Práctica 02 Factores que modifican la actividad enzimática (2)

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Primera Unidad
Fundamentos Bioquímicos, Enzimología y Biología Molecular de las membranas biológicas
PRACTICA N° 02
 - FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA --
INTRODUCCION:
Las enzimas son catalizadores complejos de origen biológico que tienen un alto grado de especificidad y eficiencia; permitiendo que las reacciones químicas intracelulares ocurran rápidamente a través de vías bien definidas. Sin estas proteínas especializadas, la vida tal como es no podría existir.
Debido que se necesitan muy bajas concentraciones de enzima para catalizar una reacción dada, solo muy pocas enzimas pueden medirse directamente. En general, la actividad de cualquier sistema enzimático puede ser demostrada de dos maneras: Verificando el sustrato no transformado y verificando los productos liberados después de un tiempo determinado de incubación en condiciones específicas de pH y temperatura.
Por tanto, tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos clara de la influencia de los factores (Tiempo, temperatura, concentración de enzima, concentración de sustrato, pH, iones, etc), sobre la serie infinita de enzimas que se conoce. Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes, de tal manera que la investigación del factor variable no se vea afectada por la variación que pudieran sufrir los otros.
COMPETENCIA:
Demuestra el efecto de iones activadores, concentración de sustrato, pH, concentración de enzima, tiempo y temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática, determinando o midiendo con responsabilidad la actividad de la amilasa salival mediante los métodos del sustrato residual y de los productos formados en dicha reacción.
PROCEDIMIENTO:
1) SISTEMA A. Exposición de la enzima a los factores que modifican su actividad: Preparar el siguiente sistema:
	COMPONENTES (en ml)
	TUBOS DE ENSAYO
	
	I
	II
	III
	IV
	V
	VI
	VII
	VIII
	Solución de almidón al 1 %
	1.0
	1.0
	2.0
	1.0
	1.0
	1.0
	1.0
	1.0
	Buffer acetato 0.1M pH 4.6
	-
	-
	-
	5.0
	-
	-
	-
	-
	Buffer fosfato 0.1M pH 6.6
	5.0
	5.0
	5.0
	-
	5.0
	-
	5.0
	5.0
	Buffer borato 0.1M pH 9.0
	-
	-
	-
	-
	-
	5.0
	-
	-
	Solución de NaCl al 2 %
	1.4
	-
	1.4
	1.4
	1.4
	1.4
	1.4
	1.4
	Agua destilada
	2.6
	3.4
	1.0
	2.0
	2.0
	2.0
	2.4
	2.0
	Mezclar y colocar los tubos del I al VII a incubación por cinco minutos a 37 °C.
	El tubo VIII, mantenerlo en agua helada entre 0° y 4° por cinco minutos.
	Agregar: Amilasa Salival al 0.25%
	-
	0.6
	0.6
	0.6
	0.6
	0.6
	0.2
	0.6
	Mezclar por inversión y continuar la incubación por 20 minutos (computar el tiempo desde el momento en que el preparado enzimático fue agregado a cada tubo)
2) SISTEMA B. Control de la actividad enzimática por el método del sustrato residual; reacción o prueba del yodo:
· Cumplidos los 20 minutos de incubación, sacar los tubos y armar una serie paralela agregando:
	COMPONENTES (en ml)
	TUBOS DE ENSAYO
	
	I
	II
	III
	IV
	V
	VI
	VII
	VIII
	Incubado correspondiente de cada uno de los tubos del sistema (A).
	0.5
	0.5
	0.5
	0.5
	0.5
	0.5
	0.5
	0.5
	HCl 0.05N
	5.0
	5.0
	5.0
	5.0
	5.0
	5.0
	5.0
	5.0
	Solución yodada
	0.5
	0.5
	0.5
	0.5
	0.5
	0.5
	0.5
	0.5
· Observar los resultados de las reacciones en cada uno de los tubos. Valorar la actividad enzimática en base al color resultante: Azul negruzco (actividad Ausente), Azul intermedio (actividad Baja), Azul mínimo (actividad Intermedia) y Amarillo claro (actividad Abundante). Anotar, interpretar-discutir los resultados y obtener las conclusiones en grupo.
3) SISTEMA C. Control de la actividad enzimática por el método de los productos formados (maltosa, glucosa); prueba de los azúcares reductores:
· Esta determinación sólo se realizará en los tubos III y V del incubado preparado en el paso 1.
	COMPONENTES (en ml)
	TUBOS
	
