Entendamos la bioluminiscencia marina

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DIVISIÓN ACADÉMICA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS 
 
CULTIVO Y CONSERVACIÓN DE 
Aliivibrio fischeri 
 ASESORA 
 
 Dra. Verónica Isidra Domínguez Rodríguez 
 
 
 
TESIS 
Que para obtener el grado de 
Maestro en ingeniería, tecnología y gestión 
ambiental 
 
 
 
PRESENTA 
Martha Aurora López Padrón 
 
 
VILLAHERMOSA, TABASCO. ABRIL DE 2021 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
2 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
<La ciencia no es perfecta, con 
frecuencia se utiliza mal, no es 
más que una herramienta, pero 
es la mejor herramienta que 
tenemos; se corrige a sí misma, 
está siempre evolucionando y 
se puede aplicar a todo. Con 
esta herramienta conquistamos 
lo imposible.= 
 
- Carl Sagan. 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
3 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
DEDICATORIA 
 
 
 
A la memoria de mi madre, deseando su paz eterna. Siempre serás parte 
fundamental de todo lo que soy. 
 
 
 A mi Poky, por toda tu paciencia y apoyo que son invaluables para mí. 
 
 
A mi hermano Luis, por las pocas, pero nutridas conversaciones que me 
ayudan a crecer y me inspiran a ser mejor. 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
4 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el apoyo económico brindado 
para la obtención de grado. 
A mi asesora de tesis, la Dra. Verónica Domínguez por la oportunidad y apoyo 
para realizar este trabajo de investigación. 
A mi comité sinodal por sus valiosas aportaciones para la mejora de este 
trabajo. De manera especial a la Dra. Consuelo Bautista por su esmero e 
interés. Infinitas gracias. 
Al Dr. Juan José Valdés de la Universidad Michoacana de San Nicolás de 
Hidalgo, por su apoyo incondicional y totalmente desinteresado al aportar sus 
conocimientos. Más científicos como usted. 
A Liliana Hernández, Fidel Arias y Anahy Castro por todo su apoyo, pero sobre 
todo por su invaluable amistad. Los quiero. 
A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Remediación: Gero, Paco, 
maestro Saúl, Karen, Evelyn, Fany, Pascual, Paulo, Eder, Dr. Eduardo, Conta. 
A mis compañeros de maestría: Arce, Fátima, Luis y Michel por ser los mejores 
compañeros en este camino. Gracias por las risas, el apoyo y los ánimos. 
A mi amigo Allan, por haberte convertido en pieza clave en mi vida y 
brindarme tu apoyo y cariño incondicionales ante las adversidades que pasé. 
Mil gracias por todo lo que haces por mí. Te quiero. 
Por último, pero no menos importante, a mi mejor amiga Minú, por 
permanecer luego de tantos tropiezos y unirnos más a través de los años. 
Gracias por las porras y tu amistad sólida y sincera. Te quiero mucho. 
 
 
11%
ÍNDICE DE SIMILITUD
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri
INFORME DE ORIGINALIDAD
FUENTES PRIMARIAS
www.posgradoeinvestigacion.uadec.mx
Internet
revistareduca.es
Internet
www.medigraphic.com
Internet
maestradelia.wordpress.com
Internet
hdl.handle.net
Internet
www.tandfonline.com
Internet
www.delaval.com.mx
Internet
cicy.repositorioinstitucional.mx
Internet
G. Álvarez-Coronel, V. I. Domínguez-Rodríguez,
N. Ovando-García, R. H. Adams. "Stabilization
and solidification technology for treating heavy
oil-contaminated sediments", International Journal of
Environmental Science and Technology, 2021
Crossref
www.docsity.com
Internet
236 palabras 4 4%
145 palabras 4 2%
72 palabras 4 1%
55 palabras 4 1%
43 palabras 4 1%
19 palabras 4 < 1%
18 palabras 4 < 1%
16 palabras 4 < 1%
16 palabras 4 < 1%
12 palabras 4 < 1%
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
5 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
Contenido 
 
1. Introducción ....................................................................................................... 7 
2. Justificación ....................................................................................................... 8 
3. Antecedentes ..................................................................................................... 9 
4. Marco teórico .................................................................................................... 11 
4.1. Bioluminiscencia ............................................................................................... 11 
4.2. Bioluminiscencia bacteriana .............................................................................. 11 
4.3. Aliivibrio fischeri ................................................................................................ 12 
4.4. Aplicaciones biotecnológicas de Aliivibrio fischeri ............................................. 13 
4.5. Condiciones de cultivo para Aliivibrio fischeri .................................................... 13 
5. Objetivos ............................................................................................................ 15 
5.1. Objetivo general ................................................................................................ 15 
5.2. Objetivos específicos ........................................................................................ 15 
6. Metodología ....................................................................................................... 16 
6.1 Evaluación del crecimiento de la cepa de A. fischeri en tres medios de cultivo . 16 
6.1.1. Primera etapa ..................................................................................................................... 17 
6.1.2. Segunda etapa ................................................................................................................... 20 
7. Resultados y discusión ................................................................................... 23 
7.1. Evaluación del crecimiento de la cepa de A. fischeri en tres medios de cultivo . 23 
7.1.1. Comparación de medios ................................................................................................... 28 
 ....................................................................................................................................... 
12.2 Viabilidad de conservación de la bacteria Aliivibrio fischeri en medio sólido y 
líquido a corto plazo, mediante la medición de la bioluminiscencia producida y densidad 
óptica de los cultivos. ................................................................................................... 32 
8. Conclusiones .................................................................................................... 37 
9. Referencias bibliográficas .............................................................................. 38 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
6 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
Contenido de figuras 
Figura 1. Diagrama de la metodología .............................................................................................. 16 
Figura 2. Lectura en luminómetro de cepa liofilizada ....................................................................... 18 
Figura 3. Matraces con cultivos luminiscentes ................................................................................. 20 
Figura 4. Siembra de medio sólido a líquido para verificar viabilidad ............................................... 21 
Figura 5. Agitación de viales para lectura de luminiscencia en luminómetro ................................... 22 
Figura 6. a) Luminiscencia presentada en medio Photobacterium; b) Densidad óptica en medio 
Photobacterium a 48 horas de incubación ............................................................................... 24 
Figura 7. a) Luminiscencia en medio SWC; b) Densidad óptica en medio SWC ............................. 25 
Figura 8. a) Luminiscencia en medio LB20; b) Densidad óptica en medio LB20 ............................. 26 
Figura 9. Comparativa de los niveles de luminiscencia alcanzadosen los tres medios .................. 28 
Figura 10. Comparación de densidad óptica observada en los tres medios de cultivo .................... 29 
Figura 11. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio Photobacterium ............................... 30 
Figura 12. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio SWC ................................................ 31 
Figura 13. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio LB20 ................................................ 31 
Figura 14. Crecimiento en placa de A. fischeri ................................................................................. 32 
Figura 15. Luminiscencia a un mes de conservación en medio sólido ............................................. 34 
Figura 16. Luminiscencia obtenida durante seis semanas de conservación en medio líquido ........ 35 
 
