Separación de aminoácidos por técnicas de cromatografía de capa fina

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PRÁCTICA 1
Separación de aminoácidos por técnicas de cromatografía de capa fina. Reacciones coloreadas de aminoácidos: prueba de ninhidrina.
Introducción.
Con la siguiente práctica conseguimos conocer los aminoácidos de una muestra problema y su identificación gracias a la reacción coloreada con ninhidrina.
Tenemos una serie de muestras patrón con diferentes aminoácidos.
La cromatografía es una técnica que permite la separación y purificación de mezclas complejas en las biomoléculas que la componen.
Reactivas.
-Glutamato, glicina, lisina, prolina y leucina al 1% en n-propanol al 10% en agua destilada.
-Solución problema de aminoácidos.
-Eluyente: etanol: hidróxido amónico al 34% en una proporción 7:3.
Resultados y discusión.
1. Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina sobre gel de sílice.
Una vez revelada la placa hay que medir la distancia que separa el frente de avance de la línea de aplicación de los patrones y de la muestra problema, a lo que denominamos DF (12,7).
Después calculamos la RF de cada uno de los aminoácidos de la siguiente forma: RF=D/DF siendo D la distancia recorrida por cada muestra y DF la distancia del frente de avance.
	MUESTRA
	D(cm)
	RF
	
Lisina
	
0.5
	
0.03
	
Glicina
	 03.5 
	
0.27
	
Glutamato
	
12
	
0.94
	
Prolina
	
4
	
0.31
	
Leucina
	
9
	
0.70
Al variar RF según los distintos aminoácidos, nos permite distinguir más fácilmente los aminoácidos que constituyen el problema. Esta variación se produce debido a que las fuerzas de avance ejercidas por la fase móvil en su desplazamiento sobre la estacionaria son diferentes. Hay que tener en cuenta la absorción del material utilizado.
Los compuestos más solubles seguirán el camino del eluyente con más velocidad lo que nos permite de terminar las distintas alturas alcanzadas por las manchas de los diferentes patrones.
	
2. Identificación de los aminoácidos que componen la molécula.
Ya revelada la muestra observamos que tiene dos manchas, debido a que la muestra se compone de dos aminoácidos. Observando la similitud que guarda la muestra problema con los patrones, determinamos los aminoácidos que componen la muestra (glutamato y leucina)
PRACTICA 2
Reacciones coloreadas para la determinación cualitativa de azúcares. Prueba de la antrona y fehling.
Introducción.
La prueba de la antrona se basa en determinar la naturaleza de un azúcar problema mediante esta sustancia. Llegaremos a una conclusión contrastando el problema con los patrones.
La prueba del fehling se basa en determinar si el azúcar posee poder reductor ya que los azúcares reductores tienen una coloración rojiza debido al oxido cuproso que es forma por oxidación del azúcar por medio del catión Cu 2+.
Los azúcares utilizados son la glucosa, fructosa, xilosa y sacarosa.
Resultados.
1. Prueba de fehling.
Ponemos en tubos de ensayo 2 ml de solución de azúcares y solución problema. El blanco se obtiene con 2 ml de agua destilada. Después se añaden 5 gotas de fehling a los tubos. Una vez agitados se sitúan al baño maría observando los cambios de color de cada compuesto. Si hay cambio de color el azúcar es reductor (maltesa), y si no, no es reductor (sacarosa).
	
	
BLANCO
	
SACAROSA
	
GLUCOSA
	
XILOSA
	
FRUCTOSA
	
PROBLEMA
	
5 min.
	
azul
	
azul
	
Azul
	
Azul
	
amari.
	
azul
	
1 min.
100*C
	
azul claro
	
azul claro
	
Naranja claro
	
Naranja oscuro
	
naranja claro
	
azul claro
	
5 min.
	
"
	
"
	
"
	
"
	
"
	
"
De esta tabla se deduce que los azúcares reductores son la glucosa, la xilosa y la fructosa, dado que cambian de color.
2. Prueba de la antrona.
Preparamos el blanco con dos gotas de agua destilada y 2 ml de antrona, 4 tubos con las muestras patrón con una gota de cada azúcar y 2 ml de antrona, y otro tubo con una gota de la muestra problema y 2 ml de antrona, poniéndolos a continuación al baño maría.
Se obtuvieron los siguientes resultados:
	
	
BLANCO
	
SACAROSA
	
GLUCOSA
	
XILOSA
	
FRUCTOSA
	
PROBLEMA
	
5 min.
	
Amarillo
	
Verde oscuro
	
Verde-azul
	
Verde-azul
	
verde oscuro
	
verde oscuro
	
1 min.
100*C
	
Amarillo-verde
	
negro
	
Negro
	
Negro
	
negro
	
negro
	
5 min.
	
