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ELEARNING TOTAL Curso de Control microbiológico del agua– Unidad 3 
1 
Medios de cultivo 
Es aquel sustrato que contiene todas las condiciones necesarias para el correcto 
desarrollo de determinado microorganismo, en condiciones de laboratorio. 
Requerimientos para el crecimiento microbiano 
 Físicos: 
 Temperatura: la mayoría de los microorganismos crece dentro de un margen 
limitado de temperaturas. Cada especie tiene una temperatura óptima con 
temperaturas mínimas y máximas de tolerancia. Según estos rangos se dividen en 
tres grandes grupos: 
 Psicrófilos: crecimiento optimo entre 5°C y 30°C 
 Mesófilos: crecimiento optimo entre 25°C y 40°C 
 Termófilos: crecimiento optimo entre 50°C y 60°C 
 Ph: la mayoría de las bacterias crece mejor en un rango de pH entre 6,5 y 7,5. Los 
hongos tienen un rango de tolerancia mayor que las bacterias. 
 Osmolaridad: el medio en el que crecen debe poseer una osmolaridad igual a la 
del citoplasma. 
 Hidratación: es fundamental para el crecimiento bacteriano. Casi todos los 
nutrientes que estos utilizan están disueltos en un medio acuoso. 
 Ambiente gaseoso: en este aspecto los requerimientos varían según el mecanismo 
respiratorio del microorganismo en cuestión. Estos pueden ser: 
 Aerobios: crecen en presencia de oxígeno. 
 Anaerobios: crecen en ausencia de oxígeno. Para estos microorganismos el 
oxígeno resulta tóxico. 
 Anaerobios facultativos: crecen en medios con oxígeno y sin él. 
 
 
 
 
 
 
 
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 Químicos: 
 Carbono: El carbono como el agua son indispensables para la supervivencia en los 
microorganismos. Es la base estructural de las células vivas para: la síntesis de 
azucares, la estructura de la pared celular, membrana, enzimas, etc. 
 N,S,P: importantes para la síntesis de proteínas, ácidos nucleicos, ATP, etc. 
 Metales: Ca, Mg, K, etc. Son necesarios como cofactores de enzimas 
 Oligoelementos: Fe, Cu, Zn son necesarios en trazas 
 Factores de crecimiento: Vitaminas, algunos aminoácidos, purinas y pirimidinas. 
Son compuestos orgánicos esenciales que el microorganismo no puede sintetizar. 
Clasificación de medios de cultivo 
Según su estado físico: 
 Líquidos: 99,8% de agua. Se los denomina comúnmente caldos. Ejemplo caldo 
TSB. 
 
 Solidos: se agrega agar-agar (2%) al caldo base. Este agar presenta la propiedad de 
fundir a 80°C y solidificar a 45°C. Se los denomina Agares 
 
 
 
 
 
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Según su composición 
 Simples: contienen los nutrientes necesarios para el desarrollo de 
microorganismos. 
 Enriquecidos: son medios líquidos o sólidos a los cuales se agregan proteínas 
nativas o nutrientes extra al medio base, como suero, sangre, yema de huevo, etc. 
 Selectivos: son medios líquidos o sólidos con el agregado de uno o más 
inhibidores. El agente selectivo facilita el aislamiento de un determinado 
microorganismo inhibiendo otros no deseados. 
 Diferenciales: permite diferenciar microorganismos con una determinada 
propiedad bioquímica o metabólica de otros que no la poseen. Presentan un 
sustrato utilizable (por ejemplo: un hidrato de carbono, aminoácidos azufrados) y 
un revelador (por ejemplo: un indicador de pH). El indicador de pH permite 
diferenciar lo microorganismos que fermentan un determinado hidrato de 
carbono. 
 
Medios de cultivos utilizados para el control microbiológico del agua 
Tripteina soja caldo 
Es un medio adecuado para el desarrollo de microorganismos exigentes. 
Fundamento 
La tripteina de soja y la peptona de soja aportan nutrientes ricos en péptidos, 
aminoácidos libres, bases púricas y pirimídicas, minerales y vitaminas. La peptona de 
soja contiene alta cantidad de hidratos de carbono que estimulan el crecimiento de 
una amplia variedad de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance 
osmótico. El fosfato dipotásico otorga capacidad buffer y la glucosa es la fuente de 
energía. 
 
