TP enzimas 2022

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TRABAJO PRÁCTICO 
ACTIVIDAD 2: Problemas sobre enzimología. 
(A) OBJETIVOS GENERALES: 
(A.1) Comprender el concepto de enzima, y conocer sus características generales, 
nomenclatura y clasificación. 
(A.2) Conocer los aspectos cinéticos básicos y los mecanismos que subyacen en su actividad. 
(A.3) Comprender la importancia de las enzimas como herramientas esenciales en el 
metabolismo celular y su utilización en métodos analíticos (como reactivos para la 
determinación de sustancias, diagnóstico y/o pronóstico, en Bioquímica Clínica). 
(B) OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 
(B.1) Aprender a reconocer dentro de la clasificación de enzimas los tipos correspondientes de 
acuerdo con la reacción que catalizan. 
(B.2) Utilizar conocimientos teóricos necesarios para la resolución de problemas relacionados 
con la cinética enzimática básica. 
(B.3) Diferenciar entre una enzima que cumple con la cinética micaeliana básica y otra 
alostérica. Comprender el significado y las ventajas de la regulación alostérica. 
(B.4) Comprender el mecanismo de acción de distintos tipos de inhibidores enzimáticos. 
(B.5) Resolver problemas vinculados a clínica Médica en los cuales se interpreten datos 
enzimológicos. 
(C) CONOCIMIENTOS PREVIOS NECESARIOS: 
(C.1) Para optimizar el desarrollo de la actividad los alumnos deberán conocer los temas 
detallados en las actividades anteriores (concepto de funciones químicas, pH, estructuras de 
aminoácidos y proteínas, desnaturalización, etc.) 
(C.2) Nociones de construcción de gráficos cartesianos, perfil de la hipérbola equilátera, 
ecuación de la recta y sistema de despeje en ecuaciones algebraicas sencillas. 
(C.3) Nociones de cinética química. 
(D) TEMARIO ANALÍTICO 
(D.1) Definición de enzima. Características químicas, estructurales, y funcionales. 
Clasificación internacional de las enzimas. 
(D.2) Cofactores enzimáticos: naturaleza química. Ejemplos. 
(D.3) Mecanismos de la catálisis enzimática. Energía libre de las reacciones catalizadas y no 
catalizadas. Energía de activación y estado de transición. 
(D.4) Nociones de cinética enzimática: ecuación de Michaelis-Menten. Velocidad máxima y 
Km. Conceptos y unidades. Transformaciones de la ecuación de M-M. (doble recíproca o 
Lineweaver-Burk, etc). Ventajas en términos comparativos. 
(D.5) Factores que modifican la actividad enzimática. Temperatura, pH, concentración de 
proteína, tiempo, etc. 
(D.6) Inhibidores de la actividad enzimática. Clasificación. Ejemplos. 
(D.7) Aspectos sobre regulación de la actividad enzimática: enzimas alostéricas, 
características estructurales y cinéticas. Cooperatividad. Importancia biológica. Regulación 
covalente. Zimógenos e isoenzimas. Conceptos y ejemplos. Importancia biológica. Regulación 
a largo plazo (cantidad de enzima). 
(D.8) Cuantificación de enzimas. Unidad de actividad enzimática. Número de recambio. 
Actividad específica. 
(D.9) Enzimas en el diagnóstico clínico. Enzimas como agentes terapéuticos, diagnósticos o 
pronósticos. Enzimas como reactivos de laboratorio. 
(E) FUENTES DE INFORMACIÓN: 
- Seminario introductorio sobre el tema específico. 
- Lehningher Principios de Bioquímica, 4ta o 5ta edición, Nelson Cox. 
- Bioquímica, Stryer (últimas ediciones). 
- Bioquímica de Harper, Murray y col. (últimas ediciones). 
- Bioquímica Médica. Montgomery, Dryer, Conway y Spector. Ed. Salvat. 
- Bioquímica, Libro de texto con Aplicaciones Clínicas, T Devlin, 5° edición, Ed. Reverté. 
(F) DESARROLLO DE LA ACTIVIDAD: 
PROBLEMAS DE RESOLUCIÓN PREVIA A LA CLASE 
1. Naturaleza de las enzimas. 
Describa la necesidad de su presencia en los sistemas biológicos. 
Analice las diferencias y ventajas con respecto a un catalizador inorgánico. 
Explique su mecanismo de acción en base a un gráfico de G vs coordenada de reacción. 
2. Explique la diferencia entre los modelos de cerradura y llave, y del ajuste inducido, para la 
unión de un sustrato con la enzima. 
3. Unidades de actividad enzimática. 
¿Cómo se define la actividad de una enzima? ¿En qué unidades se expresa? Defina: 
a) Unidad de actividad enzimática (UI), 
b) Actividad específica, 
4. Detalle el sistema de clasificación de las enzimas según la Unión Internacional de 
Bioquímica y Biología Molecular. 
5. Cinética enzimática. 
Escriba la ecuación de Michaelis-Menten (MM) y grafíquela. Indique el significado de todos 
sus términos. 
Para obtener los parámetros cinéticos de una enzima michaeliana, ¿cuál es la ventaja de 
representar la ecuación de MM utilizando el método de Lineweaver-Burk? 
Escriba la ecuación de la doble recíproca y realice un esquema del gráfico obtenido por el 
método de Lineweaver-Burk indicando sobre el mismo como obtiene los parámetros cinéticos 
KM y VMAX. 
6. Factores que modifican la actividad enzimática. 
a) ¿Cómo interfieren en la actividad de una enzima la temperatura, pH y la presencia de 
inhibidores? 
b) Defina la inhibición reversible e irreversible. De ejemplos. 
Para el caso de una inhibición competitiva realice un esquema que le permita explicar el 
mecanismo de acción del inhibidor y las curvas cinéticas de la enzima en presencia y ausencia 
del inhibidor. 
c) ¿Qué entiende como cofactor enzimático? ¿Qué importancia tienen los cofactores y las 
coenzimas durante el ciclo catalítico? Clasifíquelos en base a su naturaleza química. Cite 
ejemplos. 
7. Regulación enzimática. 
¿Qué características cinéticas y estructurales distinguen a las enzimas que tienen control 
alostérico homotrópico de las que obedecen a la ecuación de Michaelis-Menten? 
¿En qué difieren con las alostéricas heterotrópicas? 
¿Por qué es tan importante la regulación por alosterismo? 
¿De qué otras formas pueden regularse las enzimas? 
¿Son todas las formas de regulación reversibles? 
8. Enzimas en el diagnóstico clínico. 
¿Cuál es el origen de las enzimas no funcionales plasmáticas? 
¿Qué enzimas se utilizan en el diagnóstico de las patologías: IAM (infarto agudo de 
miocardio), ACV (accidente cerebrovascular), hepatitis, patologías musculares. 
PROBLEMAS DE RESOLUCIÓN ÁULICA 
 
