Practica 3 - Identificación bioquímica de Bacterias - José Alejandro Del Campo Vázquez

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA (BT1007) 
 
PRACTICA 3. IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE BACTERIAS 
 
OBJETIVO: 
Caracterizar bioquímicamente los cultivos axénicos obtenidos de la práctica anterior 
y contribuir en su identificación para clasificarlo de manera general. 
 
INTRODUCCIÓN: 
La identificación bioquímica se refiere a la determinación del comportamiento 
bioquímico (producción de enzimas) en presencia de sustratos específicos para caracterizar 
al microorganismo. 
 
 Existen diferentes sistemas de clasificación de bacterias, pero el más comúnmente 
utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 
 
 La identificación de una bacteria es su asignación a un taxón según una clasificación 
dada. Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas y la 
comparación de estas características con los diferentes taxones de la clasificación 
considerada. Las características a determinar y su número depende principalmente del tipo 
de bacteria y del fin que se persigue en la identificación. 
 
 A continuación, se propone un esquema de trabajo para la identificación de una cepa 
bacteriana desde el punto de vista bioquímico (Biotipo): 
1. Obtener un cultivo puro 
2. Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se 
determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es 
importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras 
características morfológicas de interés. 
3. Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los 
métodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoautótrofos, 
fotoheterótrofos, quimioautótrofos, quimioheterótrofos. 
4. Realización de pruebas primarias: En la siguiente tabla, modificada del Cowan & 
Steel's Manual of Identification of medical bacteria, se utilizan un grupo de pruebas, 
denominadas pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género, 
grupo de géneros o en algún caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las 
pruebas primarias son: Gram, morfología, catalasa, oxidasa, OF, fermentación de 
glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y movilidad. 
5. Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas 
dependerán del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos, 
producción de indol a partir de triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina 
deaminasa, etc.) 
 
Serotipo 
 A los efectos de realizar identificaciones más rápidas, o cuando las pruebas 
bioquímicas no son concluyentes, se recurre al uso de antisueros específicos. Los antígenos 
bacterianos pueden ser capsulares, somáticos (O) que corresponden al lipopolisacárido de 
la pared de los Gram negativos, flagelares (H), y los antisueros se identifican con esas letras 
y el número o letra del antígeno correspondiente. En una primera identificación se usan 
sueros polivalentes y para la caracterización serológica se usan sueros monovalentes dentro 
de cada tipo de antígeno. Existen en el comercio antisueros para caracterización de: 
Salmonella, Shigella, E.coli, Haemophilus, etc. 
 
 También se pueden utilizar métodos de cromatografía gaseosa para identificar 
productos metabólicos, en particular para la identificación de bacterias anaerobias no 
esporuladas como: Bacteroides, Fusobacterium, etc. 
Se puede expresar el nombre de una cepa de la siguiente manera: 
Yersinia entercolítica 4 03, indicando: género, especie, biotipo, serotipo. 
 
 
ENSAYOS BIOQUIMICOS 
 La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando 
diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de 
similitudes. 
 Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas 
bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica 
(conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de 
cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. 
 Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque 
proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo 
bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor 
numérico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente 
automatizables. 
 Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado 
para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia 
o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía 
metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de 
inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo 
bacteriano. 
 Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio 
de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente aún para el mismo ensayo si 
se trata de diferentes microorganismos. Por ejemplo: se debe suplir con factores de 
crecimiento el medio de cultivo para estudiar la fermentación de distintos azúcares cuando 
se sabe que el microorganismo en estudio es exigente. 
 
En resumen, la realización de una prueba bioquímica implica: 
1. Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato o 
inhibidor y luego de la incubación visualizar el crecimiento y la degradación de un 
sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador 
de la presencia del sustrato, o de algún producto de su degradación. 
2. Cultivar el microorganismo en un medio de propagación que contenga el sustrato 
de una enzima inducible y luego de la incubación demostrar la actividad enzimática. 
 
 En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubación) en un 
medio en que el microorganismo se desarrolla en forma óptima, a pH, fuerza iónica, 
atmósfera y temperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de 
cultivo para una prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, 
sembrando en dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese test. 
 