 
 
 
 
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Interpretación de resultados 
La presencia de turbidez en el medio evidencia el crecimiento microbiano. 
 
Mac Conkey caldo 
Este es un medio de cultivo selectivo, y se utiliza para la investigación presuntiva de 
microorganismos coliformes. 
Fundamento 
La peptona es la fuente de aminoácidos y de otros factores de crecimiento, la lactosa 
es el hidrato de carbono fermentable, la bilis de buey estimula el crecimiento de las 
bacterias coliformes e inhibe una gran parte de la flora grampositiva, y el purpura de 
bromocresol es el indicador de pH. 
Los microorganismos coliformes fermentan la lactosa con gran producción de ácido y 
gas. Al acidificar el medio se produce un viraje de color a partir del indicador de pH. 
Interpretación de resultados 
Positivo: medio de cultivo de color amarillo con producción de gas. 
Negativo: ausencia de color amarillo Y/o ausencia de producción de gas. 
 
Recuento en placa agar (PCA) 
Este medio de cultivo se utiliza para el recuento de bacterias aerobias. 
Fundamento 
El alto contenido nutricional de este medio permite el crecimiento de las bacterias 
presentes en la muestra. 
 
 
 
 
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Características del medio 
Medio de cultivo color ámbar claro ligeramente opalescente. 
Interpretación de resultados 
Efectuar el recuento de las colonias. 
 
Levine E.M.B agar (con eosina y azul de metileno) 
Este medio es adecuado para la búsqueda y diferenciación de bacilos entéricos. 
Fundamento 
Es un medio selectivo diferencial, adecuado para el crecimiento de enterobacterias. 
En el medio de cultivo, la peptona es la fuente nutritiva y la lactosa es el hidrato de 
carbono fermentable. La combinación utilizada de eosina y azul de metileno, inhibe 
el desarrollo de microorganismos Gram positivos y de bacterias Gram negativas 
fastidiosas, y también, permite diferenciar bacterias fermentadoras y no 
fermentadoras de lactosa. 
Los microorganismos fermentadores de lactosa, originan colonias de color azulado-
negro, con brillo metálico o mucosas. Las colonias producidas por microorganismos 
no fermentadores de lactosa son incoloras. 
Enterococcus spp. Crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, 
En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella spp 
y Shigella spp. 
 
Interpretación de resultados 
 
Microorganismos fermentadores de lactosa: colonias de color negro azulado o 
amarronado. Pueden tener centro oscuro y brillo metálico. 
 
Microorganismos no fermentadores de lactosa: colonias del color del medio, 
incoloras. 
 
 
 
 
 
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Cetrimide agar 
Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y 
otras especies del género. 
Fundamento 
Su fórmula permite el crecimiento selectivo de Pseudomonas aeruginosa y estimula 
la formación de pigmentos. Este medio es muy semejante al King A, en el cual la 
peptona de gelatina aporta los nutrientes para el desarrollo bacteriano. El cloruro de 
magnesio y sulfato de potasio promueven la formación de piocianina, pioverdina, 
piomelanina y fluoresceína de P. aeruginosa. La cetrimida es un detergente catiónico 
que actúa como agente inhibidor de la flora acompañante. 
Interpretación de resultadosSe observa crecimiento microbiano, características de las colonias y la producción de 
pigmentos. 
La presencia de un color verde-azulado corresponde a la producción de piocianina, 
mientras que un color verde corresponde a la producción de pioverdina y un color 
rosa claro, rojizo o marrón oscuro corresponde de a la producción de piorrubina. 
Examinar la placa bajo la luz ultravioleta, ya que la producción de fluoresceína de 
observa un color amarillo verdoso brillante que difunde en el agar a partir del 
crecimiento microbiano. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Pseudomonas agar P (PP o King A) 
Este medio se utiliza para el aislamiento, la detección y diferenciación de especies de 
Pseudomonas en base a la producción de piocianina. Conocido también como medio 
King A. 
Fundamento 
La peptona de gelatina aporta nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la 
glicerina favorece la producción de pigmentos, las sales de magnesio y potasio 
estimulan la producción de piocianina y piorrubina e inhiben la producción de 
fluoresceína. 
Interpretación de resultados 
 Un resultado positivo es por observación de pigmentos piocianina y/o piorrubina. 
La producción de piocianina se observa una zona color azul, azul-verdoso que rodea 
la colonia, o que se extiende en todo el medio de cultivo debido a la difusión del 
pigmento. 
La producción de piorrubina se observa como una zona de color rojo alrededor de la 
colonia o que se extiende en todo el medio de cultivo debido a la difusión del 
pigmento. 
 
