Nro-3-Cinetica-Enzimatica-Quimica-Biologica-FCEN

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Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de 
Mexico 
 
 
 
CLASE “ QUIMICA” 
 
 
 
trabajo 
 
 
 
 
GRUPO:24 
 
 
 
NOMBRE DEL PROFESOR: JUAN GERMAN RIOS ESTRADA 
 
 
 
NOMBRE DEL ALUMNO: CORTES HERNANDEZ RICARDO 
 
 
 
 FECHA DE ENTREGA: 13 MARZO DEL 2023 
 
 
 
 
 
 
 
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CINÉTICA ENZIMÁTICA 
OBJETIVOS 
1 - Conocer cómo se puede estudiar la cinética básica de una enzima y se calculan sus parámetros 
Michaelianos. 
2 - Estudiar el efecto que ejerce un inhibidor sobre la cinética de una enzima. 
METODOLOGÍA 
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA δ -AMINOLEVULÍNICO DEHIDRASA (ALA-D) 
Materiales 
• Fuente enzimática: Fración S proveniente de la centrifugación a alta velocidad (15.000 g) de un 
homogenato de hígado de cerdo. 
• Buffer de la incubación: buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8. 
• Sustrato: ALA en buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8. 
• Solución desproteinizadora: CuS04 ss (solución saturada). 
• Reactivo de Ehrlich (pipetear bajo campana): 2 g de p-dimetilaminobenzaldehído disueltos en 
25ml de HCl (concentrado, 12 M) y 75 ml de ácido acético glacial. 
• β-Mercaptoetanol (proviene de un stock concentrado: 14,34 M) (pipetear bajo campana): 200 
mM. 
 
Procedimiento 
 
Se procedió según el protocolo descripto en la guía de trabajos prácticos de cinética enzimática y 
según las indicaciones de los docentes para cada grupo. Para el análisis se realizó una 
espectrofotometría de absorción de la cantidad de producto (PBG) formado para distintas 
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concentraciones de sustrato. Los tubos se prepararon según el protocolo indicado en la Tabla 1 
manteniéndolos en frío, en dicha tabla también se detallan los resultados de absorbancia. Luego 
se los llevó a incubar a 37°C durante 20 minutos. La reacción se cortó con 0,1 mL de CuSO4 (s.s.), se 
agitó vigorosamente y se centrifugó durante 15 minutos a 3000 r.p.m. El producto de la reacción 
(PBG) se determinó en el sobrenadante. Para ello, se trasvasó a otro tubo, se le agregó 1 ml de 
reactivo de Ehrlich y se agitó inmediatamente. Se midió la absorbancia a 555 nm entre los 8 y 15 
minutos. Con estos datos, la cantidad de PBG en cada reacción pudo determinarse a partir de la 
Ley de Beer. (Ɛ = 113.6 ml/mg). 
 
 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Tubos 
ALA 
(mM) 
ALA 
10 mM 
(mL) 
Ác. 
Levulínico 
(mM) 
Ác. 
Levulínico 
 5 mM (mL) 
β –Me 
200 mM 
(mL) 
Enzima 
(mL) 
Buffer 
(mL) 
Abs 
(555nm) 
B 0 0 0 0 0.1 0.15 0.75 0.022* 
1 0.05 0.005 0 0 0.1 0.15 0.745 0.134 
2 0.10 0.010 0 0 0.1 0.15 0.740 0.235 
3 0.25 0.025 0 0 0.1 0.15 0.725 0.309 
4 0.50 0.050 0 0 0.1 0.15 0.700 0.384 
5 0.75 0.075 0 0 0.1 0.15 0.675 0.422 
6 1.00 0.1 0 0 0.1 0.15 0.650 0.415 
7 3.00 0.3 0 0 0.1 0.15 0.450 0.05** 
Bi 0 0 0.5 0.05 0.1 0.15 0.700 0.021* 
1i 0.05 0.005 0.25 0.05 0.1 0.15 0.695 0.096 
2i 0.10 0.010 0.25 0.05 0.1 0.15 0.690 0.128 
3i 0.25 0.025 0.25 0.05 0.1 0.15 0.675 0.212 
4i 0.50 0.050 0.25 0.05 0.1 0.15 0.650 0.268 
5i 0.75 0.075 0.25 0.05 0.1 0.15 0.625 0.309 
6i 1.00 0.1 0.25 0.05 0.1 0.15 0.600 0.313 
7i 3.00 0.3 0.25 0.05 0.1 0.15 0.400 0.374 
Tabla 1 Protocolo utilizado para analizar el efecto del ácido levulínico sobre la actividad de la ALA-D. 
* La diferencia de absorbancia en el blanco se muestra comparada frente a la del H2O 
** El valor de absorbancia es anómalo debido a un error en el procedimiento, por lo que no se utiliza para realizar los 
análisis correspondientes. 
 
