por 
un error que se denomina por pérdida de coincidencia. 
Los contadores suelen tener unos tiempos muertos de unos 10 µseg y 
la pérdida de contaje suele no ser trascendente para los contajes habi-
tuales pero habrá que tenerlo en cuenta para actividades importantes.
❱ Estadística de contaje: dado que la desintegración radiactiva es 
un fenómeno probabilístico (estadístico), la medida repetida de una 
muestra de radiactividad no siempre arroja el mismo valor. Por ello, 
las muestras deben ser contadas durante un tiempo tal que el error 
relativo entre ellas sea muy similar.
Para conseguir que el error estadístico en el contaje de las muestras 
sea el deseado por nosotros podemos utilizar la siguiente fórmula:
T = 104. K2/ e2. R
Donde T es el tiempo de contaje, K es el nivel de confianza del inter-
valo, e es el error estadístico deseado y R es la actividad relativa de 
la muestra.
En general, el error de contaje de las muestras suele ser del 1 %.
❱ Eficiencia del contador: la eficiencia de un contador es el número 
de cuentas registradas por el contador comparadas con el número 
de emisiones de la fuente. 
Cada contador se calibra inicialmente para cada uno de los núclidos 
mediante un patrón que tenga un esquema de desintegración similar 
y una vida media larga. Esta calibración quedará registrada y, con 
cada análisis, se medirá el patrón y se comparará con dicho valor. 
104 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
Si los resultados varían más de 2 desviaciones típicas se deben vol-
ver a comprobar todas las condiciones y repetirse la prueba. Si el 
error persiste debe avisarse al responsable del laboratorio para que 
compruebe el problema realizando tests más específicos (desviación 
estadística mediante la prueba de chi cuadrado (x2), comprobación 
del fondo, etc.) y tome la decisión más adecuada.
En el caso de un contador gamma la eficiencia en el contaje de las 
muestras es similar para todas ellas. Depende solo del contador y 
se puede calcular con un patrón de actividad absoluta conocida. Sin 
embargo, en los contadores de centelleo líquido la eficiencia no solo 
va a depender del contador, sino que también depende de la propia 
muestra. Por ello, la valoración de la eficiencia en estos contadores 
debe hacerse muestra a muestra, y para ello se utilizan varios méto-
dos (estándar interno, estándar externo y relación de canales).
Para el contaje de 125I en un contador gamma suele ser del 80-90 % 
mientras que para el 3H en un contador beta suele ser del 35-45 %.
❱ Desactivación, autoextinción o quenching: este fenómeno se 
produce solamente en centelleo beta o líquido y consiste en cual-
quier fenómeno que de alguna manera interrumpe la transferencia 
de energía en la muestra de contaje y que supone una disminución 
en el número de impulsos detectados y que estos sean de menor 
intensidad con el consiguiente error en la medida.
Dado que la utilización actual de contaje beta es muy reducid, no por-
menorizaremos en los distintos fenómenos que producen quenching, 
aunque sí diremos que existen diversos procedimientos para corre-
gir este fenómeno que comienzan con la adecuada preparación de la 
muestra y vial de contaje y que finalizan con diversos sistemas incorpo-
rados en los contadores que corrigen este fenómeno mediante los pro-
cedimientos denominados relación de canales y estándar externo.
Los contadores llevan incorporados un software para el procesa-
miento de los datos. Esto aporta grandes ventajas como la velocidad, 
mejora de la exactitud y precisión, control de calidad adicional y, sobre 
todo, la representación de la curva estándar y el cálculo de resultados.
8. EL CONTROL DE CALIDAD 
DEL RADIOINMUNOANÁLISIS 
El conocimiento de la fidelidad de los exámenes ejecutados en el labo-
ratorio tiene un significado médico práctico no siempre bien apreciado. 
Con el perfeccionamiento creciente del diagnóstico, el médico se apoya 
cada vez más en los resultados de los exámenes de laboratorio y, por 
ello, en el laboratorio clínico actual el control de calidad desempeña un 
papel importante.
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 105
Cada resultado de una medición efectuada en el laboratorio puede estar 
afectada por un error. Existen tres tipos de errores: errores groseros, 
errores sistemáticos y errores aleatorios. 
El error grosero se debe a la falta de la debida atención al ejecutar un 
análisis como, por ejemplo, confusión de especimenes, de reactivos, 
etc. Estos errores por confusión pueden reducirse, sobre todo, median-
te una correcta organización en el laboratorio.
