PRACTICA N 3 - FERMENTACION ALCOHOLICA DE LA GLUCOSA

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PRÁCTICA Nº 3
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA DE LA GLUCOSA
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS
1. Formación de Acetaldehído y Etanol a partir de glucosa en presencia de Saccharomyces cerevisiae.
a) Identificación de acetaldehído
b) Cuantificación de etanol 
2. Cuantificación del contenido alcohólico en diversas bebidas
INTRODUCCIÓN. 
Las fermentaciones son procesos anaeróbicos que liberan energía para la formación de ATP en un proceso conocido como “fosforilación a nivel de sustrato”. La energía producida en los procesos de fermentación y que las células aprovechan para las reacciones endergónicas, se acumula en forma de ATP; parte de la cual se emplea en la fosforilación de las hexosas. 
La fermentación alcohólica es un proceso bioquímico que por acción de las levaduras, 1 mol glucosa es convertida anaeróbicamente en 2 moles de etanol. Las células de levadura son esenciales para producir las enzimas necesarias que participan en el proceso fermentativo, pero una vez que éstas estén presentes ya no serán tan indispensables para que la fermentación se produzca en forma normal. 
En levaduras, la glucosa anaeróbicamente es convertida en etanol y dióxido de carbono, y las etapas enzimáticas son idénticas a las de la fermentación láctica o glicólisis, a excepción de la etapa terminal catalizada por la Deshidrogenasa láctica, la cual es reemplazada por dos etapas enzimáticas adicionales, donde intervienen la Piruvato Descarboxilasa y la Alcohol Deshidrogenasa. 
La reacción de descarboxilación del Piruvato, en acetaldehído y dióxido de carbono, es catalizada por la Piruvato Descarboxilasa, enzima que requiere de Pirofosfato de Tiamina (PPT) como coenzima, además de iones Mg2+. Como producto intermediario se forma “ácido pirúvico activo” que por liberación del CO2 se convierte en “acetaldehído activo” (PPT–Acetaldehído), intermediario que luego se descompone en PPT acetaldehído, éste último se reducirá a etanol en la reacción siguiente; no obstante, una parte del acetaldehído activo se condensa a acetaldehído libre para formar acetil-metil-carbinol. (Acetoína). 
Pi
TRIOSA FOSFATO
ISOMERASA
 
Dihidroxiacetona fosfato
Gliceraldehido 3-fosfato
GLICERALDEHIDO 3 P
DESHIDROGENASA
Acido 1,3 difosfoglicérico
FOSFOGLICERO
KINASA
Acido 3-fosfoglicérico
FOSFOGLICERO 
MUTASA
Acido 2-fosfoglicérico
Ac. Fosfoenol pirúvico
PIRUVATO KINASA
ENOLASA
H2O
Glucosa – 6 P
GLUCOSA
Fructosa – 6 P
FOSFOGLUCO ISOMERASA
FOSFOFRUCTO
QUINASA
ALDOLASA
Fructosa 1, 6 Bis P
ATP
ADP
ATP
ADP
NAD+
NADH2
ADP
ATP
ADP
ATP
FIGURA Nº 3 .- Fermentación alcohólica de la glucosa
(2)
(2)
(2)
(2)
(2)
(2)
HEXOQUINASA
Ac. Pirúvico
Acetaldehido
NADH2
NAD+
ETANOL
ALCOHOL
DESHIDROGENASA
(2)
(2)
PIRUVATO DESCARBOXILASA
PPT
CO2
La conversión de acetaldehído en etanol es llevada a cabo por la alcohol deshidrogenasa, la cual es una enzima que requiere de NADH + H+ y que cataliza la reacción de izquierda a derecha cuando esta se lleva a cabo en un medio ligeramente ácido ( pH de 5 a 6 ), por el contrario en medio ligeramente alcalino (pH 8) esta se realiza de derecha a izquierda. 
Como inductores de la fermentación alcohólica, no sólo actúan las levaduras de Saccharomyces cerevisiae, sino también las bacterias: pseudomonas, xanthomonas y aeromonas. 
En la fermentación alcohólica, además del etanol y dióxido de carbono se originan productos secundarios como glicerina, ácido acético y ácido succínico. 
EXPERIMENTO 1. 
FERMENTACIÓN DE LA GLUCOSA POR Saccharomyces cerevisiae HASTA ACETALDEHÍDO Y ETANOL 
En 2 matraces ( M-1 y M-2 ) de 50 ml., agregar lo siguiente: 
 
	
	M - 1
	M – 2
	1.- Levadura de panificación fresca
	1.0 g
	1.0 g
	2.- Solución de glucosa al 5 %, recién preparada y a pH 5.5 
 