 
 
Contenido de tablas 
 
 
Tabla 1. Requerimientos para crecimiento de A. fischeri ................................................................. 14 
Tabla 2. Condiciones de cultivo identificadas en la bibliografía consultada. .................................... 19 
Tabla 3. Componentes de los medios Photobacterium y LB20 ........................................................ 36 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
7 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
1. Introducción 
 
Las actividades industriales en la vida cotidiana, son una de las principales fuentes 
de peligros ambientales, y el ser humano está en riesgo al vivir en un medio 
dañado por la contaminación y las sustancias tóxicas que se encuentran en el 
ambiente, cuyo saneamiento y conservación influyen directamente en la calidad de 
vida de la población. 
Uno de los principales aspectos que considera la legislación mundial en materia 
de residuos, aire, agua y suelo, es la prevención de efectos tóxicos en la salud 
humana por contaminación química. Se considera tóxico a aquel compuesto capaz 
de alterar el funcionamiento de un sistema biológico e incluso causar su muerte. 
La toxicidad que presenta una sustancia está medida por la determinación de la 
concentración media que resulta letal para el 50% de una población expuesta de 
forma aguda a dicha sustancia (Moreno, 2003). 
 Las bacterias marinas luminiscentes son bioindicadores, para la evaluación de 
toxicidad en aguas y sedimentos y actualmente se emplean como biosensores 
para identificar diversos contaminantes ambientales al ser posible medir la 
luminiscencia que producen durante su metabolismo, que permite identificar un 
efecto positivo o negativo de una sustancia a través del aumento o la disminución 
(respectivamente) de la lumiscencia. 
Aliivibrio fischeri (A. fischeri) es una bacteria bioluminiscente que se encuentra 
frecuentemente en relaciones simbióticas con animales marinos como el calamar 
bobtail (Euprymna scolopes). Su bioluminiscencia proviene de la expresión de una 
serie de proteínas contenidas en el operón lux (Madigan y col., 2015) y es 
ampliamente utilizada para realizar bioensayos de toxicidad, lo que genera interés 
en el estudio de sus características. 
En este trabajo se compararán tres métodos considerados adecuados para la 
reproducción y conservación de la bacteria A. fischeri. 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
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<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
2. Justificación 
 
La detección y evaluación de la toxicidad en agua, suelo y sedimentos permite un 
monitoreo oportuno a los trabajos de remediación de sitios, además de brindar 
información sobre los metabolitos resultantes de la transformación de las 
sustancias primarias. Los ensayos basados en animales, plantas y algas son 
costosos, lentos y requieren un gran volumen de muestra; estudios recientes han 
enfatizado los beneficios de ensayos bacterianos rápidos, reproducibles y 
rentables para la detección y evaluación de toxicidad (Isenberg, 1993). 
En México se cuenta con un número limitado de pruebas normadas para el área 
de bioensayos de toxicidad y éstas son: 
 NMX-AA-087-SCFI-2010, para Análisis de agua-evaluación de toxicidad 
aguda con Daphnia magna straus (Crustacea-cladocera). 
 NMX-AA-110-1995-SCFI, para Análisis de agua- evaluación de toxicidad 
aguda con Artemia franciscana kellogg (Crustacea-anostraca). 
 NMX-AA-112-SCFI-2017, para Análisis de Agua y Sedimentos - Evaluación 
de Toxicidad Aguda con Vibrio fischeri. 
Resulta frecuente que se elijan como la primera prueba de toxicidad aguda los 
bioensayos con A. fischeri al obtener resultados más rápidos y ser pruebas menos 
costosas. Se ha informado en varios trabajos de investigación que el ensayo de 
bioluminiscencia usando A. fischeri es el más sensible en una amplia gama de 
productos químicos en comparación con otros ensayos bacterianos como la 
inhibición de la nitrificación, la respirometría, la luminiscencia de ATP y la 
inhibición de enzimas (Parvez y col., 2006). 
La viabilidad del cultivo y conservación de A. fischeri a través de un método en 
México, otorgaría respuestas rápidas a consideraciones de toxicidad ambiental, 
además de permitir la disponibilidad del microorganismo para contribuir con las 
diferentes investigaciones que se generan en materia de efectos tóxicos en agua, 
suelo y sedimentos. La comparación de métodos disponibles y la selección del 
que otorgue mayores facilidades de crecimiento de A. fischeri, aumentan las 
posibilidades de disposición del microorganismo. 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
9 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
3. Antecedentes 
 