En el error sistemático los resultados se desvían del valor nominal en 
la misma dirección (hacia arriba o hacia abajo). Sus causas no siempre 
se detectan y pueden deberse, por ejemplo, a dispensar volúmenes 
(pipeteo) con pipetas mal graduadas, contaje de muestras con un fon-
do excesivo, mala preparación de los reactivos, etc. Por regla general, 
los errores sistemáticos pueden evitarse, pero ello supone una cierta 
experiencia en el trabajo de laboratorio. La dimensión característica del 
error sistemático es la exactitud.
El error aleatorio conduce a una mala repetibilidad del proceso analí-
tico y es fruto de la posibilidad de que se produzcan errores casuales. 
La dimensión característica de los errores aleatorios es la precisión y, 
habitualmente, se expresa como la desviación estándar (DS) y el coe-
ficiente de variación (CV).
El concepto de fidelidad en las determinaciones analíticas es difícil de 
definir, ya que es un término genérico que incluye a su vez conceptos 
como precisión, exactitud, especificidad y sensibilidad.
La precisión es el grado en que una serie de medidas de una misma 
muestra difieren de la media. Se expresa como coeficiente de variación 
(CV) y debe estudiarse para diferentes niveles de la curva. Habitualmen-
te, se admite una reproducibilidad intraensayo de 5-10 % e interensayo 
del 5-15 %.
La exactitud o certeza es el grado en que una cantidad medida corres-
ponde a la cantidad presente en la muestra. La exactitud de un ensayo 
se conoce a través de la recuperación y el paralelismo. La primera se 
realiza adicionando concentraciones crecientes de sustancia pura a un 
suero libre de sustancia o de concentración conocida y calculándose 
la concentración esperada; mientras que para valorar el paralelismo se 
hacen diluciones seriadas de la muestra, se realiza el ensayo RIA, y si 
las curvas son idénticas o paralelas indica que el anticuerpo reconoce 
inmunológicamente la misma estructura antigénica.
La especificidad es la capacidad de discriminar entre estructuras simi-
lares. La valoración de la especificidad depende de la sustancia a medir 
Cada resultado 
de una medición 
efectuada en el 
laboratorio puede 
estar afectada por 
un error. Existen tres 
tipos de errores: 
errores groseros, 
errores sistemáticos y 
errores aleatorios.
106 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
y de su rango de concentración, y se hace calculando el porcentaje de 
reacción cruzada.
La sensibilidad analítica es la más pequeña cantidad de Ag nomarca-
do que puede ser distinguida del estándar cero y es el límite de detec-
ción del ensayo. Se determina calculando la precisión del estándar cero 
y depende de la afinidad del Ac por el Ag, la actividad específica del Ag 
marcado, las condiciones de la incubación, la precisión del análisis, etc. 
La sensibilidad funcional es la menor concentración que un ensayo es 
capaz de detectar con un coeficiente de variación interensayo del 20 %.
9. CONCLUSIÓN
Los métodos de RIA ofrecen un considerable atractivo por su extrema 
sensibilidad, su relativa facilidad de creación y su coste relativamen-
te bajo en comparación con otros sistemas analíticos comparables. 
A medida que se descubren nuevas sustancias problemas o las ya 
conocidas se convierten en objetos de interés, el método analítico de 
primera elección es el RIA. De aquí que sean profusamente empleados 
en los campos de la investigación y el diagnóstico.
Los RIA continúan utilizándose en medicina clínica debido a la facilidad 
de montar el análisis. En efecto, si se dispone de un anticuerpo, un 
receptor o una proteína de unión específicos, y se puede marcar la sus-
tancia problema con un radioisótopo, puede crearse un sistema de RIA.
En las últimas décadas el gran desarrollo de las técnicas inmunológicas 
que no utilizan sustancias radiactivas han ido desplazando al RIA ya que, 
por un lado, no utilizan ningún material radiactivo, han conseguido una 
sensibilidad adecuada para la medicina práctica diaria y, sobre todo, son 
técnicas totalmente automatizables de tal forma que existen múltiples 
equipos que realizan estos inmunoensayos con un coste y calidad ade-
cuados para la práctica clínica rutinaria, y obteniendo resultados en un 
tiempo mínimo.
