Practica 2 - Inmunologia

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E.P de Ingeniería Biotecnológica	 UCSM		Inmunología Básica
PRÁCTICA Nº 2
OBTENCIÓN DE CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNOLÓGICO A PARTIR DE ÓRGANOS LINFOIDES
I. INTRODUCCIÓN
Las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas dependen de las actividades de los leucocitos. Estas células se originan en la médula ósea, y muchas también se desarrollan y maduran ahí. Después migran para proteger los tejidos periféricos, algunas de ellas residen dentro de los tejidos, otras circulan en el torrente sanguíneo y en un sistema de vasos especializado llamado sistema linfático, que drena líquido extracelular y células libres desde los tejidos, los transporta por el cuerpo como linfa, y finalmente se vacía de regreso hacia el sistema vascular sanguíneo.
Los linfocitos circulan en la sangre y la linfa, y se encuentran también en grandes números en tejidos linfoides u órganos linfoides, que son agregados organizados de linfocitos en una red de células no linfoides. Los órganos linfoides pueden dividirse a grandes rasgos en órganos linfoides centrales o primarios, donde se generan los linfocitos, y órganos linfoides periféricos o secundarios, donde se mantienen los linfocitos vírgenes maduros y se inician respuestas inmunitarias adaptativas.
Los órganos linfoides centrales son la médula ósea y el timo, un órgano que se encuentra en la parte alta del tórax. Los órganos linfoides periféricos comprenden los ganglios linfáticos, el bazo, y los tejidos linfoides de la mucosa del intestino, las vías nasales y respiratorias, las vías urogenitales, y otras mucosas. Los ganglios linfáticos están interconectados por medio de un sistema de vasos linfáticos, que drenan líquido extracelular desde los tejidos, a través de los ganglios linfáticos, y de regreso hacia la sangre.
II. MATERIALES Y REACTIVOS
· Medio RPMI 1640
· Etanol al 70%
· Tijeras y fórceps
· Placas petri
· Jeringas (3ml)
· Agujas 22G1
· Tubos Falcon de 15ml 
· Homogeneizador de tejidos de vidrio
· Suspensión celular.
· Hemocimetro
· Pipetas
· Pipetas pasteur
· Tubos eppendorf
· Solución de Turk
· Azul de trypan, 0.4%(w/v) en agua
· PBS
· Tubo plástico de 5ml
III. PROCEDIMIENTO
A) OBTENCION DE CELULAS
MÉDULA ÓSEA
1. Matar la rata por dislocación cervical o inhalación de CO2. Colocar la rata sobre una tabla de disección con el vientre hacia arriba. Empapar la rata con etanol para reducir el transporte de pelos con el aire.
2. Hacer un corte transversal largo a través de la piel en la parte media del área abdominal. Retirar la piel de las patas traseras.
3. Separar las piernas del cuerpo al nivel de la articulación de la cadera. Retirar la grasa y colocar las piernas en una placa petri con medio.
4. Retirar el tejido muscular del fémur y la tibia. Separar el fémur y la tibia y cortar las epífisis en ambos extremos.
5. Inyectar por los extremos del hueso 3ml de medio o PBS, con una jeringa para expulsar la médula ósea 
6. Remover los desechos grandes y los acúmulos celulares.
7. Lavar la suspensión por centrifugación a 300xg por 10 minutos a 4 grados y colocar en el medio al 5% de FS.
TIMO
1. Matar la rata por dislocación cervical o inhalación de CO2. Colocar la rata sobre una tabla de disección con el vientre hacia arriba. Empapar el abdomen de la rata con etanol para reducir el transporte de pelos con el aire.
2. Usando la tijera, hacer una incisión desde la región xifoidea hasta la región submandibular y retirar la piel lateralmente.
3. Hacer una incisión en el tórax y separar los bordes de la incisión.
4. Usando el fórceps, cuidadosamente agarrar los lóbulos tímicos y levántelos.
5. Poner el timo en una placa petri con medio.
6. Cortar el timo en pequeños trozos y haga una suspensión.
7. Cuidadosamente triturar el tejido en el homogeneizador de vidrio, utilizando el émbolo de una jeringa de 5 ml
8. Remover los desechos grandes y los acúmulos celulares.
9. Lavar la suspensión por centrifugación a 300xg por 10 minutos a 4 grados y colocar en el medio al 5% de FS.
BAZO
1. Matar la rata por dislocación cervical o inhalación de CO2. Colocar la rata sobre una tabla de disección con el vientre hacia arriba Empapar el abdomen de la rata con etanol para reducir el transporte de pelos con el aire.