Pseudomona agar F (PF o King B) 
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, detección y diferenciación de especies 
de Pseudomonas en base a la producción de fluoresceína. Conocido también como 
medio King B. 
Fundamento 
En este medio la tripteina y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios 
para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la producción de pigentos, la 
 
 
 
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concentración de fosfato dipotásico estimula la producción de fluoresceína e inhibe 
la producción de piocianina y piorrubina. El sulfato de magnesio provee los cationes 
necesarios que incrementan la producción de fluoresceína. 
Interpretación de resultados 
Se deben examinar las colonias bajo luz UV. 
Se considera un resultado positiva la observación de fluoresceína, que es un 
pigmento color amarillo verdoso fluorescente que rodea la colonia o que se extiende 
por todo el medio de cultivo. 
 
Pruebas de indicadores de calidad - Petrifilm™ Plates 
Las placas Petrifilm ™ son placas listas para la toma de muestras que ahorran tiempo 
para la prueba de indicadores de calidad. Están diseñados exclusivamente para 
ofrecerle: 
 Productividad incrementada 
 Comprobación de la fiabilidad 
 Reducción de desperdicio 
Las placas Petrifilm ™ están disponibles para la mayoría de las necesidades de 
pruebas microbianas, incluyendo: 
 Aerobio 
 Coliforme 
 Enterobacteriaceae 
 E Coli 
 Listeria medio ambiental 
 Heterotrófico 
 Bacterias de ácido láctico 
 Staphylococcus aureus 
 Bacterias Acidolácticas 
 
 
 
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Placas Petrifilm™ 
Este tipo de medios viene comercialmente listo para usar, especialmente diseñados 
para aguas y alimentos. 
Son específicos para cada grupo de los distintos microorganismos patógenos. 
 
 
 
Inoculación de las placas 
Se inoculan con un mililitro de agua a investigar sobre la placa y se pega la lámina 
superior por sobre la muestra. Se coloca el difusor por encima para la correcta 
distribución de la muestra en la placa y se deja reposar un minuto. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Inoculación de placas Petrifilm 
 
 
Incubación 
Se incuban en estufa apiladas de no más de 20 placas. 
 
 
 
 
 
 
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Placas de Petri con pads 
Fabricadas en poliestireno cristal de alta calidad, con pad de celulosa de 47 mm de 
diámetro en su interior. Se utiliza empleando la técnica de filtración por membrana, y 
como soporte para medios de cultivo líquidos. 
 
 Placa de Petri con pad 
 
 
Placas de Petri con pads nutritivos 
Constan de almohadillas de medios deshidratados en placas de petri, pre 
esterilizado. Al igual que los anteriores, se utilizan para la técnica de filtración con 
membrana. 
Para la utilización de estas placas se hidrata el pad con 1 ml de agua destilada estéril 
y se coloca la membrana por encima del pad. Luego se incuba a temperatura y 
tiempo correspondiente. 
 
 
 
 
 
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Placas de Petri con pads 
 
Tipificación 
Para poder identificar los distintos microorganismos en muestras de agua 
necesitamos de la tipificación, esta podrá ser una tipificación fenotípica o genotípica. 
En la primera se ponen en evidencia las características fenotípicas a través de la 
observación de la presencia de distintas enzimas propias de cada especie. Para el 
caso de la segunda, se busca una secuencia específica de ADN. Teniendo en cuenta 
esta definición, sabemos que la segunda será mucho más específica que la primera. 
Tipificación bioquímica 
Pruebas bioquímicas para la tipificación 
Estas pruebas bioquímicas consisten en determinados medios que permiten 
determinar la actividad de una determinada ruta metabólica a partir de la 
incorporación de un sustrato que la bacteria pobra metabolizar o no, y un compuesto 
cromogénico que nos indica visualmente esta reacción. 
Para la utilización de estas pruebas disponemos de distintos medios, de los cuales se 
aplicarán de acuerdo a las necesidades y las exigencias del microorganismo en 
estudio. 
 