 Si bien existen una gran variedad de pruebas bioquímicas empleadas con fines de 
identificación, se enumerarán a continuación solo las que se utilizan más frecuentemente, 
agrupadas según el tipo de ensayo y se denominan según su nombre corriente. 
 
 
Las pruebas bioquímicas primarias son usadas para determinar el género de la mayoría de 
las bacterias. 
1. Tinción de GRAM. 
2. Prueba de catalasa. 
3. Prueba de oxidasa. 
4. Prueba de oxidación/fermentación conocida como OF. 
5. Motilidad. 
 
Nota: Para identificar el género de las Enterobacterias se usan otras pruebas bioquímicas 
llamadas IMVIC que se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer 
y Citrato. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TABLA MODIFICADA DE COWAN´S & STEEL PARA IDENTIFICACION DE BACTERIAS 
HETERÓTROFAS 
 
tinción gram 
(cultivo fresco) 
+ + + + + + + + – – – – – 
Forma coco coco coco coco 
bastó
n 
bastó
n 
bastó
n 
bastó
n 
bastó
n 
bastó
n 
bastó
n 
bastó
n 
coco 
agrupación 
racimo
s 
racimo
s 
cadena
s 
tetrada
s 
 pare
s 
crecimiento 
aerobio 
+ + + + + – + + + + + + + 
crecimiento 
anaerobio 
– + + + + + + – – – + + – 
Esporas – – – – – + + + – – – – – 
movilidad – – – – – + o – + o – + o – + o – + o – + o - + – 
catalase + + – – – – + + + + + + + 
oxidase + + – + + 
fermentación 
de 
glucosa a acido 
o a acido+gas 
– + + + + +(o-) + – – – + + – 
O/F – O F F O 
Micrococcus X 
Staphylococcus X 
Streptococcus X 
Lactococcus X 
Enterococcus X 
Leuconostoc X 
PediococcusX X 
Aerococcus X 
Lactobacillus X 
Clostridium X 
Bacillus X X 
Alcaligenes X 
Pseudomonas X 
Enterobacterias X 
Aeromonas X 
Chromobacteriu
m 
 X 
Neisseria X 
 
 
 
 
 
 
METODOLOGÍA: 
 
Prueba de la oxidasa (Citocromo C oxidasa). 
1. Coloca en un portaobjetos un disco de papel filtro. 
2. Añade 3 gotas de solución acuosa de Reactivo de Kovacs. 
3. Con un palillo grueso de madera o un asa de plástico, se toma una muestra bacteriana 
a partir de una colonia aislada proveniente de un cultivo de 24h. 
4. La muestra se pone en contacto con la tira o disco impregnado. 
5. Se debe observar una coloración morada en un lapso no mayor a 30segundos para 
que sea positivo, de lo contrario el resultado es negativo. 
 
El color azul-morado en el disco se interpreta como oxidasa positiva. 
 
La carencia de color en el disco se interpreta como oxidasa negativa. 
 
Factores a considerar en la prueba de oxidasa. 
 No considerar un resultado positivo después de 30seg ya que el oxigeno molecular 
del ambiente oxida al reactivo. 
 No usar asa bacteriológica metálica ya que la mayoría de estas con tienen hierro y 
este es capaz de oxidar el reactivo dando falsos positivos. 
 
Prueba de la catalasa. 
1. Sobre un portaobjetos limpio añade 1 gota de peróxido de hidrogeno al 3%. 
2. Esteriliza un asa de siembra y con la misma toma una porción de la colonia a estudiar 
(de la misma placa que en el caso de la oxidasa y de la misma colonia). 
3. Sobre la gota se emulsiona el cultivo a estudiar. 
4. En el caso de desprendimiento de burbujas se considera al microorganismo catalasa 
positivo, hay presencia de la enzima catalasa, hay bacterias que dan una reacción 
positiva débil, aunque son las menos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
http://microbitos.files.wordpress.com/2011/09/disco-oxidasa-positivo.jpg
http://microbitos.files.wordpress.com/2011/09/disco-oxidasa-negativo.jpg
http://microbitos.files.wordpress.com/2011/09/catalaseresults1.jpg
Prueba de oxidación y fermentación también conocida como OF. 
1. Se requieren dos tubos del medio OF. Utilizando un asa recta la cual se flamea en el 
mechero, se puede enfriar en agar estéril, tomar un poco de bacteria a partir de una 
colonia aislada. 
2. Inocular ambos tubos por el método de picadura. 
 
