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DIVISIÓN ACADÉMICA DE CIENCIAS BIOLÓGICAS CULTIVO Y CONSERVACIÓN DE Aliivibrio fischeri ASESORA Dra. Verónica Isidra Domínguez Rodríguez TESIS Que para obtener el grado de Maestro en ingeniería, tecnología y gestión ambiental PRESENTA Martha Aurora López Padrón VILLAHERMOSA, TABASCO. ABRIL DE 2021 Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 2 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= <La ciencia no es perfecta, con frecuencia se utiliza mal, no es más que una herramienta, pero es la mejor herramienta que tenemos; se corrige a sí misma, está siempre evolucionando y se puede aplicar a todo. Con esta herramienta conquistamos lo imposible.= - Carl Sagan. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 3 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= DEDICATORIA A la memoria de mi madre, deseando su paz eterna. Siempre serás parte fundamental de todo lo que soy. A mi Poky, por toda tu paciencia y apoyo que son invaluables para mí. A mi hermano Luis, por las pocas, pero nutridas conversaciones que me ayudan a crecer y me inspiran a ser mejor. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 4 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= AGRADECIMIENTOS Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el apoyo económico brindado para la obtención de grado. A mi asesora de tesis, la Dra. Verónica Domínguez por la oportunidad y apoyo para realizar este trabajo de investigación. A mi comité sinodal por sus valiosas aportaciones para la mejora de este trabajo. De manera especial a la Dra. Consuelo Bautista por su esmero e interés. Infinitas gracias. Al Dr. Juan José Valdés de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, por su apoyo incondicional y totalmente desinteresado al aportar sus conocimientos. Más científicos como usted. A Liliana Hernández, Fidel Arias y Anahy Castro por todo su apoyo, pero sobre todo por su invaluable amistad. Los quiero. A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Remediación: Gero, Paco, maestro Saúl, Karen, Evelyn, Fany, Pascual, Paulo, Eder, Dr. Eduardo, Conta. A mis compañeros de maestría: Arce, Fátima, Luis y Michel por ser los mejores compañeros en este camino. Gracias por las risas, el apoyo y los ánimos. A mi amigo Allan, por haberte convertido en pieza clave en mi vida y brindarme tu apoyo y cariño incondicionales ante las adversidades que pasé. Mil gracias por todo lo que haces por mí. Te quiero. Por último, pero no menos importante, a mi mejor amiga Minú, por permanecer luego de tantos tropiezos y unirnos más a través de los años. Gracias por las porras y tu amistad sólida y sincera. Te quiero mucho. 11% ÍNDICE DE SIMILITUD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri INFORME DE ORIGINALIDAD FUENTES PRIMARIAS www.posgradoeinvestigacion.uadec.mx Internet revistareduca.es Internet www.medigraphic.com Internet maestradelia.wordpress.com Internet hdl.handle.net Internet www.tandfonline.com Internet www.delaval.com.mx Internet cicy.repositorioinstitucional.mx Internet G. Álvarez-Coronel, V. I. Domínguez-Rodríguez, N. Ovando-García, R. H. Adams. "Stabilization and solidification technology for treating heavy oil-contaminated sediments", International Journal of Environmental Science and Technology, 2021 Crossref www.docsity.com Internet 236 palabras 4 4% 145 palabras 4 2% 72 palabras 4 1% 55 palabras 4 1% 43 palabras 4 1% 19 palabras 4 < 1% 18 palabras 4 < 1% 16 palabras 4 < 1% 16 palabras 4 < 1% 12 palabras 4 < 1% Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 5 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Contenido 1. Introducción ....................................................................................................... 7 2. Justificación ....................................................................................................... 8 3. Antecedentes ..................................................................................................... 9 4. Marco teórico .................................................................................................... 11 4.1. Bioluminiscencia ............................................................................................... 11 4.2. Bioluminiscencia bacteriana .............................................................................. 11 4.3. Aliivibrio fischeri ................................................................................................ 12 4.4. Aplicaciones biotecnológicas de Aliivibrio fischeri ............................................. 13 4.5. Condiciones de cultivo para Aliivibrio fischeri .................................................... 13 5. Objetivos ............................................................................................................ 15 5.1. Objetivo general ................................................................................................ 15 5.2. Objetivos específicos ........................................................................................ 15 6. Metodología ....................................................................................................... 16 6.1 Evaluación del crecimiento de la cepa de A. fischeri en tres medios de cultivo . 16 6.1.1. Primera etapa ..................................................................................................................... 17 6.1.2. Segunda etapa ................................................................................................................... 20 7. Resultados y discusión ................................................................................... 23 7.1. Evaluación del crecimiento de la cepa de A. fischeri en tres medios de cultivo . 23 7.1.1. Comparación de medios ................................................................................................... 28 ....................................................................................................................................... 12.2 Viabilidad de conservación de la bacteria Aliivibrio fischeri en medio sólido y líquido a corto plazo, mediante la medición de la bioluminiscencia producida y densidad óptica de los cultivos. ................................................................................................... 32 8. Conclusiones .................................................................................................... 37 9. Referencias bibliográficas .............................................................................. 