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 107
RESUMEN
✓ El RIA es uno de los principales procedimientos inmunológicos basados 
en procedimientos para visualizar la unión Ag-Ac y permite el análisis 
cuantitativo de sustancias biológicas que se encuentran en muy baja 
concentración (ng/ml o pg/ml) en diversos fluidos biológicos.
✓ El RIA combina la especificidad de las reacciones inmunes (reacción 
entre antígeno Ag y anticuerpo Ac) y la sensibilidad de los métodos 
radioisotópicos.
✓ El radioinmunoanálisis (RIA) fue desarrollado de forma simultánea 
por Yalow y Berson en Estados Unidos y Ekins en Inglaterra, a fina-
les de los años 50 del pasado siglo XX.
✓ En el RIA existen dos categorías: radioinmunoanálisis (RIA) compe-
titivo y ensayo inmunorradiométrico o IRMA. El primero es un inmu-
noensayo tipo II que sigue la ley de acción de masas que especifica 
las relaciones ente la sustancia problema y el anticuerpo. Los análi-
sis inmunorradiométricos (IRMA) son inmunoensayos de tipo I.
✓ En la ejecución práctica de un RIA necesitamos una serie de reac-
tivos o componentes básicos que, aparte de la muestra, son el tra-
zador, el anticuerpo, los estándares que constituyen la curva de ca-
libración y los reactivos para efectuar la separación de la fracción 
libre de la unida una vez desarrollada la reacción.
✓ Al hablar de ligando nativo (L) nos referimos, por un lado, a la sus-
tancia que queremos determinar en la muestra (Lm) y, por otro, a los 
patrones o estándares (Lp) que nos van a permitir construir la curva 
de calibración del ensayo y, por tanto, conocer la cantidad de sus-
tancia analizada presente en la muestra.
✓ En la actualidad utilizamos kit comerciales que nos aportan todos los 
reactivos que hemos descrito y que permiten realizar los ensayos de 
forma cómoda e incluso semiautomatizar el proceso.
✓ Los distintos pasos en la realización del ensayo son:
– Preparación de la muestra y de los reactivos.
– Dispensación de los volúmenes de muestras y reactivos.
108 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
– Incubación.
– Separación de las fracciones libre y unida.
– Contaje de la radiactividad de las muestras.
– Cálculo de la curva patrón.
– Lectura de los resultados.
– Control del ensayo.
✓ Los equipos que permiten detectar y medir las emisiones radiactivas 
se denominan contadores y la detección de la radiación se basa en 
los efectos que, directa o indirectamente, produce esta al atravesar 
la materia. En RIA se utilizan los contadores de centelleo sólido 
(contador gamma) y de centelleo líquido (contador beta).
✓ El concepto de fidelidad en las determinaciones analíticas es difícil 
de definir, ya que es un término genérico que incluye a su vez con-
ceptos como precisión, exactitud, especificidad y sensibilidad.
G L O S A R I O
Alícuota: parte de una sustancia que es representativa del todo.
Anticuerpo: proteína que se forma en el organismo a consecuencia de 
la respuesta inmunológica a una sustancia extraña denominada antíge-
no y que reacciona específicamente con este.
Antígeno: sustancia capaz de inducir una respuesta inmune con for-
mación de anticuerpos y que reacciona específicamente con estos.
Centelleo: destello de luz producido en un cristal químico por un evento 
ionizante.
Centelleo líquido: técnica para contar radiaciones α o β de baja energía 
incorporando las muestras marcadas a una solución fosforescente. 
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 109
Contador de centelleo: dispositivo que consta de un cristal de cente-
lleo, un tubo fotomultiplicador y circuitos electrónicos apropiados para 
contar los destellos originados por la radiación ionizante que incide 
sobre el cristal.
Cristal de centelleo: cualquier cristal puro o activado que emite fotones 
visibles cuando recibe radiación ionizante. El más usado es el cristal de 
yoduro sódico activado con talio.
Cuentas por minuto: cantidad total de desintegraciones de una fuente 
radiactiva detectadas durante un minuto.
Detector: cualquier dispositivo que permite poner de manifiesto la pre-
sencia de radiación ionizante.
Ligando: Sustancia medida por la técnica RIA.
Partición: proceso mediante el que se separan las fracciones unida y 
libres en un radioinmunoensayo.
Radiactivo: todo átomo que tiene un núcleo inestable y tiende a vol-
verse estable mediante la expulsión de parte de su núcleo.