Mccann y colaboradores (2003) estudiaron la dinámica poblacional de A. fischeri 
en el calamar Euprymna scolopes, para lo que cultivaron A. fischeri en dos 
medios: Sea Water-Tryptone (SWT) y medio Luria Bertani sólido. Amos medios de 
cultivo inoculados fueron incubados a 28°C con un pH de 7.5, obteniendo cultivos 
conservados en ultracongelación que posteriormente fueron inoculados en un 
medio de agua de mar natural y presentaron una buena respuesta de 
colonización. 
 
En 2006, Sheerer y colaboradores desarrollaron un cultivo continuo en 
fermentador para A. fischeri con extracto de carne, peptona, pequeñas cantidades 
de NaCl y un regulador de fosfato, mediante el cual lograron mantener el pH en 
intervalos favorables. Encontraron que la temperatura donde las bacterias emiten 
mayor luminosidad es 26°C y que los cambios en la temperatura provocan 
cambios en la luminosidad. Reportaron que, en cultivo continuo bajo las 
condiciones utilizadas, las bacterias podrían mantenerse hasta por ocho semanas. 
 
Chong y colaboradores (2013) cultivaron A. fischeri en medio LB20 para evaluar la 
síntesis de señales de detección del quórum comparando densidad óptica y 
luminiscencia entre una cepa silvestre y una mutante. Ambas cepas cultivadas a 
30°C en agitación a 150 rpm y subcultivadas en medio fresco cada 24 horas 
durante 10 días, obteniendo resultados que sugieren que el gen luxI se mantiene 
en el genoma de A. fischeri por una función desconocida de relevancia para las 
células individuales. 
 
En 2016, Silva y colaboradores realizaron la caracterización morfológica de A. 
fischeri a partir de una cepa liofilizada. Sometieron el cultivo a una agitación de 
170 rpm y lo incubaron a 20 ° C. Separaron la biomasa por centrifugación a 2300 g 
durante 40 minutos con solución de NaCl a 2% y centrifugaron de nuevo. 
Utilizaron crioprotector congelado y la suspensión bacteriana obtenida fue 
congelada. 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
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<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
 
Recientemente, Castillo (2018) cultivó una cepa de A. fischeri para su uso como 
fuente alterna de iluminación. El cultivo se realizó en medio LB20 a diferentes 
concentraciones de NaCl, Triptona y extracto de levadura a 27 °C y pH 7. La 
luminiscencia fue obtenida a las 24 horas de incubación, siendo el medio con la 
mayor concentraciónde los tres elementos el que presentó mayor crecimiento. 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
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<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
4. Marco teórico 
 
4.1. Bioluminiscencia 
 
La bioluminiscencia es la energía química procedente de una reacción química 
exergónica que se transforma en energía luminosa, por lo que no depende de la 
absorción previa de luz (Martín y col., 2010). 
 
La luz que emiten los organismos vivos tiene diversas funciones en los individuos 
que la producen: algunos la utilizan como camuflaje, mientras que otros atraen a 
sus presas con ella. Algunos más la utilizan para alejar o distraer a los 
depredadores (Desdín, 2015). 
 
La producción de luminiscencia se lleva a cabo en diversos organismos como 
animales vertebrados e invertebrados, hongos, plantas, insectos y bacterias, 
siendo las bacterias marinas las más abundantes (Meighen, 1993). 
 
4.2. Bioluminiscencia bacteriana 
Las bacterias que poseen la capacidad de emitir luz, son en su mayoría bacterias 
marinas, que pueden encontrarse de manera libre o en simbiosis con algunos 
peces y calamares, aunque también hay especies que son saprófitas, es decir, 
habitan en animales muertos (Martín y col., 2010). 
 
Los géneros más representativos de bacterias bioluminiscentes son: 
Photobacterium spp, Aliivibrio spp y Vibrio spp y las más abundantes son Vibrio 
harveyi, Photobacterium phosphoreum y Aliivibrio fischeri. Aunque 
Photobacterium, Aliivibrio y Vibrio aislados son aerobios facultativos, sólo son 
bioluminiscentes en presencia de oxígeno (Madigan y col., 2015). 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
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<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
4.3. Aliivibrio fischeri 
 
Los miembros del género Aliivibrio son bacterias Gram-negativas, presentan forma 
de bacilo, y son motiles mediante un flagelo ubicado en uno de los polos del 
cuerpo celular; generalmente estos microorganismos se localizan en ambientes 
marinos. Tienen propiedades bioluminiscentes y se encuentran 
predominantemente en simbiosis con varios animales marinos. En estas bacterias 
el flagelo se considera como un factor de virulencia, debido a que participa de 
manera significativa en el proceso de invasión al hospedero (McCarter, 2001). 
 
Nealson y colaboradores (1979), descubrieron la percepción de quórum (número 
de individuos necesario para la luminiscencia) en A. fischeri. Cuando la bacteria se 
encuentra libre en agua de mar, su densidad normal es más bien baja y 
permanece en condiciones de oscuridad; sin embargo, al encontrarse en simbiosis 
en los órganos luminosos de calamares como Euprymna scolopes, forma densas 
poblaciones, y es entonces cuando genera la luz. 
 