	III
	V
	Incubado correspondientemente de los tubos III y V del sistema (A).
	1.0
	1.0
	Solución cúprico alcalina
	1.0
	1.0
	Mezclar por inversión y colocarlos en baño de agua hirviendo por 8 minutos.
	Sacar los tubos y enfriarlos con agua corriente.
· Observar los resultados de las reacciones en los tubos. Valorar la actividad enzimática en base al color resultante: Rojo ladrillo (actividad Abundante) y Rojo ladrillo ligero (actividad Baja). Anotar, interpretar-discutir los resultados y obtener las conclusiones en grupo y con ayuda del docente.
RESULTADOS:
SISTEMA B. Control de la actividad enzimática por el método del sustrato residual; reacción o prueba del yodo:
8
7
6
5
4
3
2
1
	EVIDENCIA / INDICADOR
	TUBOS DE ENSAYO
	
	I (C o T)
	II (Cl-)
	III [S]
	IV (pH)
	V (pH))
	VI (pH)
	VII [E]
	VIII (T°)
	Color final: Azul negruzco / Azul intermedio / Azul mínimo / Amarillo claro
	Azul negruzco
	Azul mínimo
	Amarillo claro
	Azul negruzco
	Amarillo claro
	Azul negruzco
	Azul intermedio
	Azul negruzco
	Presencia de almidón residual: Abundante / Intermedio / Bajo / Ausente
	Abundante
	Bajo
	Ausente
	Abundante
	Ausente
	Abundante
	Intermedio
	Abundante
	Actividad amilásica: Abundante / Intermedia / Baja / Ausente
	Ausente
	Intermedia
	Abundante
	Ausente
	Abundante
	Ausente
	Baja
	Ausente
SISTEMA C. Control de la actividad enzimática por el método de los productos formados (maltosa, glucosa); prueba de los azúcares reductores:
	EVIDENCIA / INDICADOR
	TUBOS DE ENSAYO
	
	III [> S]
	V [< S]
	Color final: Rojo ladrillo / Rojo ladrillo ligero
	Rojo ladrillo
	Rojo ladrillo ligero
	Presencia de productos formados: Abundante / Bajo
	Abundante
	Bajo
	Actividad amilásica: Abundante / Baja
	Abundante
	Baja
 5
3
DISCUSIÓN:
El estudiante discute o analiza los resultados. Para ello los interpreta comparándolos y verificándolos respecto al marco teórico (principios teórico-prácticos, teorías y leyes que existen para la temática de los resultados) que se encuentra principalmente en libros, y con respecto a los antecedentes (trabajos de investigación alusivos al tema) que se encuentran fundamentalmente en artículos publicados. El marco teórico y los antecedentes se encuentran en las referencias bibliográficas, las cuales deben ser citadas en la discusión.
CONCLUSIONES:
El estudiante, en base a lo realizado en la discusión, elabora conclusiones cortas y puntuales las cuales se enuncian según las competencias a alcanzar en la presente práctica.
Nota: Mínimo deben elaborarse 3 conclusiones por tema.
CUESTIONARIO:
1) Identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus principales características.
2) ¿Cómo se puede evidenciar la presencia del sustrato residual en la práctica realizada?
3) ¿Cómo se puede evidenciar los productos formados en la reacción enzimática observada?
4) Confeccione una lista de los factores físico-químicos que intervienen modificando la velocidad enzimática en cada uno de los tubos empleados en la práctica.
5) ¿Cuál fue el pH óptimo para que la enzima empleada en la práctica pudiera actuar?
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.
2) …
3) …
Nota: Mínimo deben revisar 3 referencias bibliográficas, las cuales deben estar citadas en la discusión.
	5