Radioinmunoanálisis: procedimiento in vitro en el cual, mediante el 
empleo de un antígeno marcado en la reacción antígeno-anticuerpo, 
se pueden determinar concentraciones muy bajas de una sustancia.
Radionúclido: núclido radiactivo.
Reacción antígeno-anticuerpo: reacción que se produce entre un 
antígeno y su anticuerpo específico frente a él.
RIA: abreviatura de radioinmunoensayo.
Tiempo muerto: intervalo después de un evento radiactivo, durante el 
cual el aparato detector permanece insensible a nuevos eventos. 
110 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
EJERCICIOS
❱  E1. Realiza un ensayo RIA utilizando el simulador propuesto en el capítulo.
❱  E2. Realiza los cálculos de una curva de calibración, dibuja la curva obte-
nida y lee los resultados obtenidos para unas muestras, a partir de los 
datos facilitados por el profesor.
❱  E3. Realiza la valoración de calidad de un ensayo RIA facilitado por el pro-
fesor.
❱  E4. Realiza diversos pipeteos con pipetas semi y automáticas para familia-
rizarte con la forma de hacerlo.
❱  E5. Realiza la reconstitución de los distintos reactivos suministrados por un 
kit comercial de RIA. 
❱  E6. Se va a realizar un ensayo para la determinación de aldosterona en sue-
ro y en orina. Para ello, disponemos de un kit comercial de RIA para la 
determinación de aldosterona, las muestras de suero de un paciente y 
la de orina de otro paciente. 
Procedemos a hidrolizar la orina de la siguiente forma: mezclamos la orina de 
24h adecuadamente y tomamos una alícuota de 100 ml a la que añadimos 1 
g de ácido bórico para su adecuada conservación. De esta alícuota tomamos 
500 ml con 1 ml de HCl 0,1 N que pasamos a un tubo de ensayo, lo tapamos 
y lo incubamos a 30+ 2° C durante 15-20 minutos.
Procedemos al ensayo de la siguiente manera:
Tubo Estándar 0
Estándares, 
controles o muestras
Aldosterona 125I
1 200 μL 500 μL
2 200 μL 500μL
3 200 μL ST 1 500 μL
4 200 μL ST 1 500 μL
5 200 μL ST 2 500 μL
6 200 μL ST 2 500 μL
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 111
– Si los resultados del contaje de los tubos es el mostrado en la tabla siguien-
te, calcular (1) B/Bo para cada estándar, control y muestra, (2) representar 
gráficamente B/Bo frente a la concentración, e interpolar el valor de los 
controles y muestras.
Tubo Estándar 0
Estándares, 
controles o muestras
Aldosterona 125I
7 200 μL ST 3 500 μL
Mezclar
Incubar 3h a 
18-25 °C en 
agitación
Aspirar el 
sobrenadante
Contar los tubos
8 200 μL ST 3 500 μL
9 200 μL ST 4 500 μL
10 200 μL ST 4 500 μL
11 200 μL ST 5 500 μL
12 200 μL ST 5 500 μL
13 200 μL Control 500 μL
14 200 μL Control 500 μL
15 200 μL Suero 1 500 μL
16 200 μL Suero 1 500 μL
17 200 μL Suero 2 500 μL
18 200 μL Suero 2 500 μL
19 200 μL Suero 3 500 μL
20 200 μL Suero 3 500 μL
21 10 μL Orina Hidr. 1 500 μL
22 10 μL Orina Hidr. 1 500 μL
23 10 μL Orina Hidr. 2 500 μL
24 10 μL Orina Hidr. 2 500 μL
Tubo Cpm Media % B/B0 Concentración (pg/ml)
1 24804 0
2 24810 0
3 20340 30
4 20353 30
5 18200 71
112 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
– Si los valores normales de aldosterona en suero o plasma son 50-225 pg/
ml en posición ortostática y 8-150 pg/ml en decúbito supino, y los de valo-
res en orina de 24 horas son 3-20 µg/24 h, interpretar los resultados.
Nota: para el cálculo de la aldosterona en orina multiplicar el valor obteni-
do por 63, ya que el factor del hidrolizado es de 3 y el de la dilución es 21 
(210/10).