La emisión de luz que realizan las bacterias bioluminiscentes, es dependiente de 
la enzima luciferasa. Esta es una enzima dimérica que consiste en dos 
subunidades (α y β), y tiene un peso molecular aproximado de 80 KDa (Wood, 
1998). La actividad catalítica de esta enzima requiere de tres substratos: luciferina, 
oxígeno y ATP. El producto de la actividad catalítica de esta enzima es un estado 
oxidado de la luciferina a un componente de dioxicetano. Este emite un fotón y 
produce CO2 y oxiluciferina. (Berovic y col., 2009). Considerando la estequiometría 
de la reacción, por cada molécula de ATP consumida se emite aproximadamente 
un fotón. Esta propiedad, junto con la alta especificidad de la enzima por el 
nucleótido, hace que esta reacción sea un sistema analítico ideal para detectar la 
presencia de ATP, su producción o consumo, que depende de la actividad 
enzimática y para cuantificar substratos relacionados con el metabolismo del ATP 
(García y col., 2001). 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
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<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
4.4. Aplicaciones biotecnológicas de Aliivibrio fischeri 
 
La regulación de la expresión de genes en el sistema de bioluminiscencia, permite 
una rápida identificación fenotípica gracias a la medición de luminiscencia emitida 
por el microorganismo, lo que facilita su aplicación biotecnológica. Uno de los 
problemas más importantes de contaminación ambiental, es la presencia de 
sustancias que pueden causar daños a la salud (Sáenz-Nevarez, 2010) y 
permanecer en el ambiente incluso generando metabolitos de mayor toxicidad. 
La bioluminiscencia bacteriana tiene varias aplicaciones biotecnológicas, entre las 
que destaca la detección y evaluación de sustancias tóxicas. Existen algunos 
sistemas que se comercializan y están validados para determinar, de manera 
rápida y eficaz, la presencia de diversos contaminantes ambientales (metales, 
detergentes, pesticidas, policlorobifenilos o bifenilos policlorados (PCB), 
hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), etc.) en muestras de agua, suelo y 
sedimentos. El principio para la detección de estas sustancias es la disminución 
de bioluminiscencia presentada en A. fischeri, que es causada por el 
contaminante. El sistema Microtox, que en un inicio era utilizado para muestras de 
agua, se ha modificado para la detección de sustancias tóxicas en ambientes 
terrestres o compuestos genotóxicos (Mutatox, Microtox-solid phase, Deltatox, 
etc.) a través de métodos estándar, aceptados por importantes agencias de 
protección ambiental (USA, UE). Por otra parte, los genes lux (AB ó CDABE) se 
han utilizado para una amplia gama de objetivos como inmunoensayos, detección 
de virus, control de procesos biotecnológicos, procesos de biorremediación, 
valoración de expresión de promotores, dispersión y colonización de bacterias 
patógenas en sus hospedadores, etc. (Martín y col., 2010). 
 
4.5. Condiciones de cultivo para Aliivibrio fischeri 
 
Las bacterias bioluminiscentes emiten luz sólo cuando existe alta densidad celular. 
El fenómeno de detección del quorum fue descrito por primera vez en 1970 por 
Nealson y col. al observar que la bioluminiscencia emitida por Photobacterium 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
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<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
fischeri (actualmente conocida como A. fischeri) no se detectaba hasta que se 
alcanzaba cierta densidad celular (Sáenz-Nevarez, 2010). Dado lo anterior, un 
medio de cultivo que permita una mayor reproducción de la bacteria, significará 
una mayor probabilidad de una producción estable de luz. 
Factores como la temperatura y el pH juegan papeles importantes en el cultivo de 
esta bacteria, que presenta una mayor densidad en medios con NaCl al 2%-5% 
(Soto y col., 2009) 
En cuanto a la temperatura, se maneja un intervalo amplio para el cultivo de A. 
fischeri, manteniéndose entre los 20 y los 35 °C, mientras que el pH debe 
mantenerse entre 5 y 9 (Hongda, y col., 2008). 
Hay también algunos factores que pueden influir en la estimulación o inhibición de 
la luminiscencia del microorganismo, como el contenido de iones inorgánicos 
presentes en el medio. La luminiscencia producida por A. fischeri necesita de la 
presencia de compuestos de azufre y se ve estimulada por la presencia de 
carbonatos (Tabei y col., 2011). 
 
Los requerimientos nutrimentales de las bacterias varían incluso dentro del mismo 
género. En el caso de A. fischeri, tiene requerimientos de pH y salinidad medio-
altos dada su naturaleza marina. A continuación, la tabla 1 muestra algunos de los 
requerimientos para su crecimiento, mismos que han sido previamente descritos 
 
Tabla 1. Requerimientos para crecimiento de A. fischeri (Tabei y col., 2011; Garrity y col., 
2001; Hongda y col., 2008) 
Fuentes de 
carbono 
Temperatura pH Salinidad Iones 
inorgánicos 
Glucosa Se desarrolla 
en un intervalo 
de 
temperatura 
de 20-35°C 
Crece en 
medios con 
pH entre 5-9 
1-6% NaCl MgSO4 
D-Manitol KCl 
L-Glutamato Carbonatos 
Salicina 
Trialosa 
Citrato 
Maltosa 
 
Nota: Esta tabla muestra los requerimientos nutrimentales, así como factores físicos y químicos que favorecenel 
crecimiento de A. fischeri 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
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<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
 
5. Objetivos 
 
5.1. Objetivo general 
Determinar las condiciones óptimas de cultivo y conservación de la bacteria 
Aliivibrio fischeri en medio sólido y líquido, teniendo como variable de 
respuesta la bioluminiscencia. 
 