38 Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 6 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Contenido de figuras Figura 1. Diagrama de la metodología .............................................................................................. 16 Figura 2. Lectura en luminómetro de cepa liofilizada ....................................................................... 18 Figura 3. Matraces con cultivos luminiscentes ................................................................................. 20 Figura 4. Siembra de medio sólido a líquido para verificar viabilidad ............................................... 21 Figura 5. Agitación de viales para lectura de luminiscencia en luminómetro ................................... 22 Figura 6. a) Luminiscencia presentada en medio Photobacterium; b) Densidad óptica en medio Photobacterium a 48 horas de incubación ............................................................................... 24 Figura 7. a) Luminiscencia en medio SWC; b) Densidad óptica en medio SWC ............................. 25 Figura 8. a) Luminiscencia en medio LB20; b) Densidad óptica en medio LB20 ............................. 26 Figura 9. Comparativa de los niveles de luminiscencia alcanzadosen los tres medios .................. 28 Figura 10. Comparación de densidad óptica observada en los tres medios de cultivo .................... 29 Figura 11. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio Photobacterium ............................... 30 Figura 12. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio SWC ................................................ 31 Figura 13. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio LB20 ................................................ 31 Figura 14. Crecimiento en placa de A. fischeri ................................................................................. 32 Figura 15. Luminiscencia a un mes de conservación en medio sólido ............................................. 34 Figura 16. Luminiscencia obtenida durante seis semanas de conservación en medio líquido ........ 35 Contenido de tablas Tabla 1. Requerimientos para crecimiento de A. fischeri ................................................................. 14 Tabla 2. Condiciones de cultivo identificadas en la bibliografía consultada. .................................... 19 Tabla 3. Componentes de los medios Photobacterium y LB20 ........................................................ 36 Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 7 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 1. Introducción Las actividades industriales en la vida cotidiana, son una de las principales fuentes de peligros ambientales, y el ser humano está en riesgo al vivir en un medio dañado por la contaminación y las sustancias tóxicas que se encuentran en el ambiente, cuyo saneamiento y conservación influyen directamente en la calidad de vida de la población. Uno de los principales aspectos que considera la legislación mundial en materia de residuos, aire, agua y suelo, es la prevención de efectos tóxicos en la salud humana por contaminación química. Se considera tóxico a aquel compuesto capaz de alterar el funcionamiento de un sistema biológico e incluso causar su muerte. La toxicidad que presenta una sustancia está medida por la determinación de la concentración media que resulta letal para el 50% de una población expuesta de forma aguda a dicha sustancia (Moreno, 2003). Las bacterias marinas luminiscentes son bioindicadores, para la evaluación de toxicidad en aguas y sedimentos y actualmente se emplean como biosensores para identificar diversos contaminantes ambientales al ser posible medir la luminiscencia que producen durante su metabolismo, que permite identificar un efecto positivo o negativo de una sustancia a través del aumento o la disminución (respectivamente) de la lumiscencia. Aliivibrio fischeri (A. fischeri) es una bacteria bioluminiscente que se encuentra frecuentemente en relaciones simbióticas con animales marinos como el calamar bobtail (Euprymna scolopes). Su bioluminiscencia proviene de la expresión de una serie de proteínas contenidas en el operón lux (Madigan y col., 2015) y es ampliamente utilizada para realizar bioensayos de toxicidad, lo que genera interés en el estudio de sus características. En este trabajo se compararán tres métodos considerados adecuados para la reproducción y conservación de la bacteria A. fischeri. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 8 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 2. Justificación La detección y evaluación de la toxicidad en agua, suelo y sedimentos permite un monitoreo oportuno a los trabajos de remediación de sitios, además de brindar información sobre los metabolitos resultantes de la transformación de las sustancias primarias. Los ensayos basados en animales, plantas y algas son costosos, lentos y requieren un gran volumen de muestra; estudios recientes han enfatizado los beneficios de ensayos bacterianos rápidos, reproducibles y rentables para la detección y evaluación de toxicidad (Isenberg, 1993). En México se cuenta con un número limitado de pruebas normadas para el área de bioensayos de toxicidad y éstas son: NMX-AA-087-SCFI-2010, para Análisis de agua-evaluación de toxicidad aguda con Daphnia magna straus (Crustacea-cladocera). NMX-AA-110-1995-SCFI, para Análisis de agua- evaluación de toxicidad aguda con Artemia franciscana kellogg (Crustacea-anostraca). NMX-AA-112-SCFI-2017, para Análisis de Agua y Sedimentos - Evaluación de Toxicidad Aguda con Vibrio fischeri. Resulta frecuente que se elijan como la primera prueba de toxicidad aguda los bioensayos con A. fischeri al obtener resultados más rápidos y ser pruebas menos costosas. Se ha informado en varios trabajos de investigación que el ensayo de bioluminiscencia usando A. fischeri es el más sensible en una amplia gama de productos químicos en comparación con otros ensayos bacterianos como la inhibición de la nitrificación, la respirometría, la luminiscencia de ATP y la inhibición de enzimas (Parvez y col., 2006). La viabilidad del cultivo y conservación de A. fischeri a través de un método en México, otorgaría respuestas rápidas a consideraciones de toxicidad ambiental, además de permitir la disponibilidad del microorganismo para contribuir con las diferentes investigaciones que se generan en materia de efectos tóxicos en agua, suelo y sedimentos. La comparación de métodos disponibles y la selección del que otorgue mayores facilidades de crecimiento de A. fischeri, aumentan las posibilidades de disposición del microorganismo. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 9 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 3. Antecedentes Mccann y colaboradores (2003) estudiaron la dinámica poblacional de A. fischeri en el calamar Euprymna scolopes, para lo que cultivaron A. fischeri en dos medios: Sea Water-Tryptone (SWT) y medio Luria Bertani sólido. Amos medios de cultivo inoculados fueron incubados a 28°C con un pH de 7.5, obteniendo cultivos conservados en ultracongelación que posteriormente fueron inoculados en un medio de agua de mar natural y presentaron una buena respuesta de colonización. En 2006, Sheerer y colaboradores desarrollaron un cultivo continuo en fermentador para A. fischeri con extracto de carne, peptona, pequeñas cantidades de NaCl y un regulador de fosfato, mediante el cual lograron mantener el pH en intervalos favorables. Encontraron que la temperatura donde las bacterias emiten mayor luminosidad es 26°C y que los cambios en la temperatura provocan cambios en la luminosidad. Reportaron que, en cultivo continuo bajo las condiciones utilizadas, las bacterias podrían mantenerse hasta por ocho semanas. Chong y colaboradores (2013) cultivaron A. fischeri en medio LB20 para evaluar la síntesis de señales de detección del quórum comparando densidad óptica y luminiscencia entre una cepa silvestre y una mutante. Ambas cepas cultivadas a 30°C en agitación a 150 rpm y subcultivadas en medio fresco cada 24 horas durante 10 días, obteniendo resultados que sugieren que el gen luxI se mantiene en el genoma de A. fischeri por una función desconocida de relevancia para las células individuales. En 2016, Silva y colaboradores realizaron la caracterización morfológica de A. fischeri a partir de una cepa liofilizada. Sometieron el cultivo a una agitación de 170 rpm y lo incubaron a 20 ° C. Separaron la biomasa por centrifugación a 2300 g durante 40 minutos con solución de NaCl a 2% y centrifugaron de nuevo. Utilizaron crioprotector congelado y la suspensión bacteriana obtenida fue congelada. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 10 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Recientemente, Castillo (2018) cultivó una cepa de A. fischeri para su uso como fuente alterna de iluminación. El cultivo se realizó en medio LB20 a diferentes concentraciones de NaCl, Triptona y extracto de levadura a 27 °C y pH 7. La luminiscencia fue obtenida a las 24 horas de incubación, siendo el medio con la mayor concentraciónde los tres elementos el que presentó mayor crecimiento. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 11 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 4. Marco teórico 4.1. Bioluminiscencia La bioluminiscencia es la energía química procedente de una reacción química exergónica que se transforma en energía luminosa, por lo que no depende de la absorción previa de luz (Martín y col., 2010). La luz que emiten los organismos vivos tiene diversas funciones en los individuos que la producen: algunos la utilizan como camuflaje, mientras que otros atraen a sus presas con ella. Algunos más la utilizan para alejar o distraer a los depredadores (Desdín, 2015). La producción de luminiscencia se lleva a cabo en diversos organismos como animales vertebrados e invertebrados, hongos, plantas, insectos y bacterias, siendo las bacterias marinas las más abundantes (Meighen, 1993). 4.2. Bioluminiscencia bacteriana Las bacterias que poseen la capacidad de emitir luz, son en su mayoría bacterias marinas, que pueden encontrarse de manera libre o en simbiosis con algunos peces y calamares, aunque también hay especies que son saprófitas, es decir, habitan en animales muertos (Martín y col., 2010). Los géneros más representativos de bacterias bioluminiscentes son: Photobacterium spp, Aliivibrio spp y Vibrio spp y las más abundantes son Vibrio harveyi, Photobacterium phosphoreum y Aliivibrio fischeri. Aunque Photobacterium, Aliivibrio y Vibrio aislados son aerobios facultativos, sólo son bioluminiscentes en presencia de oxígeno (Madigan y col., 2015). Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 12 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 4.3. Aliivibrio fischeri Los miembros del género Aliivibrio son bacterias Gram-negativas, presentan forma de bacilo, y son motiles mediante un flagelo ubicado en uno de los polos del cuerpo celular; generalmente estos microorganismos se localizan en ambientes marinos. Tienen propiedades bioluminiscentes y se encuentran predominantemente en simbiosis con varios animales marinos. En estas bacterias el flagelo se considera como un factor de virulencia, debido a que participa de manera significativa en el proceso de invasión al hospedero (McCarter, 2001). Nealson y colaboradores (1979), descubrieron la percepción de quórum (número de individuos necesario para la luminiscencia) en A. fischeri. Cuando la bacteria se encuentra libre en agua de mar, su densidad normal es más bien baja y permanece en condiciones de oscuridad; sin embargo, al encontrarse en simbiosis en los órganos luminosos de calamares como Euprymna scolopes, forma densas poblaciones, y es entonces cuando genera la luz. La emisión de luz que realizan las bacterias bioluminiscentes, es dependiente de la enzima luciferasa. Esta es una enzima dimérica que consiste en dos subunidades (α y β), y tiene un peso molecular aproximado de 80 KDa (Wood, 1998). La actividad catalítica de esta enzima requiere de tres substratos: luciferina, oxígeno y ATP. El producto de la actividad catalítica de esta enzima es un estado oxidado de la luciferina a un componente de dioxicetano. Este emite un fotón y produce CO2 y oxiluciferina. (Berovic y col., 2009). Considerando la estequiometría de la reacción, por cada molécula de ATP consumida se emite aproximadamente un fotón. Esta propiedad, junto con la alta especificidad de la enzima por el nucleótido, hace que esta reacción sea un sistema analítico ideal para detectar la presencia de ATP, su producción o consumo, que depende de la actividad enzimática y para cuantificar substratos relacionados con el metabolismo del ATP (García y col., 2001). Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 13 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 4.4. Aplicaciones biotecnológicas de Aliivibrio fischeri La regulación de la expresión de genes en el sistema de bioluminiscencia, permite una rápida identificación fenotípica gracias a la medición de luminiscencia emitida por el microorganismo, lo que facilita su aplicación biotecnológica. Uno de los problemas más importantes de contaminación ambiental, es la presencia de sustancias que pueden causar daños a la salud (Sáenz-Nevarez, 2010) y permanecer en el ambiente incluso generando metabolitos de mayor toxicidad. La bioluminiscencia bacteriana tiene varias aplicaciones biotecnológicas, entre las que destaca la detección y evaluación de sustancias tóxicas. Existen algunos sistemas que se comercializan y están validados para determinar, de manera rápida y eficaz, la presencia de diversos contaminantes ambientales (metales, detergentes, pesticidas, policlorobifenilos o bifenilos policlorados (PCB), hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), etc.) en muestras de agua, suelo y sedimentos. El principio para la detección de estas sustancias es la disminución de bioluminiscencia presentada en A. fischeri, que es causada por el contaminante. El sistema Microtox, que en un inicio era utilizado para muestras de agua, se ha modificado para la detección de sustancias tóxicas en ambientes terrestres o compuestos genotóxicos (Mutatox, Microtox-solid phase, Deltatox, etc.) a través de métodos estándar, aceptados por importantes agencias de protección ambiental (USA, UE). Por otra parte, los genes lux (AB ó CDABE) se han utilizado para una amplia gama de objetivos como inmunoensayos, detección de virus, control de procesos biotecnológicos, procesos de biorremediación, valoración de expresión de promotores, dispersión y colonización de bacterias patógenas en sus hospedadores, etc. (Martín y col., 2010). 4.5. Condiciones de cultivo para Aliivibrio fischeri Las bacterias bioluminiscentes emiten luz sólo cuando existe alta densidad celular. El fenómeno de detección del quorum fue descrito por primera vez en 1970 por Nealson y col. al observar que la bioluminiscencia emitida por Photobacterium Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 14 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= fischeri (actualmente conocida como A. fischeri) no se detectaba hasta que se alcanzaba cierta densidad celular (Sáenz-Nevarez, 2010). Dado lo anterior, un medio de cultivo que permita una mayor reproducción de la bacteria, significará una mayor probabilidad de una producción estable de luz. Factores como la temperatura y el pH juegan papeles importantes en el cultivo de esta bacteria, que presenta una mayor densidad en medios con NaCl al 2%-5% (Soto y col., 2009) En cuanto a la temperatura, se maneja un intervalo amplio para el cultivo de A. fischeri, manteniéndose entre los 20 y los 35 °C, mientras que el pH debe mantenerse entre 5 y 9 (Hongda, y col., 2008). Hay también algunos factores que pueden influir en la estimulación o inhibición de la luminiscencia del microorganismo, como el contenido de iones inorgánicos presentes en el medio. La luminiscencia producida por A. fischeri necesita de la presencia de compuestos de azufre y se ve estimulada por la presencia de carbonatos (Tabei y col., 2011). Los requerimientos nutrimentales de las bacterias varían incluso dentro del mismo género. En el caso de A. fischeri, tiene requerimientos de pH y salinidad medio- altos dada su naturaleza marina. A continuación, la tabla 1 muestra algunos de los requerimientos para su crecimiento, mismos que han sido previamente descritos Tabla 1. Requerimientos para crecimiento de A. fischeri (Tabei y col., 2011; Garrity y col., 2001; Hongda y col., 2008) Fuentes de carbono Temperatura pH Salinidad Iones inorgánicos Glucosa Se desarrolla en un intervalo de temperatura de 20-35°C Crece en medios con pH entre 5-9 1-6% NaCl MgSO4 D-Manitol KCl L-Glutamato Carbonatos Salicina Trialosa Citrato Maltosa Nota: Esta tabla muestra los requerimientos nutrimentales, así como factores físicos y químicos que favorecenel crecimiento de A. fischeri Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 15 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 5. Objetivos 5.1. Objetivo general Determinar las condiciones óptimas de cultivo y conservación de la bacteria Aliivibrio fischeri en medio sólido y líquido, teniendo como variable de respuesta la bioluminiscencia. 5.2. Objetivos específicos Evaluar el crecimiento de Aliivibrio fischeri en tres medios de cultivo diferentes, mediante la bioluminiscencia y la densidad óptica. Probar la viabilidad de conservación de la bacteria Aliivibrio fischeri en medio sólido y líquido a corto plazo, mediante la medición de la bioluminiscencia producida y la densidad óptica de los cultivos. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 16 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 6. Metodología 6.1 Evaluación del crecimiento de la cepa de A. fischeri en tres medios de cultivo Se ensayaron tres medios de cultivo líquidos que reúnen los requerimientos nutrimentales del microorganismo (de acuerdo con Tabei y col., 2011; Garrity y col., 2001; Hongda y col., 2008) para seleccionar el más favorable para su crecimiento, dividiéndose la metodología en dos etapas (figura 1). Figura 1. Diagrama de la metodología. El inciso a) hace referencia a la etapa uno, mientras que el inciso b) hace referencia a la etapa dos. a) b) Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 17 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Nota: Esta figura muestra las etapas que se llevaron a cabo durante la fase experimental del proyecto. 6.1.1. Primera etapa Se seleccionaron tres medios de cultivo líquidos que cumplen los requerimientos nutrimentales de A. fischeri. Los medios de cultivo utilizados son los siguientes: Photobacterium (Atlas, 2005): sal de acuario (33 g/L), extracto de levadura (5 g/L), triptona (5 g/L), NH4Cl (5 g/L), glicerol (6 g/L) y CaCO3 (1 g/L) Sea Water Complete (Lebofee-Pierce, 2010): Peptona de caseína (5 g/L), extracto de levadura /5 g/L), extracto de carne (3 g/L), NaCl (17.5 g/L), KCl (7.5 g/L), MgSO4 (12.3 g/L) y CaCl2 (1.45 g/L) LB20 (Petrun-Lostroh, 2013): Extracto de levadura (5 g/L), Triptona de caseína (10 g/L) y NaCl (20 g/L). Se establecieron las condiciones óptimas de reproducción de la bacteria marina A. fischeri identificando, además de los medios de cultivo, temperatura y pH. Se trabajó con una cepa liofilizada identificada como NRRL B-11177. La cepa liofilizada de la bacteria marina A. fischeri se reactivó con una solución a base de sales minerales (20 g NaCl2, 2.035 g de MgCl2 6H2O y 0.30 g de KCl por litro de Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 18 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= agua ultra pura, de acuerdo a lo indicado en la NMX-AA-112-SCFI-2017), incubando a 25-27°C (temperatura ambiente) con agitación de 100 rpm. Se verificó la luminiscencia de la bacteria en un luminómetro marca MICROBICS® modelo m500 (figura 2) y posteriormente se inocularon 3 mL en matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo líquido. Este proceso se repitió en los tres medios seleccionados previamente esterilizados por calor húmedo, donde el vapor saturado a presión favorece la penetración del calor a la célula y por consiguiente la desnaturalización de proteínas (Acevedo y col., 2013). Se realizó en un equipo autoclave marca All American ® modelo 50x. Figura 2. Lectura en luminómetro de cepa liofilizada luego de reactivación Nota: en esta figura se muestra la lectura proporcionada por el luminómetro al reactivar la cepa liofilizada. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 19 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Además de los medios de cultivo seleccionados reportados para el crecimiento de la bacteria, se mantuvieron las condiciones identificadas como favorables para el cultivo del microorganismo: Tabla 2. Condiciones óptimas para el cultivo de A. fischeri previamente reportadas. Medios de cultivo reportados como funcionales para bacterias bioluminiscentes y utilizados en la fase de experimentación Condiciones recomendadas Condiciones ensayadas en este estudio LB20 (Petrun-Lostroh, 2013) pH 5-9 pH 7.5 Sea Water Complete (Lebofee- Pierce, 2010) Agitación de 75- 150 rpm Agitación de 100 rpm Photobacterium broth (Atlas, 2005) Temperatura 20- 35°C Temperatura de 25- 27°C Nota: Se muestran las condiciones físicas y químicas aplicadas en fase experimental, en comparación con las condiciones recomendadas en la literatura. Los cultivos bacterianos fueron incubándose en agitación constante a temperatura ambiente de 25-27 °C y a un pH 7.5 ± 0,2 a 100 rpm durante un periodo de 48 horas. Posteriormente se midió la bioluminiscencia de la bacteria en el luminómetro, así como DO en un espectofotómetro marca Genesys™ 10S modelo UV/VIS a λ=600 nm. La curva de crecimiento fue construida con los datos de DO obtenidos en el transcurso de 48 horas en intervalos de 4 horas, se incluyeron los valores de la luminiscencia para su comparación, promediando las repeticiones en ambos parámetros. La luminiscencia también fue perceptible de manera visual (figura 3). Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 20 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Figura 3. Matraces con cultivos luminiscentes Nota: en esta figura se aprecia la luminiscencia de los cultivos de A. fischeri en medio líquido. 6.1.2. Segunda etapa La técnica de conservación que se utilizó durante los períodos de trabajo fue el subcultivo seriado (Acevedo y col., 2013), lo que implica que la bacteria fue resembrada cada mes en los medios de cultivo seleccionados líquido y sólido. Se sembró en placas Petri solidificando los medios líquidos empleados mediante agar al 2%. Se resembró el microorganismo en medio líquido después de un mes de ser mantenida en medio sólido para verificar su viabilidad (figura 4). Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 21 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Figura 4. Siembra de medio sólido a líquido para verificar viabilidad Nota: se muestra la toma de cultivo de A. fischeri para su siembra en medio líquido. Los cultivos de A. fischeri se conservaron en los medios de cultivo líquidos y fueron pasados de los matraces en agitación a viales de vidrio borosilicato de 3 mL, siendo conservados en refrigeración a 4°C posterior a las lecturas iniciales de 48 horas. De manera diaria, fueron agitados por medio de un equipo agitador vórtex marca Thermo Scientific® modelo M37615 (figura 5), para posteriormente medir la luminiscencia. Este procedimiento fue realizado durante 6 semanas. Los niveles de luminiscencia se promediaron por semana y fueron graficados comparando la luminiscencia generada en cada medio. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 22 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Figura 5. Agitación de viales para lectura de luminiscencia en luminómetro Nota: se muestra la colocación del vial en el equipo vórtex al momento de su agitación y posterior Lectura de luminiscencia. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 23 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 7. Resultados y discusión 7.1. Evaluación del crecimiento de la cepa de A. fischeri en tres medios de cultivo La cepa de A. fischeri reactivada con la solución base sales minarales (NMX-AA- 112-SCFI-2017) mostró una luminiscencia de 67 luxes. Esta solución cumplió el papel estabilizador de la membrana celular de la bacteria, permitiendo que reestableciera sus procesos metabólicos (McLeod y col., 1968). Serealizaron las mediciones de luminiscencia y densidad óptica (DO) en intervalos de 4 horas durante 48 horas. El medio Photobacterium alcanzó su máxima luminiscencia a las 24 horas (184 luxes), siendo visible desde las 12 horas (figura 6 a) que corresponden a la fase exponencial de la curva de crecimiento (figura 6 b), con un tiempo de generación de 32.5 horas. Este medio contiene CaCO3 y glicerol como fuentes de carbono y NaCl, cuya combinación favorece la luminiscencia bacteriana (Ramesh y col., 2014). En la figura 6 b, se muestra la curva de crecimiento celular construida con los datos de DO. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 24 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Figura 6. a) Luminiscencia presentada en medio Photobacterium; b) Densidad óptica en medio Photobacterium a 48 horas de incubación a) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Lu m in is ce n ci a ( lu xe s) Tiempo (horas) b) Nota: Esta figura muestra la evolución en las lecturas de luminiscencia y DO durante las 48 horas de incubación de A. fischeri en el medio Photobacterium. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 25 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= El medio Sea Water Complete alcanzó su máxima luminiscencia (14 luxes) a las 12 horas de incubación (figura 7a, durante la fase de exponencial (figura 7 b) con un tiempo de generación de 33.9 horas. Esto puede deberse a los ácidos excretados por las células en medios complejos sin regulador de pH, lo que altera el pH reduciéndolo a un nivel que ya no resulta óptimo para la emisión de luz y el crecimiento (Nealson, 1979). Figura 7. a) Luminiscencia en medio SWC; b) Densidad óptica en medio SWC a) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Lu m in is ce n ci a ( lu xe s) Tiempo (horas) b) y = -0.0013x2 + 0.0963x + 0.168 R² = 0.9776 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 D O ( a b so rb a n ci a ) Tiempo (horas) Nota: se muestra la evolución de luminiscencia y DO en A. fischeri en 48 horas de incubación en medio SWC Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 26 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= En cuanto al medio LB20, este tuvo una luminiscencia máxima de 172 luxes (figura 8 a), alcanzados a las 28 horas de incubación, correspondiente a la fase exponencial en la curva de crecimiento bacteriano (figura 8 b) con un tiempo de generación de 59 horas. Este medio cuenta con cantidades menores de elementos como el aminoácido arginina, que está contenido en la triptona de caseína y el extracto de levadura. Además, sólo cuenta con los aminoácidos presentes en estos sustratos, por lo que no hay fuentes de carbono adicionales. Esto puede generar ciertas condiciones de estrés a las bacterias, lo que puede detonar la necesidad de emitir luz. Figura 8. a) Luminiscencia en medio LB20; b) Densidad óptica en medio LB20 a) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Lu m in is ce n ci a ( lu xe s) Tiempo (horas) b) Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 27 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Nota: se muestra la evolución de la luminiscencia y DO de A. fischeri durante incubación de 48 horas en medio LB20. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 28 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 7.1.1. Comparación de medios Se realizó la comparación de las curvas de crcimientocelular de la bacteria crecida en los tres medios de cultivo, así como la luminiscencia para conocer la respuesta del microorganismo en cada medio. Figura 9. Comparativa de los niveles de luminiscencia alcanzados en los tres medios 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Lu m in is ce n ci a ( Lu xe s) Tiempo (horas) Photobacterium SWC LB20 Nota: se muestra la comparación de la luminscencia obtenida en los diferentes medios de cultivo durante 48 horas de incubación. Los medios de cultivo Photobacterium y LB20 mostraron resultados similares, alcanzando lecturas de 184 y 172 luxes respectivamente a las 24 y 28 h de incubación respectivamente, mientras que el medio Sea Water Complete solamente alcanzó una luminiscencia de 14 luxes (figura 9), siendo este el que produce la luminiscencia más baja. Es probable que el medio Sea Water Complete no haya alcanzado los niveles de luminiscencia deseados debido a la acción del CaCl2 o a la presencia de lisina en el extracto de carne, elementos que pueden tener un efecto inhibitorio en la luminiscencia (Hastings y col.,1977). También se reporta que la mezcla de MgSO4 Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 29 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= y KCl disminuye la luminiscencia (Tabei y col., 2012), elementos presentes en este medio. En cuanto a los medios Photobacterium y LB20, éstos cuentan con mayores cantidades de las sales minerales necesarias para el favorecimiento de la luminiscencia, además de la presencia de un regulador de pH (Tris, en el caso del medio Photobacterium), lo que coincide con lo reportado por Srivastava-MacLeod (1971), que mencionan la importancia nutricional de éstas para el crecimiento de las bacterias marinas bioluminiscentes y la inhibición del crecimiento de A. fischeri en un medio con sales, pero sin capacidad amortiguadora de pH. Por otro lado, el crecimiento bacteriano se muestra similar en los tres medios (figura 10), con un tiempo de generación promedio de 17 horas y 1.6 generaciones. Los tres medios de cultivo cuentan con fuentes de carbono y condiciones que permitieron el crecimiento bacteriano. Figura 10. Comparación de densidad óptica observada en los tres medios de cultivo 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 D O ( a b so rb a n ci a ) Tiempo (horas) Photobacterium SWC LB20 Nota: se compara la DO observada en los tres medios de cultivo durante 48 horas de incubación. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 30 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Se comparó también la luminiscencia con respecto al crecimiento bacteriano (Fig. 11, 12 y 13) para conocer si había relación entre ambas, no encontrándose correlaciones fuertes en ninguno de los casos de acuerdo con los datos de r2, que es el coeficiente de determinación que indica la correlación entre variables. Esto coincide con Hongda (2008), que reportó que las condiciones óptimas de crecimiento son diferentes a las de la bioluminiscencia. Aunado a esto, es posible que las bacterias inertes que permanecen en el medio, interfieran con la densidad óptica detectada, por lo que la densidad del medio podría deberse a bacterias inertes que no emiten luminiscencia. Figura 11. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio Photobacterium R² = 0.5976 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Lu m in is ce n ci a ( lu xe s) DO (Absorbancia) Nota: Se muestra el nivel de correlación entre DO y luminiscencia presentada en el medio Photobacterium durante 48 horas de incubación Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 31 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Figura 12. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio SWC R² = 0.618 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 0.5 1 1.5 2 Lu m in is ce n ci a ( lu xe s) DO (Absorbancia) Nota: En esta figura se presenta la baja correlación existente entre la DO y la luminiscencia observadas durante 48 horas de incubación en el medio SWC. Figura 13. Correlación entre DO y luminiscencia en el medio LB20 R² = 0.5174 -200 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 0.5 1 1.5 2 Lu m in is c e n c ia ( lu x e s ) DO (absorbancia) Nota: En esta figura se muestra el nivel de correlación entre la DO y la luminiscencia en el medio LB20 durante 48 horas de incubación. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 32 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 7.2 Viabilidad de conservación de la bacteria Aliivibrio fischeri en medio sólido y líquido a corto plazo, mediante la medición de la bioluminiscencia producida y densidad óptica de los cultivos. Los cultivos líquidos de A. fischeri que se sembraron en los tres medios en su fase sólida presentaron crecimiento a las 12 horas después de la siembra (figura 14); no presentaron luminiscencia. Esto puede deberse a la disponibilidad de los compuestos, que, al pasar de medio líquido a sólido, disminuye. Figura 14. Crecimiento en placa de A. fischeri Nota: en esta figura se presenta el crecimiento de A. fischeri en placa en el medio SWC. Bajo estas condiciones de cultivo, Después de la resiembra de placa a medio líquido, sólo el cultivo del medio LB20 presentó luminiscencia (figura 15), lo que puede deberse a que, en un medio con menor cantidad de componentes como es el caso del LB20, éstos están definidos y los inhibidores presentes en el medio complejo están ausentes (Hastigs-Nealson,1977). Otra posibilidad es que, al haber estrés por la escasez de nutrientes en un medio simple, las bacterias hagan uso Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 33 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= de la bioluminiscencia, que no les proporciona ninguna ventaja en condiciones sin estrés (Węgrzyn y col., 2002). Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 34 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Figura 15. Luminiscencia a un mes de conservación en medio sólido 0 50 100 150 200 250 300 0 4 8 12 16 20 24 Lu m in is ce n ci a ( lu xe s) Tiempo (horas) Photobacterium SWC LB20 Nota: En esta figura se muestra la luminiscencia observada en cada uno de los tres medios luego de un mes de conservación en medio sólido. Se monitoreó la luminiscencia cada cuatro horas durante 24 horas. En cuanto a los viales preservados en medio líquido en refrigeración a 4°C, presentaron elevados niveles de luminiscencia, con lecturas de hasta 250 luxes (figura 16), incluso superiores a la etapa de incubación en la fase exponencial de la curva de crecimiento, lo que puede indicar que A. fischeri ve favorecida la emisión de luminiscencia a temperaturas incluso muy inferiores a las reportadas por Silva y col. (2016), que cultivaron el microorganismo a 20°C, Scheerer y col. (2006), reportando incubación a 26°C; y Castillo (2018), que realizó cultivos a 27°C. En el manual de Bergey (Garrity y col., 2001) también se sugiere que la temperatura óptima para el cultivo de A. fischeri es de 35°C para observar luminiscencia. Además, se puede observar una fase estacionaria prolongada a esta temperatura en los medios líquidos. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 35 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Figura 16. Luminiscencia obtenida durante seis semanas de conservación en medio líquido Nota: Se muestra la luminiscencia observada en los tres medios de cultivo durante seis semanas de conservación en medio líquido. Como se puede apreciar en la figura 16, la luminiscencia detectada en el medio de cultivo SWC, comenzó a decrecer a la semana cuatro, mientras que en los medios LB20 y Photobacterium, se continuaron registrando niveles de luminiscencia por encima de 200 luxes. La capacidad previamente mencionada de los medios Photobacterium y LB20 de estimular la producción de luminiscencia en A. fischeri, puede tener influencia en estos resultados, manteniendo sus nutrientes disponibles para los microorganismos por un tiempo más prolongado. La luminiscencia expresada por A. fischeri en el medio LB20 empezó a decrecer en la semana 6, conservando lecturas de hasta 200 luxes. Mientras, en el medio Photobacterium continúa con lecturas superiores a los 250 luxes sin que se note una reducción después de seis semanas. Al tener una mayor cantidad de fuentes de carbono y de iones inorgánicos estimuladores de la luminiscencia bacteriana, Photobacterium resulta ser el medio en el que las bacterias conservan su luminiscencia y una densidad poblacional que permite la detección del quorum. Estos resultados confirman que A. fischeri expresa los niveles más altos de luminiscencia en los medios de cultivo Photobacterium y LB20 en comparación con el medio SWC. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 36 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Considerando que los medios de cultivo donde se obtuvo mejor luminiscencia fueron los medios Photobacterium (152 luxes) y LB0 (174 luxes) durante la fase exponencial de la curva de crecimiento celular y durante la conservación en medio líquido (250 luxes durante seis y cuatro semanas respectivamente), es pertinente hacer una comparación de la complejidad de preparación. Tabla 3. Componentes de los medios Photobacterium y LB20 Componentes Photobacterium LB20 Sal de acuario 33 g/L Tris 6 g/L Extracto de levadura 5 g/L 5 g/L Triptona 5 g/L 10 g/L NH4Cl 5 g/L Glicerol 6 g/L CaCO3 1 g/L NaCl 20 g/L Nota: En esta tabla se muestran los componentes de los medios Photobacterium y LB20 a fin de comparar la complejidad de su preparación. Tal como podemos observar en la tabla 3, la cantidad de elementos presentes en el medio Photobacterium es muy superior en comparación con la cantidad de elementos presentes en el medio LB20, por lo que este último resulta menos complejo en su preparación, lo que puede representar una ventaja económica y logística. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 37 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 8. Conclusiones De acuerdo a los objetivos planteados y los resultados obtenidos bajo las condiciones específicas del presente estudio, se concluye lo siguiente: 1. La bacteria A. fischeri expresó los niveles más altos de luminiscencia durante la fase exponencial del ciclo de crecimiento celular en los tres medios ensayados. 2. La expresión de la luminiscencia no es directamente proporcional a la concentración celular bacteriana. 3. A. fischeri puede ser cultivado de forma óptima en el medio líquido Photobacterium, a 25-27 ºC, en condiciones de agitación a 100 r.p.m., alcanzando una luminiscencia de hasta 184 luxes a las 24 h de incubación que corresponde a la fase exponencial de la curva de crecimiento celular. 4. A. fischeri puede ser mantenida viable durante seis semanas en los medios líquidos Photobacterium y LB20 a 4°C reactivando la luminiscencia mediante agitación para proporcionar el oxígeno necesario, alcanzando una luminiscencia de hasta 250 luxes. 5. A. fischeri expresa los niveles más altos de luminiscencia en los medios de cultivo Photobacterium y LB20, en comparación con el medio SWC. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 38 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= 9. Referencias bibliográficas Acevedo, R. L., Severiche, C. A. Castillo, M. E. (2013). Biología y Microbiología Ambiental. Prácticas de Laboratorio. EUMED.NED, España 2013, 94 p. Atlas, R. (2005). Media for Environmental Microbiology. Taylor & Francis Group. Estados Unidos de Norteamérica. Berovic, N., Parker, D.J. y Smith, M. D. (2009). An investigation of the reaction kinetics of luciferase and the effect of ionizing radiation on the reaction rate. Eur Biophys J. 38:427–435. Castillo, O. (2018). Establecimiento y modelado de un cultivo bacteriano bioluminiscente como fuente de iluminación alternativa. Tesis de maestría. Centro de InvestigaciónCientífica de Yucatán, A.C. Chong, G., Kimyon O., Manefield M. (2013) Quorum Sensing Signal Synthesis May Represent a Selective Advantage Independent of Its Role in Regulation of Bioluminescence in Vibrio fischeri. Centre for Marine BioInnovation. University of New South Wales (UNSW), Sydney, Australia. Desdín, G. L., (2015). Inventos de la Madre Natura. Ingeniería Animal. Científico- Técnica. La Habana, Cuba. García, A. M., Baeyens, R. G., Zhang, X., Alés, F. y Gámiz, L. (2001). Quimioluminiscencia: una interesante alternativa para la detección analítica en sistemas de flujo. Ars Pharmaceutica. 42:81-107 Garrity, G., M., Boone, D.R. y Castenholz, RW (eds., 2001). Manual de Bergey de bacteriología sistemática, 2ª ed., Vol. 1, Springer-Verlag, Nueva York, EUA Hastings, J. W., Nealson, K.H. (1977). Bacterial bioluminescense. Ann. Rev. Microbiol. 1977. 31:S49-9S. Hongda, F., Yanhong, D., Zhanzhou, X., Yin, Y., Xiuqin, L. y Bin, Y. (2008) Cultural and luminescent Conditions of a Marine luminous Bacterium. Bull Mar Sci, 10, 8. Isenberg, D. L. (1993) The Microtox® Toxicity Test - A Developer’s Commentary, in M. Richardson (ed.), Ecotoxicology Monitoring, VCH Publishers, New York, pp. 3-15. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 39 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Leboffe, M., Pierce, B. (2010). Microbiology Laboratory Theory & Application. 3rd ed. Morton Publishing. Colorado, USA. Madigan, T. M., Martinko, M.J., Bender, S.K., Buckley, H.D., Stahl, A.D. (Ed.) (2015). Brock. Biología de los Microorganismos. Pearson. 14ª. Ed. Madrid, España. Martín, A., Serrano, S., Santos, A., Marquina, D., Vázquez, C. (2010). Bioluminiscencia Bacteriana. Reduca (Biología). Serie Microbiología 3 (5): 75-86. Universidad complutense de Madrid. Madrid, España. McCann, J., Stabb, E., Millikan, D., Ruby, E. (2003). Population Dynamics of Vibrio fischeri during Infection of Euprymna scolopes. Applied and environmental microbiology. p. 5928–5934. McCarter, L. (2001). Polar Flagellar Motilityof the Vibrionaceae. Microbiol Mol Biol Rev 65:445–462. doi: 10.1128/MMBR.65.3.445- 462.2001 MacLeod, R.A., (1968). On the role of inorganic ions in the physiology of marine bacteria. In: Droop, M.R., Wood, E.J.F. (eds.), Advances in Microbiology of the Sea. Academic Press, Inc. (London), Ltd., London, pp. 95–126 Meighen, A. E. (1993). Bacterial bioluminescence: organization, regulation, and application of the lux genes. FASEB journal 7, no 11: 1016-1022. USA. Moreno, M. D., (2003). Toxicología Ambiental Evaluación de Riesgo para la Salud Humana. Ediciones Mc Graw Hill. México. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 40 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Nealson K. H., Platt T., Hastings J.W. (1970). Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescent system. J Bacteriol. 1970 Oct;104(1):313-22. Nealson, K. H., Hastings, J. (1979). «Bacterial Bioluminescence: Its Control and Ecological Significance.» Microbiological Reviews 43, nº 4 (1979): 496-518. Estados Unidos de Norteamérica Parvez, S., Venkataraman, C., Mukherji, S. (2006). A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals. Environment International 32 (2006) 265 – 26. India. Petrun, B., Lostroh, C. P. (2013) Vibrio fischeri exhibit the growth advantage in stationary-phase phenotype. Can J Microbiol, 59, 130. Ramesh, C., Mohanraju, R., Murthy, K., Karthick, P. y Narayana, S. (2014) Impact of light, temperature, salinity and glycerol on the intensity of luminescence and growth of marine bioluminescent bacteria Vibrio campbellii (strain STF1). Curr Sci, 106, 511. Sáenz, M. C., Nevárez, M. G. (2010). La bioluminiscencia de microorganismos marinos y su potencial biotecnológico. Revista Científica de la Universidad Autónoma de Coahuila Vol 2 no 3. Secretaría de Economía (SE). (2010). Norma Mexicana NMX-AA-087-SCFI-2010, Análisis de Agua - Evaluación de toxicidad aguda con Daphnia magna, Straus (Crustacea -Cladocera) - Método de Prueba. México, Distrito Federal. Secretaría de Economía (SE). (1995). Norma Mexicana NMX-AA-110-SCFI-1995, Análisis de Agua - Evaluacion de toxicidad aguda con Artemia franciscana Kellogg (Crustacea – anostraca). Método de Prueba. México, Distrito Federal. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 41 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Secretaría de Economía (SE). (2017). Norma Mexicana NMX-AA-112-SCFI-2017, Análisis de Agua y Sedimentos - Evaluación de Toxicidad Aguda con Vibrio fischeri - Método de Prueba. México, Distrito Federal. Scheerer, S., Gómez, F., Lloyd D., (2006). Bioluminescence of Vibrio fischeri in continuous culture: Optimal conditions for stability and intensity of photoemission. Journal of Microbiological Methods 67 (2006) 321–329. Reino Unido. Silva, R.D., Da Silva, L.A., Müller, W. S., (2016). Vibrio fischeri: Uma abordagem prática através da Biotecnologia. Revista Maiêutica, Indaial, v. 4, n. 1, p. 15-20, 2016. Brasil. Soto, W., Gutierrez, J., Remmenga, M.D. y Nishiguchi, M.K. (2009) Salinity and Temperature Effects on Physiological Responses of Vibrio fischeri from Diverse Ecological Niches. Microb Ecol, 57, 140. Srivastava, V. S., MacLeod, R. A. (1971) Nutritional requirements of some marine luminous bacteria. Can J Microbiol, 17, 703. Tabei, Y., Era, M., Ogawa, A., Morita, H. (2011) Effects of Magnesium Sulfate on the Luminescence of Vibrio fischeri under Nutrient-Starved Conditions. Biosci Biotechnol Biochem, 75, 1073. Tabei, Y., Era, M., Ogawa, A., Morita, H. (2012) Interactions between bicarbonate, potassium, and magnesium, and sulfur-dependent induction of luminescence in Vibrio fischeri. Journal of Basic Microbiology, 52, 350-9. Węgrzyn, G., Czyz, A. (2002). How do marine bacteria produce light, why are they luminescent, and can we employ bacterial bioluminescence in aquatic biotechnology? OCEANOLOGIA, 44 (3), pp. 291–305. Cultivo y conservación de Aliivibrio fischeri 42 <Sólo el cambio es eterno, perpetuo, inmortal…= Wood, K.V. (1998). The Chemistry of Bioluminescent Reporter Assays. Promega Notes. 65: 14-20.
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