1.Enzimología clínica. Isoenzimas. 
Un hombre de mediana edad ingresó al servicio de urgencias de un hospital luego de ser 
rescatado de un accidente. Se sospechó de un accidente cerebro vascular (ACV), o un 
infarto agudo de miocardio (IAM). Se le analizó una muestra de sangre para determinar 
la actividad de la enzima creatinfosfoquinasa (CPK). 
a) Escriba la reacción catalizada por la CPK. 
b) Defina isoenzimas. ¿Cuál es la utilidad clínica de conocer las isoenzimas? 
El resultado del laboratorio de la actividad de la enzima del paciente fue el siguiente: 470 
mU/ml. La actividad normal en suero (VN) es de hasta 190 mU/ml (hombres) o 166 mU/ml 
(mujeres) 
c) El aumento de la actividad CPK total por encima del valor de corte, ¿permite distinguir 
entre ACV o IAM? ¿Cómo podría diferenciar la lesión cerebral de la miocárdica? 
d) Teniendo en cuenta que la subunidad de tipo B posee una mayor carga negativa que la 
de tipo M, ¿cómo espera que sea el patrón electroforético suponiendo que la muestra analizada 
contiene las tres isoenzimas? 
e) ¿Por qué supone que el valor normal de CPK en suero es mayor en hombres que en mujeres? 
2. Cinética Enzimática. 
La presencia de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) en plasma también es indicativo 
de injuria celular. 
a) Escriba la reacción que cataliza y cuales son las isoenzimas mas abundantes? 
b) Esquematice como sería el perfil de aumento de LDH en plasma comparado con CPK 
en un paciente con IAM 
Por otro lado, en investigación la medida de la actividad de la LDH se utiliza para evaluar 
citotoxicidad o injuria celular de diferentes sustancias en cultivos celulares y/o extractos 
de tejidos. En este contexto, para hacer estudios de cinética enzimática debemos medir la 
desaparición del sustrato o la formación de un producto en el tiempo. En este caso se mide 
la formación de NADH aprovechandola capacidad que tiene este compuesto de absorber 
luz a 340 nm. El coeficiente de extinción molar del NADH es εNADH= 6220 M-1 x cm-1. 
Para realizar el experimento se colocó una cierta cantidad de lactato y NAD+ (sustratos de la 
enzima) a temperatura y pH óptimo de la enzima. Una vez agregada la enzima se colocó el tubo 
en el espectrofotómetro y cada 10 segundos se anotaron los valores de Absorbancia (DO) Los 
resultados obtenidos fueron: 
 