	10.0 ml
	------
	3.- Solución de glucosa al 5 %, recién preparada y a pH 8.0
	------
	10.0 ml
	4.- Mezclar bien y agregar el reactivo sulfito de calcio
	------
	500 mg
	5.- Mezclar y agregar rápidamente parafina líquida hasta que 
 cubra la superficie.
	5.0 ml
	5.0 ml
	Incubar en baño de agua a 37 ºC durante 60 minutos
	6.- Centrifugar a 3,000 rpm.
	10 min.
	10 min.
	Obtener los sobrenadantes por separado para las determinaciones del acetaldehído y etanol
Identificación del acetaldehído. 
Fundamento: 
En el sobrenadante de la muestra de incubación el sulfito de calcio atrapa al acetaldehído, el cual puede observarse por el cambio de color que se produce al reaccionar con el nitroprusiato de sodio y la piperidina.
Procedimiento. 
En 3 tubos de ensayo ( T) debidamente rotulados, agregar lo siguiente: 
	
	T - 1
	T –2
	T – 3
	1. Sobrenadante de M – 1 
	1.0 ml
	---
	---
	2. Sobrenadante de M – 2 
	---
	1.0 ml
	---
	3. Agua destilada
	---
	---
	1.0 ml
	4. Solución de Nitroprusiato de Sodio 
	0.5 ml
	0.5 ml
	0.5 ml
	Mezclar y colocar los tubos en el baño de agua hirviendo por 5 minutos.
	5.Observar. Anotar el color y olor característico 
 del acetaldehído
	
	
	
CUANTIFICACIÓN DEL ETANOL (Método de Sheftel modificado). 
Fundamento. 
La mezcla oxidante Dicromato-ácido sulfúrico actúa sobre el alcohol etílico transformándolo en ácido acético, a la vez que se forma sulfato cromoso con una coloración que varía del amarillo al verde, en forma proporcional a la concentración de etanol existente en la muestra, susceptible a ser medido por fotocolorimetría.
Reactivos:
a) Dicromato de potasio.	8.524 g. 
Agua destilada		1000 ml.
b) Ácido sulfúrico Q.P.	1000 ml
c) Mezcla sulfocrómica: Verter lentamente el ácido sulfúrico a la solución de bicromato (Reacción exotérmica). 
Procedimiento:
1. Colocar 0.5 ml de la mezcla sulfocrómica en un frasco de 30 ml. aproximadamente.
2. Colocar exactamente 0.2 ml. de la muestra a analizar en una tira doblada de papel filtro adherida a un tapón de jebe con un alfiler.
3. Finalmente colocar herméticamente en el frasco que contiene la solución sulfocrómica, cuidando que la tira de papel filtro no toque las paredes del frasco ni el reactivo.
4. Colocar las tapas rosca y llevarlas a Baño María hirviente o a estufa a 100 ºC por 10 minutos.
5. Retirar el tapón con la tira de papel que contiene a la muestra. Enfriar y agregar 12.5 ml de agua destilada.
6. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 578 nm. 
7. Preparar sistemas estándar del mismo modo que para las muestras problema, sólo que en su lugar medir 0.2 ml del estándar respectivo ( 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml y 2 mg/ml ) en la tira de papel filtro. º
8. De igual modo preparar un blanco, procediendo exactamente de la misma manera que para la muestra problema, sólo que en lugar de esta última medir 0.2 ml de agua destilada en la tira de papel filtro. 
RESULTADOS. 
Calcular los Factores de calibración respectivos en base a los datos indicados:
	
	 Absorbancia
 ( D.O )
	Absorbancia neta
	Factor de
Calibración.
	Fc
Promedio
	Concentración
	Blanco
	0.001
	------
	------
	-----
	
	Estándar 1 ( 0.5 mg/ml )
	0.025
	0.024
	20.83
	
20.35
	
-----
	Estándar 2 ( 1.0 mg/ml )
	0.052
	0.051
	19.61
	
	
	Estándar 3 ( 2.0 mg/ml )
	0.098
	0.097
	20.62
	
	
	Muestra 1
	0.086
	0.085
	-----
	-----
	1.73
	Muestra 2
	0.047
	0.046
	-----
	-----
	0.94
Resultados obtenidos del experimento 1 (fermentación alcohólica de la glucosa):
	