"
	
"
	
"
	
"
	
"
	
"
Discusión.
En la prueba de antrona todas las muestras dieron positivo porque utilizamos azúcares en forma de hexosa o pentosa, sin embargo, en la prueba de fehling la sacarosa no dio positivo porque tiene carácter no reductor debido al enlace glucosídico (1-2) donde están situados los hidroxilos de los carbonos anoméricos de la glucosa y de la fructosa.
PRÁCTICA 3
Determinación cuantitativa de p-nitrofenol por espectrofotometría visible
Introducción.
La espectrofotometría visible consiste en una Técnica analítica basada en la capacidad de absorción de determinadas moléculas para determinadas radiaciones.
Obtención del espectro de absorción del p-nitrofenol.	
Preparamos una disolución con 2,5 ml de solución de p-nitrofenol 0,2 mM con 1 ml de NaOH 0,5N y 4 ml de agua destilada, y otra disolución (blanco) con 1 ml de NaOH 0,5N y 4 ml de agua destilada.
Llevamos las disoluciones al espectrofotómetro y medimos la absorbancia de la primera disolución con distintas longitudes de onda, sirviéndonos el blanco para calibrar la máquina.
	
	360 
	380
	390
	395
	400
	405
	415
	440
	460
	Abs.
	0.30
	0.40
	0.42
	0.42
	0.42
	0.41
	0.40
	0.32
	0.19
Llevando los datos a una gráfica.
Observando la curva vemos que la máxima absorbancia se da a una longitud de onda de aproximadamente 400 nm.
Curva de calibrado de p-nitrofenol.
Preparamos seis disoluciones a partir de la de p-nitrofenol 0,2 mM indicadas en la tabla, y de cada una tomamos 2,5 ml, añadiéndole 1 ml de NaOH 0,5N y 1,5 ml de agua destilada.
A continuación determinamos la absorbancia de las muestras fijando la longitud de onda máxima (400 nm), utilizando el blanco para calibrar el espectrofotómetro.
	
MUESTRA
	
[P-NITROFENOL] (mM)
	
ABSORBANCIA
	0
	0
	0.054
	1
	10
	0.156
	2
	20
	0.247
	3
	40
	0.448
	4
	50
	0.526
	5
	100
	0.562
	6
	200
	1.180
Llevando los datos a una gráfica obtenemos:
Cálculo del coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol en su longitud de onda máxima y la ecuación de Lambert-Beer.
La ecuación de dicha ley es: A=EMdC 
siendo:
EM= coeficiente de extinción molar
d= longitud del medio (cubeta de d=1 cm)
C= concentración 
A, cuando d=1 cm, se denomina densidad óptica y se representa como DO .
Esta ley dice que cuando una radiación pasa a través de una sustancia que absorbe luz, parte de esa radiación es absorbida,
y parte sale con menor intensidad de la que llega, con base a esta ley conociendo la absorbancia de la disolución podremos hallar su concentración, pero cuando una disolución demasiado concentrada se produce un apantallamiento de la luz que llega.
Utilizando los datos del tubo 2:
EM=A/dxC=0,25/1x20mM=12500 1/cmxM
Determinación de la concentración de una solución problema de p-nitrofenol.
La solución problema de p-nitrofenol se obtiene mezclando en un tubo de ensayo 2,5 ml de solución problema con 1 ml de NaOH 0,5N y 1,5 ml de agua destilada. Medimos la absorbancia a 400nm y fue 0,315.
Llevando este dato a la curva obtenemos que tenemos una concentración de 24 mM.
Despejando la concentración de la fórmula de Lambert-Beer obtenemos: C=A/12500=0,315/12500=25,2mM
El NaOH es muy necesario porque neutraliza la acidez a la que queda la disolución de p-nitrofenol que es un ácido débil, y es una molécula polar que aumenta, la salida de iones H+, y por lo tanto, la acidez.
PRÁCTICA 4
Extracción y ensayo de actividades glicosidasas de girasol. Efecto de la concentración de enzimas, pH, temperatura y concentración de sustrato sobre la actividad enzimática.
Introducción.
Estudiaremos la reacción:
p-nitrofenol- -D-manopiranósido ---> p-nitrofenol + manosa 
catalizada por la -o-manosidasa.
Resultado y discusión.
1. Determinación de las velocidades iniciales. 
 
	
TIEMPO (min.)
	
5
	
10
	
20
	
30
	
ABSORB. 400nm
	
0,8
	
1,54
	
2,86
	
3,4
	
[P-NITROF]
(mM)
	
68,3
	
131,62
	
244,4
	
290,6Pte de la gráfica (K)=(yI-yO)/(xI-xO)=(244,4-131,62)/(20-10)= 11,28 t.
v=-d[p-nitrofenol- -D-manopiranósido]/dt=Kt=11,28
siendo esta la ecuación aproximada de la gráfica, ya que hay imperfecciones en la medición, observándose que la concentración aumenta con el tiempo.
2. Efecto de la concentración de enzimas sobre la actividad enzimática.
	