2. Hacer una incisión a través de la piel en la región inguinal. Con los dedos sobre ambos lados del corte, tire entre la cabeza y la cola hasta que la pared peritoneal esté lo suficientemente expuesta. Empapar la cavidad peritoneal con etanol.
3. Cortar el peritoneo, levante el bazo con los fórceps, y separe este de los tejidos adyacentes con la tijera. Colocar el bazo en una placa petri con medio.
4. Cortar el bazo en pequeños trozos y haga una suspensión.
5. Cuidadosamente triturar el tejido en el homogeneizador de vidrio, utilizando el émbolo de una jeringa de 5 ml.
6. Remover los desechos grandes y los acúmulos celulares.
7. Lavar la suspensión por centrifugación a 300xg por 10 minutos a 4 grados y colocar en el medio al 5% de FS.
B) CONTEO CELULAR
1. Diluir las células en la solución de Turk.
2. Mezclar completamente y añadir 1 gota en la cámara de Neubauer usando la pipeta Pasteur o micropipeta
3. Contar las células de los cuadrantes de los extremos (1,3,7 y 9). Incluya en este recuento las células que se observan sobre las líneas de dos lados de cada cuadrado revisado.
4. Conteo de células/ml=Número de células (promedio correspondiente a un área de 1mm2) x factor de dilución x104.
C) DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR (Exclusión por azul de Trypan)
1. Mezclar 0.05 ml de la solución de azul de trypan, y 0.05 ml de la suspensión celular. Dejar incubar 5 minutos.
2. Transferir una pequeña cantidad de la suspensión a la cámara de Neubauer y contar las células. Las células no viables estarán teñidas de azul.
 Células viables (%)= Número total de células viables / ml X 100
 Número total de células / ml
COMENTARIO
· El azul de trypan tiene mayor afinidad por las proteínas del suero que por las proteínas celulares. Si el extendido es muy oscuro, resuspender las células en PBS antes de realizar el conteo.
· No incubar las células con azul de trypan por más de 15 minutos de lo contrario las células viables empezaran a captar el colorante.
ELIMINACIÓN DE ERITROCITOS DE LA SUSPENSIÓN CELULAR EMPLEANDO EL MÉTODO DEL CLORURO DE AMONIO
MATERIALES Y REACTIVOS
· Suspensión celular
· Tubo falcon de 15 ml
· PBS
-	Buffer Lisis de eritrocitos (NH4Cl 0,15M, KHCO3 y EDTA 0,1mM)
PROCEDIMIENTO
1. Mezclar la suspensión celular con el de buffer Lisis de Eritrocitos en una proporción (1/4)
2. Mezclar el tubo por inversión 5-6 veces 
3. Incubar las muestras sobre hielo, durante 5min (mezclar el tubo 2-3 veces durante la incubación).
4. Centrifugar a 4000 rpm durante 2 min.
5. Descartar el sobrenadante (cuidando de no eliminar el pellet que contiene los leucocitos).
6. Lavar el pellet con 1mL de suero fisiológico y volver centrifugar
NOTA: Si el pellet sigue contaminado con eritrocitos repetir la lisis.
IV. RESULTADOS
1. Esquematice el procedimiento de aislamiento de células inmunológicas a partir de la médula ósea, timo y bazo.
2. Haga un esquema de los órganos linfoides utilizados en la práctica
3. Haga los cálculos para determinar el número de células por ml.
4. Determine el porcentaje de viabilidad celular.
V. CUESTIONARIO
1. Indique cuales son los órganos linfoides primarios y secundarios
Los órganos linfoides primarios son:
· Médula ósea
· Timo
Los órganos linfoides secundarios son:
· Ganglios linfáticos
· Bazo
· Amigdalas
· Agregados de linfocitos y células presentadoras de antígenos en el pulmón, tubo digestivo, también las placas de peyer.
2. Mencione cual es la función de los órganos linfoides en la respuesta inmunitaria
Los órganos linfoides secundarios forman el lugar donde las células del sistema inmunitario terminan su diferenciación o se activan produciendo una respuesta inmune Estos son el bazo y los ganglios linfáticos. Se dividen en órganos linfoides primarios, que constituyenlos órganos donde se forman las células del sistema inmune. Estos son la médula ósea y el timo.
3. Cual es la estructura del timo y que importancia tiene desde el punto de vista 
Inmunológico
El Timo es un órgano en forma de glándula del sistema inmunológico formado por linfocitos T, que son las células encargadas de la inmunidad celular, respondiendo con la activación de algunas células para combatir las infecciones.
4. Comente la relación estructura-función del bazo en la respuesta inmunológica
Básicamente, el bazo es un contenedor de almacenamiento y un filtro para la sangre, aunque es parte del sistema linfático. De hecho, es el nódulo linfático más grande del cuerpo. Una de sus tareas es eliminar bacterias y virus dañinos en el torrente sanguíneo.