 
 
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Prueba de oxidasa: Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas 
oxidasas. La reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema 
citocromooxidasa que activa la oxidación del citocromo el cual es reducido por el 
oxígeno molecular produciéndose agua o peróxido de hidrógeno según la especie 
bacteriana. El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena 
transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa solo se 
encuentra en las bacterias aerobias, algunas anaerobias facultativas y, 
excepcionalmente, en alguna microaerófila (Vibrio fetus), pero las bacterias 
anaerobias estrictas carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa 
va ligada a la producción de catalasa, ya que ésta degrada el peróxido de hidrógeno 
que se produce como consecuencia de la reducción del oxígeno y cuya acumulación 
es toxica. 
 
Prueba de utilización de hidratos de carbono: esta prueba determina la capacidad de 
un microorganismo para fermentar un hidrato de carbono específico incorporado a 
un medio de cultivo específico, produciendo ácido ó ácido y gas. El indicador que se 
utiliza para este caso es el rojo de fenol, que a pH 7,4 su color es rojizo-rosado y a pH 
ácido vira al amarillo. Dentro de los hidratos de carbono más utilizados se encuentran 
los siguientes:glucosa, lactosa, sacarosa, arabinosa, maltosa, manosa, rafinosa, 
fructosa, xilosa, trehalosa, galactosa, ramnosa, melobiosa, almidon, manitol, sorbitol, 
inositol, adonitol, inulina, salicina y amigdalina. 
El medio de cultivo es el caldo base purpura de bromocresol. A este medio se le 
agrega asépticamente el azúcar de elección en una concentración del 1%. Se coloca 
en tubo con campana de Durham. 
Interpretación de resultados 
Producción de ácido: medio color amarillo. 
Sin producción de ácido: medio color purpura. 
Producción de gas: presencia de aire dentro de la campana de Durham. 
 
 
 
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Prueba de producción de indol: Mediante esta prueba se detecta la liberación de 
indol en un cultivo bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del 
aminoácido triptófano a través de la enzima triptofanasa. Esto se puede observar 
añadiendo al medio paradimetilaminobenzoaldehído sobre un medio rico en 
triptófano como puede ser agua de peptona o agua de triptona inmerso en una 
matriz sólida como puede ser el agar SIM (indol, motilidad y sulfato de hidrógeno), 
que nos dará una lectura de las tres pruebas simultaneas (este medio se mencionará 
más adelante). 
Se pueden utilizar dos tipos de reactivos; reactivo de Kovacs o reactivo de Ehrlich. 
Para la realización del inoculo se levantan una o dos colonias a estudiar y se inoculan 
con ansa puntiforme en el agar SIM. Se incuba a 37 ºC por 24-48hs. Liego de la 
incubación, se agregan unas gotas del reactivo. El anillo color fucsia rojizo determina 
la presencia de indol en el medio. Si el anillo no tuviera color se determina la 
ausencia de indol, por lo tanto la prueba es negativa. 
Prueba de citrato: Esta prueba sirve para determinar si un microorganismo es capaz 
de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como 
única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del 
medio. Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes 
géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de 
Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Yersinia, Salmonella typhi y 
Salmonella paratyphi son incapaces de crecer utilizando citrato como única fuente de 
carbono. 
Se inocula en estría y se incuba a 37 ºC por 24-48 hs, pasado ese tiempo para la 
interpretación de resultados observamos: 
Resultado positivo: crecimiento sobre el medio y viraje de color verde hacia el azul 
Resultado negativo: sin cambios. 
Prueba de urea: Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea 
formando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa. Esta actividad 
 
 
 