5.2. Objetivos específicos 
 
Evaluar el crecimiento de Aliivibrio fischeri en tres medios de cultivo diferentes, 
mediante la bioluminiscencia y la densidad óptica. 
 
Probar la viabilidad de conservación de la bacteria Aliivibrio fischeri en medio 
sólido y líquido a corto plazo, mediante la medición de la bioluminiscencia 
producida y la densidad óptica de los cultivos. 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
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<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
6. Metodología 
 
 
6.1 Evaluación del crecimiento de la cepa de A. fischeri en tres 
medios de cultivo 
 
Se ensayaron tres medios de cultivo líquidos que reúnen los requerimientos 
nutrimentales del microorganismo (de acuerdo con Tabei y col., 2011; Garrity y 
col., 2001; Hongda y col., 2008) para seleccionar el más favorable para su 
crecimiento, dividiéndose la metodología en dos etapas (figura 1). 
 
Figura 1. Diagrama de la metodología. El inciso a) hace referencia a la etapa uno, mientras que el inciso b) hace 
referencia a la etapa dos. 
 
 
 a) 
 
 
 
 
 b) 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
17 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
 
 
Nota: Esta figura muestra las etapas que se llevaron a cabo durante la fase experimental del proyecto. 
 
6.1.1. Primera etapa 
 
Se seleccionaron tres medios de cultivo líquidos que cumplen los requerimientos 
nutrimentales de A. fischeri. Los medios de cultivo utilizados son los siguientes: 
 Photobacterium (Atlas, 2005): sal de acuario (33 g/L), extracto de levadura 
(5 g/L), triptona (5 g/L), NH4Cl (5 g/L), glicerol (6 g/L) y CaCO3 (1 g/L) 
 Sea Water Complete (Lebofee-Pierce, 2010): Peptona de caseína (5 g/L), 
extracto de levadura /5 g/L), extracto de carne (3 g/L), NaCl (17.5 g/L), KCl 
(7.5 g/L), MgSO4 (12.3 g/L) y CaCl2 (1.45 g/L) 
 LB20 (Petrun-Lostroh, 2013): Extracto de levadura (5 g/L), Triptona de 
caseína (10 g/L) y NaCl (20 g/L). 
 
 
 
 
Se establecieron las condiciones óptimas de reproducción de la bacteria marina A. 
fischeri identificando, además de los medios de cultivo, temperatura y pH. Se 
trabajó con una cepa liofilizada identificada como NRRL B-11177. La cepa 
liofilizada de la bacteria marina A. fischeri se reactivó con una solución a base de 
sales minerales (20 g NaCl2, 2.035 g de MgCl2 6H2O y 0.30 g de KCl por litro de 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
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<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
agua ultra pura, de acuerdo a lo indicado en la NMX-AA-112-SCFI-2017), 
incubando a 25-27°C (temperatura ambiente) con agitación de 100 rpm. Se 
verificó la luminiscencia de la bacteria en un luminómetro marca MICROBICS® 
modelo m500 (figura 2) y posteriormente se inocularon 3 mL en matraz 
Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo líquido. Este proceso se 
repitió en los tres medios seleccionados previamente esterilizados por calor 
húmedo, donde el vapor saturado a presión favorece la penetración del calor a la 
célula y por consiguiente la desnaturalización de proteínas (Acevedo y col., 2013). 
Se realizó en un equipo autoclave marca All American ® modelo 50x. 
 
Figura 2. Lectura en luminómetro de cepa liofilizada luego de reactivación 
 
 Nota: en esta figura se muestra la lectura proporcionada por el luminómetro al reactivar la cepa 
 liofilizada. 
 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
19 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
Además de los medios de cultivo seleccionados reportados para el crecimiento de 
la bacteria, se mantuvieron las condiciones identificadas como favorables para el 
cultivo del microorganismo: 
Tabla 2. Condiciones óptimas para el cultivo de A. fischeri previamente reportadas. 
Medios de cultivo reportados 
como funcionales para bacterias 
bioluminiscentes y utilizados en la 
fase de experimentación 
Condiciones 
recomendadas 
Condiciones 
ensayadas en este 
estudio 
LB20 (Petrun-Lostroh, 2013) pH 5-9 pH 7.5 
Sea Water Complete (Lebofee-
Pierce, 2010) 
Agitación de 75-
150 rpm 
Agitación de 100 rpm 
Photobacterium broth (Atlas, 
2005) 
Temperatura 20-
35°C 
Temperatura de 25-
27°C 
Nota: Se muestran las condiciones físicas y químicas aplicadas en fase experimental, en comparación con las condiciones 
recomendadas en la literatura. 
 
Los cultivos bacterianos fueron incubándose en agitación constante a temperatura 
ambiente de 25-27 °C y a un pH 7.5 ± 0,2 a 100 rpm durante un periodo de 48 
horas. 
Posteriormente se midió la bioluminiscencia de la bacteria en el luminómetro, así 
como DO en un espectofotómetro marca Genesys™ 10S modelo UV/VIS a λ=600 
nm. La curva de crecimiento fue construida con los datos de DO obtenidos en el 
transcurso de 48 horas en intervalos de 4 horas, se incluyeron los valores de la 
luminiscencia para su comparación, promediando las repeticiones en ambos 
parámetros. La luminiscencia también fue perceptible de manera visual (figura 3). 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
20 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
Figura 3. Matraces con cultivos luminiscentes 
 
 Nota: en esta figura se aprecia la luminiscencia de los cultivos de A. fischeri en medio líquido. 
 