 
Determinación de las velocidades iniciales 
 
Sabemos según la Ley de Beer que la absorbancia se relaciona con la concentración de una 
muestra según: 
𝐴 = 𝛼 . 𝑏 . 𝐶 
 
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Donde b es el paso de la cubeta (en este caso, 1 cm) y α es una constante de absortividad. Para 
conocer la masa de proteína en dicha cubeta debemos multiplicar el valor de concentración por el 
volumen utilizado, por lo tanto tenemos: 
 
𝐶 =
𝐴
𝛼 ∙ 𝑏
=
𝑚
𝑣
 → 𝑚 = 
𝐴 ∙ 𝑣
𝛼 ∙ 𝑏
 
 
Para conocer el valor de velocidad necesitamos normalizar el valor a una cantidad de unidades 
enzimáticas por hora. Por lo tanto, necesitamos dividir por el peso molecular del PBG para 
normalizar por UE y multiplicar por 3 debido a que este valor de velocidad es por 20 minutos y 
queremos que sea cada 60 minutos. 
 
Vo= A ∙v ∙3 ∙PM(PBG)α ∙b 
 
Donde 
PM (PBG) = Peso Molecular PBG = 226 gr/mol = 0,226 mg/nmol 
V = 1 mL 
 
 De esta manera, tenemos la velocidad normalizada por unidad enzimática, por tiempo y por 
volumen. Si reemplazamos los valores para cada valor de velocidad obtenemos la siguiente tabla. 
 
Tubos Vi 
B 0,000 
1 0,013 
2 0,025 
3 0,034 
4 0,042 
5 0,047 
6 0,046 
7 0,003 
Bi 0,000 
1i 0,009 
2i 0,013 
3i 0,022 
4i 0,029 
5i 0,034 
6i 0,034 
7i 0,041 
Tabla 2. Velocidades inciales para cada ensayo tanto con inhibidor como sin inhibidor. 
En base a los valores de la tabla 2, y las concentraciones de sustrato en cada tubo se realizó el 
siguiente gráfico 1. 
 
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Gráfico 1. Velocidades iniciales vs. Concentración de ALA-D para los ensayos con y sin ácido levulínico 
 
En el gráfico 1 en el cual se puede observar cómo evoluciona la relación entre la concentración de 
sustrato y la velocidad de la reacción (obtenidas anteriormente de manera analítica) puede verse 
que las curvas tienen un comportamiento logarítmico consistente con una curva michaeliana. En 
las concentraciones más altas, cuando aumentamos [ALA-D], la enzima se satura de sustrato y 
alcanza su velocidad máxima, que no sobrepasará en ningún caso, independientemente de la 
[ALA-D]. Comparando ambas curvas, con y sin ácido levulínico podemos ver que en los ensayos en 
los cuales se añadió dicho compuesto, las velocidades disminuyeron respecto a los tubos sin ácido 
levulínico. Por lo tanto, podemos confirmar que el ácido levulínico es un inhibidor competitivo. 
 
 
Gráfico 2. Linealización de Lineaweaver-Burk, representando 1/Vi vs. 1/[ALA-D] 
 
En el gráfico 2 se realizó una linealización de Lineweaver-Burk, en el cual se representan la inversa 
de la velocidad inicial versus la inversa de la concentración de ALA-D. Utilizando esta linealización y 
realizando un ajuste lineal a partir del método de cuadrados mínimos como puede verse en el 
gráfico 3, se puede obtener la constante de Michaelis (Km) y la velocidad máxima Vm para cada 
grupo de datos a partir de los parámetros de la pendiente y la ordenada al origen de dicha recta. 
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Gráfico 3. Linealización de Lineaweaver-Burk, representando 1/Vi vs. 1/[ALA-D] incluyendo ajuste lineal. 
 