DILUCIÓN
	
[P-NITROFENOL]
	
ML DE ESTRACTO
	
ABSORBANCIA
	
1/1
	
136,75
	
0,25
	
1,6
	
1/10
	
42,73
	
0,025
	
0,5
	
1/50
	
8,54
	
0,005
	
0,1
	
1/100
	
4,27
	
0,0025
	
0,05
La actividad enzimática son los moles de producto por segundo que se forman de sustrato. VO=[p]/t nKat
	
DILUCIÓN
	
1/1
	
1/10
	
1/50
	
1/100
	
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
	
75,97
	
23,73
	
4,74
	
2,37
La recta responde a la ecuación siguiente: V=KCAT[E]
KCAT=Pte=tg =(23,73x10 -4,74x10 )Kat/(0,025-0,005)ml= 9,5x10 Kat/ml
entonces: V=9,5x10 Kat/ml [volumen enzima]
 [ -D-manosidasa]
La ecuación responde a la primera parte de la gráfica, cuando hay una cantidad de enzimas.
3. Efecto del pH sobre la actividad enzimática.
	
pH
	
ABSORBANCIA 400 nm
	
[P-NITROFENOL]
	
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
	3,0
	0,4
	34,2 mM
	19 nKat
	3,5
	0,6
	51,3
	28,5
	4,0
	0,8
	68,4
	38
	4,5
	1,4
	119,6
	66,4
	5,0
	0,7
	52,8
	33,2
	6,0
	0,3
	25,6
	14,2
	7,0
	0,1
	8,5
	4,7
El pH óptimo de la reacción está alrededor de 4,5.
4. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
	
TEMPERATURA
	
ABSORBANCIA
	
[P/NITROFENOL]
	
ACT.ENZIMÁTICA
	
20ºC
	
0,4
	
34,2
	
19 nKat
	
30
	
1,3
	
111,1
	
61,7
	
40
	
1,6
	
136,7
	
75,9
	
50
	
2,0
	
170,9
	
94,9
	
60
	
2,5
	
213,6
	
118,6
	
70
	
0,4
	
34,2
	
19
La temperatura óptima está alrededor de los 50ºC. A partir de esta temperatura se observa una caída muy brusca de la velocidad debido a que a temperaturas altas los enzimas se desnaturalizan.
QIO es el aumento de la velocidad con un incremento de 10ºC.
QIO entre 30 y 40ºC=14,2 nKat |
QIO entre 40 y 50ºC=19 |> QIO=18,97 nKat
QIO entre 50 y 60ºC=23,7 |	
Representación de Arrhenius
	
1/T (K )
	
log[VO/(VMAX-VO)]
	
3,09x10
	
0,6
	
3,19x10
	
0,249
	
3,3x10
	
0,035
	
3,41x10
	
-0,72
Pte recta=tg =-EA/R=-(0,6-0,249)/[(3,19-3,09)x x10 ]=-3510 K EA=6,97 Kcal/mol
log [VO/(VMAX-VO)]=log K-(EA/R)(1/T)
5.Efecto de concentración de sustrato sobre la actividad enzimática.
	
SUSTRATO
	
ABSORBANCIA
	
[P-NITROFENOL]
	
ACT.ENZIMÁTICA
	10 mM
	0,25
	21
	11,6 nKat
	20
	0,46
	39,3
	21,8
	40
	0,71
	60,7
	33,7
	60
	0,87
	74,3
	41,2
	80
	1,00
	85,4
	47,4
	100
	1,10
	94,0
	52,2
	200
	1,30
	111,1
	61,7
	400
	1,42
	121,4
	67,4
	600
	1,43
	121,9
	67,6
 
V=VMAX[S]/(KM+[S]) siendo KM la cte. de Michaelis que nos da la afinidad del enzima por el sustrato.
Observando la gráfica vemos primero un aumento de velocidad rápido para después ir aumentando más lentamente.
Ecuación de Linewearer-Burk (cálculo VMAX) 
	1/[S]
	0,0116
	0,0125
	0,0100
	0,005
	0,0025
	1/VO
	0,024
	0,021
	0,019
	0,016
	0,014
Representación de Eadie-Hafstee.
	VO
	[S]
	VO/[S]
	11,6
	10
	1,16
	21,8
	20
	1,099
	33,7
	40
	0,8425
	41,2
	60
	0,680
	47,4
	80
	0,5925
	52,2
	100
	0,522
	61,7
	200
	0,3085
	67,4
	400
	1,168
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