 
6.1.2. Segunda etapa 
La técnica de conservación que se utilizó durante los períodos de trabajo fue el 
subcultivo seriado (Acevedo y col., 2013), lo que implica que la bacteria fue 
resembrada cada mes en los medios de cultivo seleccionados líquido y sólido. Se 
sembró en placas Petri solidificando los medios líquidos empleados mediante agar 
al 2%. Se resembró el microorganismo en medio líquido después de un mes de 
ser mantenida en medio sólido para verificar su viabilidad (figura 4). 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
21 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
 Figura 4. Siembra de medio sólido a líquido para verificar viabilidad 
 
 Nota: se muestra la toma de cultivo de A. fischeri para su siembra en medio líquido. 
 
Los cultivos de A. fischeri se conservaron en los medios de cultivo líquidos y 
fueron pasados de los matraces en agitación a viales de vidrio borosilicato de 3 
mL, siendo conservados en refrigeración a 4°C posterior a las lecturas iniciales de 
48 horas. De manera diaria, fueron agitados por medio de un equipo agitador 
vórtex marca Thermo Scientific® modelo M37615 (figura 5), para posteriormente 
medir la luminiscencia. Este procedimiento fue realizado durante 6 semanas. 
Los niveles de luminiscencia se promediaron por semana y fueron graficados 
comparando la luminiscencia generada en cada medio. 
 
 
 
 
 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
22 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
Figura 5. Agitación de viales para lectura de luminiscencia en luminómetro 
 
 Nota: se muestra la colocación del vial en el equipo vórtex al momento de su agitación y posterior 
 Lectura de luminiscencia. 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
23 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
7. Resultados y discusión 
 
 
7.1. Evaluación del crecimiento de la cepa de A. fischeri en 
tres medios de cultivo 
 
La cepa de A. fischeri reactivada con la solución base sales minarales (NMX-AA-
112-SCFI-2017) mostró una luminiscencia de 67 luxes. Esta solución cumplió el 
papel estabilizador de la membrana celular de la bacteria, permitiendo que 
reestableciera sus procesos metabólicos (McLeod y col., 1968). 
 
Serealizaron las mediciones de luminiscencia y densidad óptica (DO) en 
intervalos de 4 horas durante 48 horas. El medio Photobacterium alcanzó su 
máxima luminiscencia a las 24 horas (184 luxes), siendo visible desde las 12 
horas (figura 6 a) que corresponden a la fase exponencial de la curva de 
crecimiento (figura 6 b), con un tiempo de generación de 32.5 horas. Este medio 
contiene CaCO3 y glicerol como fuentes de carbono y NaCl, cuya combinación 
favorece la luminiscencia bacteriana (Ramesh y col., 2014). En la figura 6 b, se 
muestra la curva de crecimiento celular construida con los datos de DO. 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
24 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
Figura 6. a) Luminiscencia presentada en medio Photobacterium; b) Densidad óptica en medio Photobacterium a 48 
horas de incubación 
a) 
 
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Lu
m
in
is
ce
n
ci
a
 (
lu
xe
s)
Tiempo (horas)
 
 
 
 
 
b) 
 
Nota: Esta figura muestra la evolución en las lecturas de luminiscencia y DO durante las 48 horas de incubación de A. 
fischeri en el medio Photobacterium. 
 
 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
25 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
El medio Sea Water Complete alcanzó su máxima luminiscencia (14 luxes) a las 
12 horas de incubación (figura 7a, durante la fase de exponencial (figura 7 b) con 
un tiempo de generación de 33.9 horas. Esto puede deberse a los ácidos 
excretados por las células en medios complejos sin regulador de pH, lo que altera 
el pH reduciéndolo a un nivel que ya no resulta óptimo para la emisión de luz y el 
crecimiento (Nealson, 1979). 
 
Figura 7. a) Luminiscencia en medio SWC; b) Densidad óptica en medio SWC 
a) 
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Lu
m
in
is
ce
n
ci
a
 (
lu
xe
s)
Tiempo (horas)
 
 
b) 
y = -0.0013x2 + 0.0963x + 0.168
R² = 0.9776
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
D
O
 (
a
b
so
rb
a
n
ci
a
)
Tiempo (horas)
 
 Nota: se muestra la evolución de luminiscencia y DO en A. fischeri en 48 horas de incubación en medio 
 SWC 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
26 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
En cuanto al medio LB20, este tuvo una luminiscencia máxima de 172 luxes 
(figura 8 a), alcanzados a las 28 horas de incubación, correspondiente a la fase 
exponencial en la curva de crecimiento bacteriano (figura 8 b) con un tiempo de 
generación de 59 horas. Este medio cuenta con cantidades menores de elementos 
como el aminoácido arginina, que está contenido en la triptona de caseína y el 
extracto de levadura. Además, sólo cuenta con los aminoácidos presentes en 
estos sustratos, por lo que no hay fuentes de carbono adicionales. Esto puede 
generar ciertas condiciones de estrés a las bacterias, lo que puede detonar la 
necesidad de emitir luz. 
 
Figura 8. a) Luminiscencia en medio LB20; b) Densidad óptica en medio LB20 
a) 
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Lu
m
in
is
ce
n
ci
a
 (
lu
xe
s)
Tiempo (horas)
 
 
b) 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
27 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
 
 Nota: se muestra la evolución de la luminiscencia y DO de A. fischeri durante incubación de 48 horas en medio 
 LB20. 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
28 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
7.1.1. Comparación de medios 
 
Se realizó la comparación de las curvas de crcimientocelular de la bacteria crecida 
en los tres medios de cultivo, así como la luminiscencia para conocer la respuesta 
del microorganismo en cada medio. 
 
