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Facultad de Ciencias Químicas–Orizaba Universidad Veracruzana Laboratorio de Análisis Instrumental ___________________________________________________________________________________________ Dr. José Angel Cobos–Murcia (2010) Práctica 3 Validación de métodos analíticos empleando hoja de cálculo Equipo No insertar; Castro–Zamudio, E.1, Domíngez–Orea J.R.1, Flores–Bello M.2, Suarez–Madero M.A.,3 y Zamora–Pérez J.R.,1. 1) QFB Gen S09, 2) IAQ Gen S09 y 3) QFB Gen S08 Resumen. . 1. Introducción. Una vez que el experimento ha sido diseñado y optimizado es necesario realizar su validación. Es decir, que dicho experimento puede ser realizado por cualquier experimentador o laboratorio, y que su resultado siempre será el correcto con un intervalo de error aceptable. Validación. Los métodos de validación analítica son una de las medidas universalmente reconocidas como parte del aseguramiento de la calidad en la química analítica. Son criterios que debe cumplir un método analítico para cumplir ciertas normas nacionales e internacionales que demuestran que un método es confiable. En la actualidad existen legislaciones regulatorias en la industrias, como la FDA y la USP, que presentan procedimientos analíticos para la caracterización de los métodos analíticos. Así mismo existen otros protocolos y guías redactadas por otras organizaciones como, las publicaciones IUPAC, las ISO, AOAC internacional, The international conference on harmonization (ICH), entre otras. Los criterios analíticos recomendados por estas organizaciones para la validación de métodos analíticos son, exactitud, presición, selectividad, límite de detección, límite de cuantificación, intervalo de linealidad y robustez. Finalmente, una vez que el experimento ha sido planteado y optimizado es posible realizar su validación. Esto implica que el experimento planteado presenta una certeza y reproducibilidad adecuada, siendo así un procedimiento confiable. Que podrá ser empleado en cualquier otra parte y podrá reproducir los resultados. Por ejemplo, considerando la determinación amperométrica de un neurotransmisor, en donde la respuesta obtenida es la corriente eléctrica durante la determinación. El método se calibra y se valida para un intervalo de 1 a 10 µM, por lo tanto se realiza una curva de calibración determinando el valor de la corriente eléctrica al cambiar el valor de la concentración, como se puede observar en la Tabla 1, para cada valor de concentración corresponde un valor de corriente. Tabla 1: Curva de calibración para un método amperométrico en el intervalo de concentración de 0 a 10 mM y sus correspondientes respuestas. Concentración del neurotrasmisor /mM Corriente / mA 0 0 1 75 2 150 3 220 4 295 5 365 6 435 7 510 8 580 9 656 10 725 Facultad de Ciencias Químicas–Orizaba Universidad Veracruzana Laboratorio de Análisis Instrumental ___________________________________________________________________________________________ Dr. José Angel Cobos–Murcia (2010) Intervalo de linealidad: Es el intervalo de concentraciones a las cuales el método presenta linealidad o se ajusta al modelo que lo describa. En este caso el intervalo es de 1 a 10µM. Para evaluar si el método es lineal y se ajusta al modelo es necesario realizar la regresión lineal. En la Figura 1 se muestra la gráfica de los puntos de la Tabla 4 y su correlación lineal. El valor de la pendiente y que se interpreta como la sensibilidad del método, presentando nuestro ejemplo una sensibilidad de 72mAmM‐1 y una intersección o punto cuando la concentración es cero de 2.9 mA. Además obtenemos el valor del coeficiente de correlación lineal que representa que tan bien ajustados están los datos experimentales al modelo lineal. Siendo en este ejemplo de 0.999, muy cercano a 1 lo que indica que se ajustan casi de manera perfecta al modelo. Figura 1: Curva de calibración y su regresión lineal de los datos experimentales. Exactitud: Es la capacidad del método para determinar un valor determinado en varias ocasiones dentro de un intervalo de error. Para obtenerlo se coloca en repetidas ocasiones una muestra con una concentración determinada dentro del intervalo de linealidad del método, evaluando las variaciones para conocer el error de la medición, analizando la desviación estándar y el coeficiente de variación. En el ejemplo, se evaluó el valor de 6 mM por triplicado, mostrando un coeficiente de variación de 1.66 % y un porcentaje de recobro de 98 % Precisión: Al someter el método a cambios de al menos tres concentraciones, en repetidas ocasiones y en orden aleatorio. El método debe reportar siempre el mismo valor de respuesta para cada uno. Determinando. En el ejemplo del método amperométrico, se evalúan los valores de 3, 6 y 9 mM, cada uno por triplicado, en orden aleatorio y los parámetros por analizar son la desviación estándar y el coeficiente de variación de 1.65 %. 