Citometría de flujo

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Citometría de flujo
M en C. Carlos Arturo Gallardo Hernández
CITOMETRÍA DE FLUJO
Análisis multiparamétrico de las características físicas y químicas de las células en suspensión 
Tamaño.
Complejidad.
Fluorescencia 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
3
Obtención de células provenientes del bazo de un ratón
1500 r.p.m durante 5 minutos
Aforar a 11 mL con PBS 1X
Lisis de eritrocitos
Cloruro de amonio
3 mL durante 3 minutos
+
1500 r.p.m durante 5 minutos
Aforar a 11 mL con PBS 1X
Conteo de células y viabilidad
Decantar el sobrenadante 
+
1 mL
Dato importante:
Mantener las células siempre en hielo.
10 uL
90 uL
Conteo de células y viabilidad
# de esplenocitos totales= # de células vivas X 100,000
Tinción de citometría de flujo
IL-10
1 mL
65,000,000 millones de esplenocitos
Tinción de citometría de flujo
¿? mL
1,000,000 millones de esplenocitos
¿Cuántos uL debo tomar del total de células para quedarme solo con 1 millón?
Tinción de citometría de flujo
Mix de Anticuerpos
0.3 uL
0.3 uL
0.3 uL
0.3 uL
0.3 uL
0.9 uL
0.9 uL
0.9 uL
0.9 uL
0.9 uL
Multiplicar X 3
 CD19
 CD21
 CD23
 CD24
 IL-10
MIX
4.5 uL de Ac´s + 45.5 uL de PBS1X= 50 uL
10 uL
10 uL MIX
15.38 uL Células
74.62 uL PBS 1X
Volumen final= 100 uL
Incubar a temperatura ambiente en oscuridad durante 15 min
1 mL
1500 r.p.m durante 5 minutos
300 uL
Lectura de resultados en el citómetro de flujo
CD19
CD3
LB
LT
Estrategia de análisis
CD21
CD24
T1: CD21Low CD24High
T2: CD21High CD24High
M: CD21LowCD24low
CD21
CD23
NF: CD21NegCD23Neg
FO: CD21LowCD23Pos
ZM: CD21PosCD23Neg
Expresión de proteínas por citometría de flujo
Análisis de citometría de flujo para separar Linfocitos B (T1, T2, foliculares y zona marginal) de ratones sanos y deficientes de CD19
Entrega: Lunes 6 de junio
Trabajo de laboratorio