Descarga la aplicación para disfrutar aún más
Vista previa del material en texto
con un compuesto fluorescente (normalmente bromuro de etidio), y cuyo tamaño se establece por comparación con marcadores de longitud conocida. Sin embargo, la digestión con endonucleasas de restricción del ADN genómico (con- junto del ADN cromosómico) da lugar a multitud de frag- mentos heterogéneos, que no se detectan como bandas defi- nidas por tinción con bromuro de etidio. La detección como una banda de un fragmento concreto puede efectuarse si se dispone de una sonda específica que se asocie con él. 23.3.2 Transferencia de Southern y detección de fragmentos génicos por hibridación. Obtención de sondas Una sonda es un fragmento de ADN marcado (casi siempre con 32P) que permite detectar secuencias complementarias tanto de ARN, como de ADN, mediante un proceso deno- minado hibridación, que supone la formación de estructu- ras bicatenarias híbridas a partir del fragmento a detectar y la sonda. Para que la unión de la sonda y el fragmento de ADN diana se produzca, ambas moléculas deben tener una estructura monocatenaria que permita el apareamiento de bases. Por ello, es necesario desnaturalizar los fragmentos correspondientes (mediante calor o tratamiento alcalino) antes de la hibridación. En el caso de la detección de un fragmento génico, entre los diferentes separados por elec- troforesis, el ADN se transfiere desde el gel hasta un sopor- te de nailon o nitrocelulosa, donde queda reproducida la distribución de fragmentos del gel (transferencia de Southern) (Fig. 23-3). Para ello, el gel se trata en un medio alcalino, que desna- turaliza los fragmentos de ADN separados por electrofóresis, 404 | Genoma, patología molecular y terapia génica Tabla 23-1. Endonucleasas de restricción de tipo II (ejemplos) Nombre Secuencia diana Extremos generados ↓ EcoRI GAATTC CTTAAG ↑ ↓ HaeIII GGCC CCGG ↑ ↓ PstI CTGCAC GACGTG ↑ 5’ 5’ 3’ 3’ Extremos romos 5’ 5’ 3’ 3’ Extremos cohesivos 3’ ACGTTGCA 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ TTAA 5’ AATT 5’ Extremos cohesivos 5’ 23 Capitulo 23 8/4/05 11:42 Página 404 BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR (...) CONTENIDO PARTE II: BIOLOGÍA Y PATOLOGÍA MOLECULAR SECCIÓN V GENOMA, PATOLOGÍA MOLECULAR Y TERAPIA GÉNICA 23 ANÁLISIS MOLECULAR DEL GENOMA 23.3 MANEJO DEL ADN 23.3.2 Transferencia de Southern y detección de fragmentos génicos (...)
Compartir