Clase_10_Hibridacion de Acidos Nucleicos (1)

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HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Bio. MsC. Carmen barba G.
Docente
Universidad técnica de Ambato
OBJETIVOS
Definir sobre la Hibridación aplicada a los ácidos nucleicos
Explicar el procedimiento de la Hibridación de ácidos nucleicos
Diferenciar los tipos de Hibridación en ácidos nucleicos
HIBRIDACIÓN MOLECULAR
La Hibridación de los ácidos nucleicos consiste en la unión de dos moléculas monocatenarias de los ácidos nucleicos por la complementariedad de sus bases nitrogenadas dando origen a una cadena bicatenaria.
Las cadenas de ácidos nucleicos provienen de dos moléculas diferentes, dando lugar a la hibridación de ADN-ADN, ADN-ARN o ARN-ARN.
Las técnicas de hibridación en Biología Molecular permiten detectar secuencias puntuales de ácidos nucleicos o dianas (ADN o ARN) con la utilización de Sondas Marcadas.
La Secuencia Diana es la cadena de nucleótidos que se pretende identificar en una muestra problema.
La Sonda es una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia diana.
Tras el proceso de hibridación se forma una estructura bicatenaria híbrida entre la sonda y la secuencia diana, que podrá ser detectada gracias al marcaje que se haya incorporado a la sonda.
Generación de una Sonda
La Sonda es un fragmento de aproximadamente de 100 a 1000 nucleótidos de ADN o ARN.
Se utiliza en muestras de ADN o ARN para detectar la presencia de NUCLEÓTIDOS, secuencias que son COMPLEMENTARIOS  a la secuencia de la sonda.
Tipos de Marcaje
Radioactiva: 
Sondas marcadas con isotopos por lo general con 32P, o se usa también tritio.
No Radiactiva (Inmunológico):
Se marcan con una molécula de digoxigenina, a la solución se le añaden anticuerpos específicos que se unen a esa molécula; y estos anticuerpos llevan asociado un compuesto luminiscente o fluorescente (Como el CDP-Star) que deja impronta fotográfica.
Procedimiento
Hibridación de ADN
Hibridación ADN-ARN
Características:
Las reacciones de hibridación son específicas. Las sondas se unen a los blancos, solamente cuando tienen una secuencia complementaria.
Las reacciones de hibridación se llevan a cabo en presencia de grandes cantidades de moléculas similares pero no idénticas al "blanco". Esto es, que una sonda puede encontrar una molécula del blanco en una mezcla de millones de moléculas relacionadas pero no complementarias.
Propiedades de los ácidos nucleicos y la técnica de Hibridación
ARN:
Northern Blod convencional
Northern Blod reverso (microarray)
Hibridación in situ
ADN:
Southrn Blod
Análisis de genotecas
Sothern Blod
Es la técnica por la que se transfiere el ADN desde el gel de agarosa o poliacrilamida a una membrana de nylon o nitrocelulosa
Protocolo:
Restricción para generar varios fragmentos de ADN
Electroforesis en geles de agarosa
Desnaturalización que permite la unión a la membrana de nitrocelulosa (UV, NaOH)
Transferencia al papel filtro por capilaridad
Hibridación con sonda específica
Lavados y visualización de la sonda por autoradiografía.
Northern Blot
Esta técnica permite la detección de ARN específicos separados por electroforesis a través de sondas marcadas.
Protocolo:
No se realiza digestión enzimática para obtener fragmentos de ARN
Electroforesis en condiciones desnaturalizantes: 
geles de agarosa con formaldehido, 
muestra de ADN se diluye en tampón con farmamida y formaldehido y se calienta a 65 grados centígrados.
No se necesita el paso de desnaturalización para la transferencia del gel a la membrana.
La transferencia, la hibridación y el revelado es similar a Southern blot.
Comparación entre las Técnicas de Southern y Norther Blot
		SOUTHERN	NORTHERN
	Moléculas detectadas	ADN	ARN
	Electroforesis	Gel Agarosa	Gel Agarosa/formaldehído
	Pre-tratamiento del gel	Depuración, desnaturalización y neutralización	---------------
	Método de transferencia	Capilaridad	Capilaridad
	Revelado	Sonda marcada Hibridacion	Sonda marcada Hibridación
	Detección	Autorradiografía
Quimioluminiscencia
Colorimetría	Autorradiografía
Quimioluminiscencia
Colorimetría
APLICACIONES
Fertilización in vitro.
Producción de biológicos (proteínas, anticuerpos monoclonales, hormona, enzimas).
Producción de fármacos y vacunas.
Transgénesis parcial: Terapia génica en humanos.
Estudios de genotoxicológicos.
Estudios de aberraciones cromosómicas adquiridas y congénitas.
Diagnóstico de enfermedades moleculares, infecciosas, hereditarias.
Test de paternidad.
Reconocimiento de identidad en la ciencia forense.
Cuestionario
Comente sobre la hibridación de ácidos nucleicos
¿Qué otras técnicas de hibridación se conocen aparte de Souther y Norther Blol?
¿Qué diferencias en el procedimiento de Souther y Norther Blold puede mencionar?
Entre las aplicaciones ¿Cuáles son de mucha utilidad para el trasplante de tejidos?
Mencione algunas ventajas que podemos obtener con la aplicación de estas técnicas.
Defina la hibridación de Western Blot y ¿cuál es su procedimiento y utilidad?
A continuación van a observar un vídeo de la temática tratada, el link es https://www.youtube.com/watch?v=bX-XAJblyVM
GRACIAS POR SU ATENCIÓN