Teniendo en cuenta que 
𝑉𝑜 = 
𝑉𝑚 × [𝑆]
𝐾𝑚 + [𝑆]
 
Entonces 
1
𝑉𝑜
 = 
𝐾𝑚 + [𝑆]
𝑉𝑚 [𝑆]
= 
𝐾𝑚
𝑉𝑚
∙ 
1
[𝑆]
+
1
𝑉𝑚
∙
[𝑆]
[𝑆]
 
Por lo tanto, podemos considerar una relación lineal entre 1/Vo y el resto de los parámetros, 
considerando: 
𝑓(𝑥) = 𝑚𝑥 + 𝑏 
Donde 
𝑓(𝑥) =
1
𝑉𝑜
 ; 𝑚 =
𝐾𝑚
𝑉𝑚 
 ; 𝑥 =
1
[𝑆]
 ; 𝑏 = 
1
𝑉𝑚
 
Por lo tanto, según los datos del ajuste lineal obtenemos los siguientes resultados 
 1/Vm Km/Vm Vm Km 
Keq (intersección con 
el eje x) 
Con 
inhibidor 
26,68 4,55 0,037 0,168 0,170 
Sin 
inhibidor 
16,92 2,86 0,059 0,169 0,169 
Tabla 3. Parámetros cinéticos obtenidos a partir de las regresiones lineales de ambas rectas. 
Como podemos observar en la tabla 3, el valor de Km experimental es muy similar en los ensayos 
sin inhibidor al valor de dicha constante en los ensayos con inhibidor, tanto en el cálculo realizado 
a partir de la pendiente (Km/Vm) como el cálculo realizado a partir de la intersección de la recta 
Sin inhibidor 
Con inhibidor 
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con el eje de las absisas (llamado K equivalente en la tabla 3). Por lo tanto, podemos afirmar en 
base a estos resultados que la constante de Michaelis es igual en ambos grupos de datos. 
 
Km’ = Km 
Donde Km’ es la constante de michaelis de los ensayos con inhibidor. En cuantoa Vm, podemos 
ver que en los ensayos sin inhibidor el valor es de aproximadamente el doble del Vm de los 
ensayos con inhibidor. Por lo tanto 
Vm’ < Vm 
Donde Vm’ es la velocidad máxima de los ensayos con inhibidor. 
Teniendo en cuenta estos datos podemos decir que el ácido levulínico parece ser un inhibidor no 
competitivo puro. De todas maneras, estos resultados pueden ser poco confiables debido a que no 
se realizaron réplicas de los ensayos por falta de tiempo, por lo tanto pueden no ser exactos. 
Determinación de Ki 
Para un inhibidor no competitivo puro sabemos que: 
𝑉𝑚′ =
𝑉𝑚
1 +
[𝐼]
𝐾𝑖
 
Por lo tanto, 
𝐾𝑖 = 
𝑉𝑚′ ∙ [𝐼]
𝑉𝑚 − 𝑉𝑚′
 
Reemplazando los valores a partir de los datos de las tablas 1 y 3 se tiene que 
𝐾𝑖 = 
0,059 ∙ 0,250 
0,037 − 0,059
= −0,67 
 
CONCLUSIONES 
Se determinaron las velocidades iniciales utilizando la Ley de Beer y los parámetros necesarios 
para determinar las unidades enzimáticas presentes en los ensayos. 
Se pudieron graficar correctamente las curvas de velocidades iniciales versus concentración de 
sustrato obteniéndose curvas michaelianas, además de constatarse el efecto del inhibidor, el cual 
redujo proporcionalmente las velocidades iniciales alcanzadas en cada una de las concentraciones 
de sustrato. 
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Se linealizaron los datos aplicando el método de linealización de Lineweaver-Burk y a partir de los 
parámetros obtenidos de la regresión lineal se calcularon las constantes michaelianas de los 
ensayos con y sin inhibidor y las velocidades máximas alcanzadas para cada grupo de datos. Estas 
constantes nos indicaron que el inhibidor era compatible con un tipo de inhibición no competitivo 
puro. 
Se determinó la constante de disociación del inhibidor considerando un modelo de inhibición no 
competitivo puro.