5. Explique el fundamento del Método de exclusión del Azul de Trypan 
El azul de tripán es un colorante azoico que se utiliza en tinciones histológicas, estos colorantes tienen mayor afinidad por las proteínas del suero que por las proteínas celulares. Las células vivas o tejidos con la membrana celular intacta no se colorean debido a que la membrana celular es selectiva respecto a qué compuestos pueden atravesarla. En las células viables, con membrana intacta, no se incorpora el azul de tripano; por el contrario, sí atraviesa la membrana de las células muertas. Por lo tanto, las células muertas se muestran de un distintivo color azul bajo el microscopio. Debido a que las células vivas excluyen al colorante y no se tiñen, este método también se llama método de tinción por exclusión.
PRÁCTICA Nº 2
EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR: METODO DE EXCLUSIÓN DEL AZUL DE TRYPAN
I. OBJETIVOS
· Evaluar la viabilidad de una suspensión celular
· Determinar el número de células viables en una suspensión celular 
INTRODUCCIÓN
El método de exclusión del colorante es una técnica simple y rápida para evaluar el número de células viables presentes en una suspensión celular. Se basa en el principio de que las células vivas poseen una membrana celular intacta que excluye ciertos colorantes tales como el azul de trypan, eosina o yoduro de propidio, mientras que las células muertas han perdido su integridad de membrana y no pueden excluir el colorante. En este método se mezcla una suspensión celular con el colorante y luego se examina visualmente para determinar si las células han captado o excluido el colorante. Se considera que una célula está viable si tiene un citoplasma claro mientras que una célula no viable tendrá un citoplasma azul.
III. REACTIVOS Y MATERIALES
· PBS.
· Azul de trypan (0.2%)
· Suspensión celular 
· Micropipetas 0 – 20 ul – 200 – 100 ul
· Microscopio
· Cámara de newbauer ( hemocitometro )
IV. ACTIVIDADES
1. Centrifugar una alícuota de una suspensión celular de la cual se desea determinar la viabilidad durante 2 min. a 4000 rpm y luego descartar el sobrenadante.
2. Resuspender el pellet celular en 1 ml de PBS o medio de cultivo libre de suero.
3. Mezclar 1 parte de la suspensión celular (diluida en PBS) con una parte del azul de trypan 0.4 %. Incubar la mezcla por 3 min a temperatura ambiente. 
4. Aplicar una gota (aprox. 20 ul ) de la mezcla células – azul de trypan en una cámara de Neubauer. Colocar el hemocitómetro en la platina del microscopio y enfocar las células con el objetivo de 40x.
5. Contar las células viables (no teñidas) y las células no viables (teñidas)
6. Determinar el número de células viables utilizando la sgte formula:
	
	 Células viables (%)= Número total de células viables / ml X 100
 Número total de células / ml 
V. RESULTADOS
1. Haga los cálculos para determinar el número de células por ml.
2. Determine el porcentaje de viabilidad celular 
	Cuadrantes
	Teñidas de azul/no viables
	No teñidas/viables
	Total
	1
	14
	28
	42
	3
	28
	31
	59
	7
	42
	16
	58
	9
	55
	29
	84
	Total
	139
	104
	243
VI. CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es el fundamento del Método de exclusión del Azul de Trypan ?
El azul tripán es un colorante azoico que se utiliza en tinciones histológicas, estos colorantes tienen mayor afinidad por las proteínas del suero que por las proteínas celulares. Las células vivas o tejidos con la membrana celular intacta no se colorean debido a que la membrana celular es selectiva respecto a qué compuestos pueden atravesarla. En las células viables, con membrana intacta, no se incorpora el azul de tripano; por el contrario, sí atraviesa la membrana de las células muertas. Por lo tanto, las células muertas se muestran de un distintivo color azul bajo el microscopio. Debido a que las células vivas excluyen al colorante y no se tiñen, este método también se llama método de tinción por exclusión.
2. ¿Por qué se debe evitar utilizar un medio de cultivo con suero, en la evaluación de la viabilidad celular por el método del azul de trypan?
Porque el Azul de tripán tiene una alta afinidad por las proteínas, las cuales interferiría con la evaluación de la viabilidad celular.
3. ¿Qué otros colorantes se pueden usar en la determinación de la viabilidad celular?
Ioduro de Propidio: La tinción celular con Ioduro de Propidio (IP) permite evaluar la viabilidad mediante la apreciación de la integridad de la membrana plasmática y nuclear, siendo evaluada la etapa final de la muerte celular.