3. Preparar las condiciones de los tubos: 
a. Un tubo se cerrará su tapa de tal forma que quede floja con la intención de 
que entre algo de oxígeno. 
b. Al segundo tubo se le agregará 1.5-2ml de aceite mineral estéril y la tapa se 
cerrará completamente. 
4. Incubar durante 24h. 
 
Las bacterias ocupan diferentes vías metabólicas para obtener sus nutrientes y la energía, 
casi todas las bacterias consumen algún tipo de carbohidrato generalmente el mas utilizado 
por las bacterias es la glucosa, usan la vía oxidativa, fermentativa o ambas. La vía oxidativa 
utiliza oxígeno, un sinónimo es vía aerobia. El metabolismo fermentativo no utiliza oxigeno, 
sinónimo metabolismo anaerobio. 
 
Interpretación y lectura de la prueba bioquímica de OF. 
 
Ambos tubos verdes se interpretan como: negativo o no sacarolítico debido a que no 
consume glucosa. 
http://microbitos.files.wordpress.com/2011/09/inoculacion-picadura.jpg
http://microbitos.files.wordpress.com/2011/09/imagen044.jpg
 
Interpretación de tubos amarillo, amarillo: Fermentador facultativo y se reporta como: F 
 
 
 
Cuando el tubo abierto es amarillo y el tubo con aceite es verde se interpreta como 
reacción oxidativa y se reporta como: O 
 
 
Prueba de motilidad. 
1. Se requiere un tubo con el medio SIM. Utilizando un asa recta la cual se flamea en el 
mechero, se puede enfriar en agar estéril, tomar un poco de bacteria a partir de una 
colonia aislada. 
2. Inocular el tubo por el método de picadura. 
3. Incubar 2 días a 35°C. 
4. Lectura: los microorganismos móviles crecen en todo el medio. El microorganismo 
no móvil sólo donde se ha inoculado como una línea recta. 
 
NOTA IMPORTANTE: este método es de confianza variable ya que la picadura se pudo haber 
hecho chueca o irregular lo que nos darían falso positivo. 
 
 
 
 
http://microbitos.files.wordpress.com/2011/09/imagen052.jpg
http://microbitos.files.wordpress.com/2011/09/prueba-of-oxidativa.jpg
Producción de INDOL 
1. Se requieren un tubo con agua peptonada (10%) y pH 7. Utilizando un asa recta la 
cual se flamea en el mechero, se puede enfriar en agar estéril, tomar un poco de 
bacteria a partir de una colonia aislada. 
2. Inocular el tubo. 
3. Incubar 2 días a 35°C. 
4. Adicionar unas gotas del reactivo de Kovacs. 
5. Lectura: color rojo intenso en la capa alcohólica se considera positivo. Si la capa 
alcohólica (SUPERIOR) es amarilla el resultado es negativo. 
 
Para identificar el género de las Enterobacterias se usan otras pruebas bioquimicas 
llamadas IMVIC que se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskauer 
y Citrato. 
 
 
CUESTIONARIO 
1. Define enzima. 
2. Las pruebas bioquímicas para el análisis de bacterias se pueden clasificar en función 
al sustrato sobre el cuál actúan los microorganismos, ¿cuál sería esa clasificación? 
3. Investiga el fundamento, reacciones químicas y enzimas para cada una de las pruebas 
bioquímicas realizadas en el laboratorio. 
4. Para la realización de un ensayo bioquímico, se considera imprescindible que sea un 
cultivo realizado a partir de una colonia aislada (y por tanto con una elevada 
probabilidad de que todos los microorganismos que la componen sean idénticos) y 
reciente (no superior a 24 horas), por: 
a. Minimizar los cambios en el fenotipo, que puedan manifestarse en el 
genotipo. 
b. Minimizar los cambios en el genotipo, que puedan manifestarse en el 
fenotipo. 
c. Simple cuestión de prontitud y economía en el análisis.