Como la cubeta que utilizamos presentaba un paso óptico de 1 cm (b= 1 cm), aplicando la ley 
de Lambert Beer pudimos calcular la concentración de NADH a cada tiempo: 
De la ley de Lambert Beer DO = ε.b.C, despejamos la concentración C= DO/ ε.b 
 
tiempo (seg) 0 10 20 30 40 50 60 70 
conc NADH 
(uM) 
0 14,46 28,93 41,80 51,44 59,48 64,30 67,52 
c) ¿Cuál es la velocidad de la enzima entre 0 y 10 seg.? y entre 60 y 70 seg.? 
d) Grafique la concentración de NADH en función del tiempo. ¿Hasta qué tiempo la velocidad 
es lineal? 
e) ¿Qué valor de velocidad utilizaría para realizar determinaciones cinéticas? ¿Por qué? 
f) Determine la actividad específica de la muestra si para realizar la medida se utilizaron 10 mg 
de un extracto de músculo. 
g) ¿Cuál es la función del NAD+ en esta reacción química? 
h) ¿Qué factores considera Ud. que afectarían la actividad de esta enzima? Grafique e interprete 
cómo cambia la actividad enzimática con respecto a la variación de esos factores. 
3. Cálculo de parámetros cinéticos. 
La enzima Glucosa oxidasa se utiliza en el laboratorio de análisis clínicos para cuantificar 
la concentración de glucosa en sangre. La enzima cataliza la siguiente reacción: 
D-glucosa + O2 + H2O --------> ácido D-glucónico + H2O2 
a) ¿Qué experimento se debe realizar para calcular los parámetros cinéticos de esta enzima? 
Supongamos que los resultados obtenidos fueron: 
 
El símbolo mM representa milimoles por litro; 1mM = 0,001 mol/L. 
b) ¿Qué tipo de cinética presenta la enzima? 
Para obtener los valores de KM y Vmax se graficaron esos resultados empleando el método de 
Lineweaver-Burk. 
c) ¿En qué consiste este método? ¿Cuál es la ventaja de representarlo así? 
 