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enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para 
diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o positivo 
retardado. 
La visualización del proceso se fundamenta en que la alcalinización producida en el 
medio de cultivo se detecta mediante un indicador de pH, que para este caso es el 
rojo fenol. 
Se inocula el pico de flauta y se incuba a 37 ºC por 24-48 hs. Para la interpretación de 
resultados: 
Resultado positivo: coloración rosada en el medio. 
Resultado negativo: sin cambio. 
Prueba de descarboxilasa: La descarboxilación es un proceso en el cual las 
descarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminoácidos, formando la 
correspondiente amina. Los tres aminoácidos que se ensayan en la identificación de 
enterobacterias son arginina, lisina y ornitina. La descarboxilación de lisina y ornitina 
da cadaverina y putrescina (diaminas), mientras que la descarboxilación de arginina 
da citrulina por acción de una dehidrolasa. Esta prueba se debe realizar con un tubo 
control que contiene el medio base sin aminoácido. Como la descarboxilación es una 
reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril. 
El proceso se produce en dos etapas: por fermentación de la glucosa se produce una 
acidificación del medio (pH < 6,0), apareciendo color amarillo. La acidificación es 
necesaria para que ocurra la descarboxilación. Este último proceso da lugar a la 
formación de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador a 
color violeta. Esta prueba se utiliza tanto en la identificación de bacilos 
gramnegativos como de bacilos y cocos grampositivos. 
Prueba de lisina-hierro: en este medio la glucosa es el hidrato de carbono 
fermentable, y la lisina es el sustrato que se utiliza para la detección de las enzimas 
descarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio y el el tiosulfato de sodio, 
son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. 
 
 
 
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Como indicador de pH contiene el purpura de bromocresol, el cual se mantiene en 
color violeta en pH mayor o igual a 6.8 y vira hacia el amarillo en pH menor o igual a 
5.2. 
 
Sistemas comerciales multipruebas 
Existen en el mercado numerosos sistemas o equipos multipruebas con el fin de 
conseguir una mayor rapidez en la identificación de algunas bacterias. Todas exigen 
unas condiciones precisas en cuanto al inóculo, modo de inoculación, incubación y 
lectura que, de no seguirse, pueden dar lugar a errores. Estos sistemas pueden ser 
manuales o estar automatizados. 
 
Sistemas comerciales manuales o galerías multipruebas. Se trata de celdillas aisladas 
con un sustrato liofilizado que se inoculan individualmente y que permiten realizar 
simultáneamente entre 10 y 50 pruebas bioquímicas. Los resultados de las pruebas 
se expresan de forma numérica (los resultados de las pruebas se agrupan de tres en 
tres, de manera que el resultado de cada trío de pruebas queda reducido a un dígito). 
Cada especie está definida por un código numérico, resultado de la codificación de 
las reacciones a las pruebas que se hubieran utilizado. Para codificar el dígito de un 
trío de pruebas se establece el siguiente sistema: 
- Si una prueba es negativa se asigna un valor 0 (cero) a la prueba. 
- Si la primera prueba es positiva se asigna un valor de 1. 
- Si la segunda prueba es positiva se asigna un valor de 2. 
- Si la tercera prueba es positiva se asigna un valor de 4. 
El código numérico se obtiene sumando los valore de las tres pruebas. Los límites 
inferior y superior del código son 0 y 7 respectivamente. Ante un microorganismo 
problema, se busca el código numérico y se comprueba a qué bacteria pertenece. 
 
 
 
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Algunos de los sistemas comerciales disponibles en el mercado son: API (bioMérieux), 
Enterotube (BBL), Oxi/Ferm Tube (BD), RapID systems y MicroID (Remel), Biochemical 
ID systems (Microgen), etc. 
 
 
 Sistema API 
 
 
 
 
 
 Sistema Microgen 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Sistema Enterotube 
 
 
 
 
Método de uso sistema Enterotube 
 
 
 
 
 
 
 
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Sistemas comerciales automatizados 
Hay en el mercado galerías multipruebas, como las descritas en el apartado anterior 
pero cuya inoculación, incubación y lectura se efectúan de modo automatizado. 
También hay paneles en los que ademásde encontrarse los sustratos para el 
desarrollo de pruebas bioquímicas, se encuentran diversos antimicrobianos a 
distintas concentraciones, con lo que se realiza simultáneamente la identificación y 
antibiograma del microorganismo objeto de estudio. Existen distintos paneles para 
distintos grupos de microorganismos. La inoculación y la lectura de estos paneles se 
suele hacer de forma automática, incorporándose los datos obtenidos en un 
ordenador, el cual proporciona con un índice alto de fiabilidad, la identificación del 
microorganismo en estudio.