	T – 1
	T – 2
	T – 3
	Identificación de acetaldehído
Coloración obtenida
	Naranja
	Rojo
	Naranja
	Cantidad de etanol (mg % )
	1,73
	0.94
	-----
Figura 1. Identificación de acetaldehído
El color rojo intenso del M-2 indica la presencia de acetaldehído, mientras que en los otros tubos de color naranja se puede inferir que no hay presencia del acetaldehído.
Figura 2. Cuantificación del etanol
La muestra M-1 tiene mayor cantidad de etanol, ya que posee una coloración verdosa que corresponde a una alta concentración de etanol por el contrario la muestra M-2 posee una coloración amarillenta, lo que indica que tiene menos concentración de alcohol transformado. 
INTERROGANTES YCOMENTARIOS. 
1. Comente o explique los resultados obtenidos en la identificación del acetaldehído. (Paola)
· Los resultados obtenidos en la identificación de acetaldehído son:
· T-1: La coloración observada es naranja, esto se debe a que el sustrato se encontraba a un pH ácido 5.5, resultando en la descarboxilación del piruvato para obtener el etanol. Por lo tanto, el nitroprusiato de sodio no cambia su coloración a rojo, al no haber acetaldehído. 
· T-2: La coloración observada es roja, ya que el sustrato se encontraba a un pH alcalino 8.0, lo cual afectó a la enzima Alcohol deshidrogenasa, resultando en la obtención de acetaldehído. Posteriormente, se logró la acumulación de acetaldehído con la adición de sulfito de sodio, el cual reaccionó con el Nitroprusiato de Sodio y la Piperina, dando una coloración roja, lo cual significa que se encontró acetaldehído.
· T-3 o Blanco: La coloración observada es naranja, puesto que no se identificó acetaldehído, ya que solo se tenía la presencia de agua destilada. 
2. Comente o explique los resultados obtenidos en la cuantificación de etanol del experimento. (Daniela)
· M1 Y M2 tiene coloraciones diferentes, en M1 se produce etanol, por ende la mezcla sulfocrómica sufrió una reducción dandonos un sulfato de color verdoso, pero en el caso de M2 tiene una coloración amarillenta nos indica que es un dicromato.
3. Esquematiza la secuencia de reacciones de la fermentación alcohólica de la fructosa. (Vyctoria)
· Las flechas marcadas con negro indican que la reacción es reversible.
4. Escriba las coenzimas y/o cofactores que necesita la piruvato descarboxilasa y la alcohol deshidrogenasa. (Valentina)
· Piruvato descarboxilasa:
Esta enzima es parte del proceso de fermentación que produce etanol y que se produce en las levaduras saccharomyces.La piruvato descarboxilasa del co factor tiamina pirofosfato (TPP) y magnesio .
· Alcohol deshidrogenasa:
La enzima cataliza la reacción de oxidación de un alcohol a un aldehído utilizado como aceptor de electrones al NADP y como cofactor de Zinc, el segundo cofactor es un NAD. 
5. Indique para qué se utilizan los siguientes compuestos o sustancias, en la presente práctica: (Grecia)
· Sulfito de calcio: Se utiliza para atrapar al acetaldehído producido, evitando que reaccione con otras sustancias.
· Solución sulfocrómica diluida: Es para determinar la cantidad de etanol presente. Da positivo, en presencia de alcohol, cuanto toma una coloración verde y negativo cuando es naranja
6. Mencione las diferencias entre la fermentación láctica y la fermentación alcohólica. (Grecia)
· En la fermentación alcohólica se obtiene como productos a 2 CO2 + 2 etanol + 2 ATP. Los organismos que intervienen son levaduras. 
· En la fermentación láctica se obtienen como productos 2 lactato + 2 ATP + 2H2O. Los organismos que intervienen son bacterias del género Lactobacillus y también ocurre en algunos tejidos, como el músculo.(*)
7. ¿Qué otros compuestos se pueden formar durante la fermentación alcohólica? (Daniela)
· Como sabemos, la fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico donde intervienen diferentes microorganismos (levaduras, bacterias, etc), que transforman los azúcares en alcohol, dióxido de carbono y energía; este proceso es utilizados en la fabricación de alcoholes (cervezas, sidra sake entre otros) o en la industria pastelera.
REFERENCIAS
1. CK-12 Foundation. CK12-Foundation [Internet]. Ck12.org. [cited 2021 Sep 9]. Available from: https://flexbooks.ck12.org/cbook/ck-12-conceptos-biologia/section/2.30/primary/lesson/fermentaci%C3%B3n/
2. Carlos A, Morales, Camila M, Campo D. PRODUCTOS DE LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA; UN BENEFICIO PARA LA SALUD ALCOHOLIC FERMENTATION PRODUCTS; A BENEFIT FOR HEALTH [Internet]. ; Available from: http://bibliotecadigital.usb.edu.co/bitstream/10819/2613/1/Fermentaci%C3%B3n%20alcoh%C3%B3lica%20un%20proceso_Carlos%20Contreras_USBCTG_2015.pdf