Figura 9. Comparativa de los niveles de luminiscencia alcanzados en los tres medios 
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Lu
m
in
is
ce
n
ci
a
 (
Lu
xe
s)
Tiempo (horas)
Photobacterium SWC LB20
 
 Nota: se muestra la comparación de la luminscencia obtenida en los diferentes medios de cultivo durante 48 
 horas de incubación. 
 
Los medios de cultivo Photobacterium y LB20 mostraron resultados similares, 
alcanzando lecturas de 184 y 172 luxes respectivamente a las 24 y 28 h de 
incubación respectivamente, mientras que el medio Sea Water Complete 
solamente alcanzó una luminiscencia de 14 luxes (figura 9), siendo este el que 
produce la luminiscencia más baja. 
Es probable que el medio Sea Water Complete no haya alcanzado los niveles de 
luminiscencia deseados debido a la acción del CaCl2 o a la presencia de lisina en 
el extracto de carne, elementos que pueden tener un efecto inhibitorio en la 
luminiscencia (Hastings y col.,1977). También se reporta que la mezcla de MgSO4 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
29 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
y KCl disminuye la luminiscencia (Tabei y col., 2012), elementos presentes en este 
medio. 
 
En cuanto a los medios Photobacterium y LB20, éstos cuentan con mayores 
cantidades de las sales minerales necesarias para el favorecimiento de la 
luminiscencia, además de la presencia de un regulador de pH (Tris, en el caso del 
medio Photobacterium), lo que coincide con lo reportado por Srivastava-MacLeod 
(1971), que mencionan la importancia nutricional de éstas para el crecimiento de 
las bacterias marinas bioluminiscentes y la inhibición del crecimiento de A. fischeri 
en un medio con sales, pero sin capacidad amortiguadora de pH. 
 
Por otro lado, el crecimiento bacteriano se muestra similar en los tres medios 
(figura 10), con un tiempo de generación promedio de 17 horas y 1.6 
generaciones. Los tres medios de cultivo cuentan con fuentes de carbono y 
condiciones que permitieron el crecimiento bacteriano. 
Figura 10. Comparación de densidad óptica observada en los tres medios de cultivo 
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
D
O
 (
a
b
so
rb
a
n
ci
a
)
Tiempo (horas)
Photobacterium SWC LB20
 
 Nota: se compara la DO observada en los tres medios de cultivo durante 48 horas de incubación. 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
30 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
Se comparó también la luminiscencia con respecto al crecimiento bacteriano (Fig. 
11, 12 y 13) para conocer si había relación entre ambas, no encontrándose 
correlaciones fuertes en ninguno de los casos de acuerdo con los datos de r2, que 
es el coeficiente de determinación que indica la correlación entre variables. Esto 
coincide con Hongda (2008), que reportó que las condiciones óptimas de 
crecimiento son diferentes a las de la bioluminiscencia. Aunado a esto, es posible 
que las bacterias inertes que permanecen en el medio, interfieran con la densidad 
óptica detectada, por lo que la densidad del medio podría deberse a bacterias 
inertes que no emiten luminiscencia. 
 
Figura 11. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio Photobacterium 
 
R² = 0.5976
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 0.5 1 1.5 2 2.5
Lu
m
in
is
ce
n
ci
a
 (
lu
xe
s)
DO (Absorbancia)
 
 Nota: Se muestra el nivel de correlación entre DO y luminiscencia presentada en el medio Photobacterium 
 durante 48 horas de incubación 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
31 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
 
Figura 12. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio SWC 
R² = 0.618
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 0.5 1 1.5 2
Lu
m
in
is
ce
n
ci
a
 (
lu
xe
s)
DO (Absorbancia)
 
Nota: En esta figura se presenta la baja correlación existente entre la DO y la luminiscencia observadas durante 
 48 horas de incubación en el medio SWC. 
 
 
 
 
Figura 13. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio LB20 
R² = 0.5174
-200
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 0.5 1 1.5 2
Lu
m
in
is
c
e
n
c
ia
 (
lu
x
e
s
)
DO (absorbancia)
 
 Nota: En esta figura se muestra el nivel de correlación entre la DO y la luminiscencia en el medio LB20 durante 48 
 horas de incubación. 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
32 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
7.2 Viabilidad de conservación de la bacteria Aliivibrio fischeri 
en medio sólido y líquido a corto plazo, mediante la medición 
de la bioluminiscencia producida y densidad óptica de los 
cultivos. 
 
Los cultivos líquidos de A. fischeri que se sembraron en los tres medios en su fase 
sólida presentaron crecimiento a las 12 horas después de la siembra (figura 14); 
no presentaron luminiscencia. Esto puede deberse a la disponibilidad de los 
compuestos, que, al pasar de medio líquido a sólido, disminuye. 
 
Figura 14. Crecimiento en placa de A. fischeri 
 
 Nota: en esta figura se presenta el crecimiento de A. fischeri en placa en el medio SWC. 
 