2. Objetivo. Conocer las herramientas para diseñar experimentos, así como optimizarlos de acuerdo a la respuesta obtenida por el método analítico y validar el método. Empleando las herramientas computacionales del programa computacional Excel. 3. Metodología. Material. El material que se utilizará en esta práctica serán los mostrados en la Tabla 2, que corresponde a resultados experimentales hipotéticos. Se muestran los valores de absorbancia para cada valor de concentración en un intervalo de 0 a 20 % de concentración del analito. Tabla 2: Datos de concentración y su respuesta en unidades de absorbancia en el intervalo establecido. % concentración Unidades de absorbancia 0 0 Facultad de Ciencias Químicas–Orizaba Universidad Veracruzana Laboratorio de Análisis Instrumental ___________________________________________________________________________________________ Dr. José Angel Cobos–Murcia (2010) 2 0.15 4 0.33 6 0.45 8 0.65 10 0.75 12 0.88 14 1.13 16 1.32 18 1.34 20 1.61 Para la determinación de la exactitud y la precisión del método se evalúa una muestra que contiene 10.1 % y que obtiene como respuesta una lecturas en unidades de absorbancia de: 0.775, 0.769, 0.776 y 0.773. Equipo Se empleará el programa computacional Microsoft Excel para el análisis de los datos. Procedimiento. 1. Graficar los datos de la Tabla 2. Realizar la correlación lineal y determinar los valores de pendiente (m) e intersección (a). 2. Vaciar los datos de la Tabla 3 en una nueva hoja de cálculo de Excel. 3. Para conocer si el método analítico es preciso y exacto se deben determinar los valores estadísticos de promedio, desviación estándar, porcentaje de recobro y coeficiente de variación. 4. Insertar los valores de la intersección (a) y la pendiente (m) calculados en la regresión lineal de la Figura y colocarlos en las celdas B1 y B2 5. Agregar el valor de la concentración a la cual se realizó la determinación en la celda B4. Mencionado en las sección de materiales. 6. Agregar los resultados de la determinación hechas por cuadruplicado y mencionado en las sección de materiales en las celdas B7 a B10 (B7:B10). 7. Para calcular el valor de concentración a través de los valores de la absorbancia de luz. Por lo que, necesario despejar la ecuación del modelo lineal (E1 E2), calculado para cada una de las mediciones realizadas B7:B10. 8. Para calcular el valor promedio de la concentración se escribe la fórmula =PROMEDIO(E7:E10) que nos ayudará a conocer que tan cercana se encuentra el valor calculado con el valor real agregada. 9. Para calcular la desviación estándar se escribe la fórmula =DESVEST(E7:E10) que nos indicará cuanta es la desviación de la medición determinada usando el método. Tabla 3: hoja de cálculopara determinar la exactitud y la precisión de un método analítico. A B C D E 1 Pendiente (m) insertar valor Ecuación lineal Abs=a+(m*concentración) 2 Intersección (a) insertar valor Despeje concentración=(abs–a)/m 4 Concentración agregada /% insertar valor Concentración recobrada /% 6 Mediciones Concentración /% 7 medición 1 insertar valor =(B6–$B$3)/$B$2 8 medición 2 insertar valor =(B7–$B$3)/$B$2 9 medición 3 insertar valor =(B8–$B$3)/$B$2 10 medición 4 insertar valor =(B9–$B$3)/$B$2 11 12 Promedio =promedio(E7:E10) 13 desviación =DESVEST(E7:E10) 14 Recobro /% =(E12*100)/E4 15 CV =(E13/E12)*100 Facultad de Ciencias Químicas–Orizaba Universidad Veracruzana Laboratorio de Análisis Instrumental ___________________________________________________________________________________________ Dr. José Angel Cobos–Murcia (2010) 10. Para conocer si el método es preciso, el porcentaje de recobro nos indica que tan cerca se encuentra la señal detectada de la cantidad real agregada. Para ello se requiere del valor del valor real agregado en la determinación. El cálculo se realiza multiplicando el promedio por cien y dividiendo entre el valor real, escribiendo en la celda E14 la fórmula =(E12*100)/E4. 11. La exactitud nos indica si el método repite un valor lo más cercano al valor cercano, por lo que para conocer éste parámetro se determina con el coeficiente de variación (CV). Para ello dividiendo la desviación estándar entre el promedio y multiplicado por 100, para este caso se ingresa en la celda E15 la fórmula, =(E13/E12)*100.
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