d) A partir de los datos obtenidos de la gráfica anterior indique los valores de Km y Vmax 
para esta enzima. ¿Cuál es el significado de la KM? ¿Para qué se utiliza? 
4. Según la clasificación de enzimas, 
a) ¿Cómo clasificaría a la CPK, LDH y a la glucosa-oxidasa? 
i- Quinasa 
ii- Deshidrogenasa 
iii- Oxidasa 
iv- Transferasa 
v- Fosfatasa 
b) Qué clase de enzima cataliza cada una de las siguientes reacciones? 
glicerol-P + NAD+ → gliceraldehído-3-P + NADH 
glucosa + ATP → glucosa-6-P + ADP 
glucosa + O2 → ácido glucónico + H2O2 
alanina + alfa-cetoglutarato → piruvato + glutamato 
glucosa-6-P + H2O → glucosa + Pi 
5. Parálisis controlada. La succinilcolina es un relajante muscular de rápida acción y corto 
efecto que se emplea cuando se entuba la tráquea de un paciente. A los pocos segundos de 
administrarle succinilcolina, el paciente experimenta una parálisis muscular y se le sitúa un 
respirador para continuar con la exploración. La parálisis dura hasta que se hidroliza la 
succinilcolina por la colinesterasa del suero, generalmente unos minutos más tarde. 
a) Como medida de seguridad, la actividad de la colinesterasa del suero se determina antes de 
iniciar la exploración. Escriba la reacción catalizada por esta enzima y explique por qué 
conviene realizar esta determinación. 
b) ¿Qué le sucedería al paciente si la actividad de su colinesterasa del suero fuera solo 10U/L 
en lugar del nivel normal que es de alrededor de 80U/L? 
c) Algunos pacientes poseen una forma mutante de la colinesterasa del suero que muestra una 
KM de 10 mM en vez del valor normal de 1,4 mM. ¿Qué efecto producirá esta mutación en el 
paciente? 
6. Tipos de inhibición enzimática. La sacarosa (azúcar de mesa) se hidroliza a glucosa y 
fructosa en un experimento clásico de cinética. La reacción es catalizada por la enzima 
invertasa que es inhibida por urea 2M. Se determinó experimentalmente que tipo de inhibición 
ejerce la urea y se obtuvo el siguiente gráfico con los siguientes datos: 
 
a) ¿Cómo llevó a cabo el experimento para llegar a obtener estos datos? 
b) Sabiendo que b[0] es la ordenada al origen y b[1] la pendiente de la recta, escriba las 
fórmulas de cada una de las curvas. Calcule Km y Vmax para cada caso e Indique qué tipo de 
inhibición ejerce la urea sobre la invertasa. Justifique su respuesta 
7. La enzima D-aminoácido oxidasa tiene un índice de recambio muy alto porque los D-
aminoácidos pueden ser muy tóxicos. 
La KM de esta enzima es del orden de 2 mM para los aminoácidos aromáticos y del orden de 
15 a 20 mM para aminoácidos como serina, alanina, y los aminoácidos ácidos. ¿Cuáles de estos 
aminoácidos son los sustratos preferidos por la enzima? 
8. Regulación enzimática. 
a) La actividad de muchas de las enzimas que veremos en las sucesivas clases de metabolismo, 
presentan regulación alostérica. Indique qué particularidad estructural poseen estas enzimas y 
realice un gráfico esperable de actividad enzimática vs. [S] en presencia y en ausencia de un 
modulador alostérico positivo y negativo. 
b) ¿A qué tipo de regulación enzimática corresponden los esquemas I y II? ¿Es el mecanismo 
de regulación reversible en ambos casos? ¿Qué otros mecanismos pueden regular la actividad 
de una enzima? 
 
9. Un varón de 36 años de edad fue ingresado en una guardia hospitalaria a raíz de un episodio 
de náuseas, vómitos y malestar general. Las pruebas de función hepática resultaron anormales. 
El valor de la transaminasa glutámico-pirúvica (TGP) era de 1500UI/l (VN 6-21 UI/l) y el de 
la transaminasa glutámico-oxalacética (TGO) era de 400 UI/l (VN 7-20 UI/l). Se le diagnosticó 
hepatitis. 
a) ¿Qué localización celular tienen las transaminasas? 
b) En este caso, ¿cuál es el valor del índice de De Ritis y qué información brinda? 
c) ¿Qué otras enzimas aumentan su valor en plasma como consecuencia del daño hepático?