Tubo Cpm Media % B/B0 Concentración (pg/ml)
6 18190 71
7 13890 195
8 13882 195
9 9400 530
10 9389 530
11 5878 1400
12 5875 1400
13 16248
14 16241
15 9724
16 9720
17 32012
18 3023
19 22015
20 22026
21 18920
22 18928
23 9258
24 9270
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 113
EVALÚATE TÚ MISMO
 1. Los inmunoanálisis tipo I se caracterizan por:
  q a) Utilizan un exceso de antígeno (Ag).
  q b) Utilizan un exceso de anticuerpo (Ac).
  q c) Se marca el anticuerpo.
  q d) Las respuestas b y c son correctas.
 2. Señala la respuesta falsa. Son modalidades de RIA:
  q a) RIA secuencial.
  q b) RIA de desplazamiento.
  q c) IRMA de inhibición.
  q d) Todas las respuestas son correctas.
 3. La partición es:
  q a) El proceso mediante el cual se separan el Ag y el Ag*.
  q b) El proceso mediante el que se separan las fracciones libres (F) de las uni-
das (B).
  q c) El proceso mediante el cual se separan los anticuerpos unidos de los 
libres.
  q d) El proceso mediante el cual se separan los anticuerpos marcados (Ac*) 
de los no marcados (Ac).
 4. Los métodos para realizar la partición deben:
  q a) Alterar el equilibrio de la reacción inmune.
  q b) Ser métodos complejos.
  q c) Ser reproducibles.
  q d) Todas las respuestas son correctas.
 5. ¿Cuál de los siguientes enunciados define mejor un hibridoma?:
  q a) Estirpe híbrida generada por el cruce de dos animales inmunizados con 
distintos antígenos.
  q b) Célula híbrida generada al fusionar dos linfocitos B normales.
  q c) Fusión de un linfocito B normal con una célula de mieloma.
  q d) Fusión de un linfocito B normal con una célula de melanoma.
 6. En el laboratorio de RIA, ¿qué se utiliza para medir la radiactividad de las 
muestras orgánicas in vitro?:
  q a) Gammágrafo lineal.
  q b) Activímetro.
  q c) Contador Geiger.
  q d) Contador de pozo.
114 ❘ TÉCNICAS DE RADIOFARMACIA
 7. En un laboratorio de RIA, ¿cuál es el material radiactivo empleado para la 
realización de técnicas?:
  q a) 99mTc.
  q b) 123I.
  q c) 125I.
  q d) 131I.
 8. ¿Cuáles son los tres elementos básicos para realizar un RIA clásico?:
  q a) El Ac, el Ag marcado y Ag no marcado.
  q b) El Ac, el Ag marcado y el I123.
  q c) El Ga67, el Ag no marcado y el Ac.
  q d) El Ac, el Co57 y Ag marcado.
 9. El principio fundamental del RIA está basado en:
  q a) La competición que se establece entre dos sustancias antigénicas (Ag), 
idénticas entre sí, para unirse a un isótopo radiactivo.
  q b) La reacción de dos anticuerpos específicos.
  q c) La reacción en cadena de dos sustancias radiactivas con un anticuerpo 
específico.
  q d) La competición que se establece entre dos sustancias antigénicas (Ag), 
idénticas entre sí, para unirse a un anticuerpo (AC) específico.
10. La definición de sensibilidad en el RIA es:
  q a) La capacidad para detectar pequeñas cantidades de sustancias.
  q b) La capacidad para detectar grandes cantidades de sustancias.
  q c) Se refiere a la mayor o menor reproductibilidad del análisis.
  q d) La capacidad para medir, exclusivamente, la sustancia que interesa.
11. Son métodos para realizar la partición:
  q a) Adsorción del anticuerpo libre.
  q b) Precipitación inespecífica del Ac.
  q c) Separación en fase sólida.
  q d) Todos las respuestas anteriores son correctas.
12. ¿Cuál es la radiación ionizante utilizada en el laboratorio de RIA?: 
  q a) Radiación UV. 
  q b) Rayos X. 
  q c) Rayos gamma. 
  q d) Radiación láser.
Aplicación de técnicas de radioinmunoanálisis ❘ 115
13. En un RIA, los isótopos radiactivos con los que habitualmente se trabaja 
son del tipo: 
  q a) Alfa y gamma.
  q b) Alfa. 
  q c) Beta. 
  q d) Beta y gamma.
14. ¿Qué es lo primero que hay que hacer cuando llega la muestra al labora-
torio?: 
  q a) Comprobar que la petición médica y el etiquetado de las muestras sean 
correctos. 
  q b) Centrifugar la muestra. 
  q c) Registrar la muestra. 
  q d) Dar el resultado del análisis.