Bajo estas condiciones de cultivo, Después de la resiembra de placa a medio 
líquido, sólo el cultivo del medio LB20 presentó luminiscencia (figura 15), lo que 
puede deberse a que, en un medio con menor cantidad de componentes como es 
el caso del LB20, éstos están definidos y los inhibidores presentes en el medio 
complejo están ausentes (Hastigs-Nealson,1977). Otra posibilidad es que, al haber 
estrés por la escasez de nutrientes en un medio simple, las bacterias hagan uso 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
33 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
de la bioluminiscencia, que no les proporciona ninguna ventaja en condiciones sin 
estrés (Węgrzyn y col., 2002). 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
34 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
Figura 15. Luminiscencia a un mes de conservación en medio sólido 
0
50
100
150
200
250
300
0 4 8 12 16 20 24
Lu
m
in
is
ce
n
ci
a
 (
lu
xe
s)
Tiempo (horas)
Photobacterium SWC LB20
 
Nota: En esta figura se muestra la luminiscencia observada en cada uno de los tres medios luego de un mes de 
conservación en medio sólido. Se monitoreó la luminiscencia cada cuatro horas durante 24 horas. 
 
En cuanto a los viales preservados en medio líquido en refrigeración a 4°C, 
presentaron elevados niveles de luminiscencia, con lecturas de hasta 250 luxes 
(figura 16), incluso superiores a la etapa de incubación en la fase exponencial de 
la curva de crecimiento, lo que puede indicar que A. fischeri ve favorecida la 
emisión de luminiscencia a temperaturas incluso muy inferiores a las reportadas 
por Silva y col. (2016), que cultivaron el microorganismo a 20°C, Scheerer y col. 
(2006), reportando incubación a 26°C; y Castillo (2018), que realizó cultivos a 
27°C. En el manual de Bergey (Garrity y col., 2001) también se sugiere que la 
temperatura óptima para el cultivo de A. fischeri es de 35°C para observar 
luminiscencia. Además, se puede observar una fase estacionaria prolongada a 
esta temperatura en los medios líquidos. 
 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
35 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
Figura 16. Luminiscencia obtenida durante seis semanas de conservación en medio líquido 
 
Nota: Se muestra la luminiscencia observada en los tres medios de cultivo durante seis semanas de conservación en medio 
líquido. 
 
Como se puede apreciar en la figura 16, la luminiscencia detectada en el medio de 
cultivo SWC, comenzó a decrecer a la semana cuatro, mientras que en los medios 
LB20 y Photobacterium, se continuaron registrando niveles de luminiscencia por 
encima de 200 luxes. La capacidad previamente mencionada de los medios 
Photobacterium y LB20 de estimular la producción de luminiscencia en A. fischeri, 
puede tener influencia en estos resultados, manteniendo sus nutrientes 
disponibles para los microorganismos por un tiempo más prolongado. La 
luminiscencia expresada por A. fischeri en el medio LB20 empezó a decrecer en la 
semana 6, conservando lecturas de hasta 200 luxes. Mientras, en el medio 
Photobacterium continúa con lecturas superiores a los 250 luxes sin que se note 
una reducción después de seis semanas. Al tener una mayor cantidad de fuentes 
de carbono y de iones inorgánicos estimuladores de la luminiscencia bacteriana, 
Photobacterium resulta ser el medio en el que las bacterias conservan su 
luminiscencia y una densidad poblacional que permite la detección del quorum. 
Estos resultados confirman que A. fischeri expresa los niveles más altos de 
luminiscencia en los medios de cultivo Photobacterium y LB20 en comparación 
con el medio SWC. 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
36 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
Considerando que los medios de cultivo donde se obtuvo mejor luminiscencia 
fueron los medios Photobacterium (152 luxes) y LB0 (174 luxes) durante la fase 
exponencial de la curva de crecimiento celular y durante la conservación en medio 
líquido (250 luxes durante seis y cuatro semanas respectivamente), es pertinente 
hacer una comparación de la complejidad de preparación. 
Tabla 3. Componentes de los medios Photobacterium y LB20 
Componentes Photobacterium LB20 
Sal de acuario 33 g/L 
Tris 6 g/L 
Extracto de levadura 5 g/L 5 g/L 
Triptona 5 g/L 10 g/L 
NH4Cl 5 g/L 
Glicerol 6 g/L 
CaCO3 1 g/L 
NaCl 20 g/L 
Nota: En esta tabla se muestran los componentes de los medios Photobacterium y LB20 a fin de comparar la complejidad 
de su preparación. 
 
Tal como podemos observar en la tabla 3, la cantidad de elementos presentes en 
el medio Photobacterium es muy superior en comparación con la cantidad de 
elementos presentes en el medio LB20, por lo que este último resulta menos 
complejo en su preparación, lo que puede representar una ventaja económica y 
logística. 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
37 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
8. Conclusiones 
 
 
De acuerdo a los objetivos planteados y los resultados obtenidos bajo las 
condiciones específicas del presente estudio, se concluye lo siguiente: 
 
1. La bacteria A. fischeri expresó los niveles más altos de luminiscencia 
durante la fase exponencial del ciclo de crecimiento celular en los tres 
medios ensayados. 
 
2. La expresión de la luminiscencia no es directamente proporcional a la 
concentración celular bacteriana. 
 
3. A. fischeri puede ser cultivado de forma óptima en el medio líquido 
Photobacterium, a 25-27 ºC, en condiciones de agitación a 100 r.p.m., 
alcanzando una luminiscencia de hasta 184 luxes a las 24 h de incubación 
que corresponde a la fase exponencial de la curva de crecimiento celular. 
 
4. A. fischeri puede ser mantenida viable durante seis semanas en los medios 
líquidos Photobacterium y LB20 a 4°C reactivando la luminiscencia 
mediante agitación para proporcionar el oxígeno necesario, alcanzando una 
luminiscencia de hasta 250 luxes. 
 
5. A. fischeri expresa los niveles más altos de luminiscencia en los medios de 
cultivo Photobacterium y LB20, en comparación con el medio SWC. 
 
 
 
 
Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 
38 
<Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 
9. Referencias bibliográficas 
 
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