fundamentos pruebas bioquimicas

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Universidad de Guanajuato  
División de Ciencias Naturales y Exactas 
Lic. en Biología Experimental 
Laboratorio de Microbiología 
Práctica 11. Pruebas Bioquímicas 
Samantha Gudiño Vallejo 
 
 
 
Parte 1. Fundamentos de Pruebas Bioquímicas 
FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS: GLUCOSA, SACAROSA Y MANITOL 
En esta prueba se usa un medio sin carbohidratos agregados que se utiliza como base                             
para la adición de carbohidratos para determinar las reacciones de fermentación de los                         
microorganismos. Debe ser capaz de soportar el crecimiento de los organismos de                       
prueba. 
Se determina si la bacteria es capaz de fermentar un carbohidrato particular                       
(producción de ácidos acompañados o no de gases). Se aplica a bacterias con                         
metabolismo fermentador, ensayándose por separado con diferentes carbohidratos. La                 
producción de ácidos se pone de manifiesto con un indicador ácido-base y la de gases                             
con una campanita Durham (tubo cerrado por uno de sus extremos que se coloca                           
invertido en el medio de cultivo). 
Las bacterias que fermentan un carbohidrato son por lo general anaerobios                       
facultativos. Por medio del proceso de fermentación, un carbohidrato es degradado y                       
descompuesto en dos moléculas de carbono (Triosas) que son nuevamente degradas en                       
un número de compuestos de 1, 2, 3 y 4 carbonos. Los productos finales varían con                               
cada especie bacteriana y depende del sistema enzimático existente de la especie y las                           
condiciones del medio ambiente. 
  
 FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN MEDIO KLIGER  
Esta prueba es utilizada para la diferenciación de enterobacterias en base a la                         
fermentación de lactosa y glucosa, además de la formación de ácido sulfhídrico. El                         
medio se solidifica en forma inclinada permitiendo tener dos cámaras de crecimiento:                       
una aeróbica y la otra anaeróbica, el fondo del tubo. 
La fermentación de azúcares, como la glucosa, acidifica el medio lo cual se observa con                             
el cambio de color del rojo fenol (indicador ácido-base incorporado) a amarillo, pero                         
solo se observa en el fondo del tubo, mientras que la superficie cambia a rojo debido a                                 
que ahí no se presenta fermentación. Una vez consumida la glucosa, el microorganismo                         
comienza a metabolizar aminoácidos liberando amoníaco, lo cual alcaliniza el medio,                     
esto ocurre en la superficie. 
Si ocurre una fermentación de lactosa, el medio cambia a amarillo dado que su                           
concentración es mayor, la formación de ácido es suficiente para mantener el color                         
amarillo en todo el tubo. 
  
FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS: PRUEBAS DE ROJO DE METILO Y VOGES                   
PROSKAUER 
La prueba de Voges-Proskauer determina la capacidad de algunos organismos de                     
producir un producto final neutro, la acetoína a partir de la fermentación de la glucosa. 
Esta reacción se basa en la deteción de actoína como producto final neutro derivado del                             
metabolismo de la glucosa. Ésta es metabolizada en ácido pirúvico, intermediario clave                       
en la glucólisis. A partir del ácido pirúviso, una bacteria puede seguir muchas más vías.                             
La producción de acetoína (precursos de la producción de 2,3-butanediol) que es uno                         
de los ciclos para la degradación de la glucosa en las bacterias. La formación de                             
acetoína y butilenglicol es una vía alternativa del metabolismo del ácido pirúvico. Las                         
bacterias que utilizan esta vía producen solo pequeñas cantidades de ácidos mixtos que                         
son insuficientes para disminuir el pH del medio de rojo de metilo, lo bastante como                             
para producir un cambio de color. Por este motivo muchas de las especies de                           
Enterobacterias son VP positivas, con pocas excepciones son RM negativas y viceversa. 
El primer reactivo agregado a una alícuota incubada es el catalizador α-naftol porque                         
éste actúa como intensificador del color, lo que aumenta la sensibilidad de la reacción                           
sin pérdida de su especificidad. El KPH contribuye a la absorción de CO2, y reaccionará                             
con la peptona dando un color rosado salmón y con el agregado posterior deα-naftol                             
no habrá alteración del color.  
  
La prueba de rojo metilo se basa en el empleo de un indicador de pH para determinar la                                   
concentración de iones hidrógeno presentes cuando un organismo fermenta glucosa.                   
Las bacterias RM positivas producen ácidos estables manteniendo una alta                   
concentración de iones hidrógeno hasta alcanzar cierta concentración y entonces                   
detiene toda actividad. 
Los organismos RM negativos también producen ácidos pero tienen una menor                     
concentración de iones hidrógeno porque hay una reversión hacia la neutralidad debida                       
a la nueva degradación de los ácidos orgánicos en carbonatos. 
 
 
UTILIZACIÓN DE ÁCIDOS ORGÁNICOS​: 
El ​caldo malonato​ es el medio de cultivo líquido empleado para la prueba 
diagnóstica (prueba del malonato), utilizado para diferenciar algunos géneros de la 
familia Enterobacteriaceae. 
La prueba de malonato se basa principalmente en la capacidad que tienen algunos 
microorganismos de utilizar como única fuente de carbono al malonato de sodio y 
como fuente de nitrógeno al sulfato de amonio. Suele dar positiva en algunas 
especies de los géneros Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter. En tanto que, la 
mayoría de las especies de los géneros Escherichia, Salmonella, Shigella, 
Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus y Providencia, dan reacción 
negativa. La mayoría de las enterobacterias que no utilizan el malonato son capaces 
de crecer en este medio, tomando como nutrientes la dextrosa y el extracto de 
levadura. En este caso, cualquier intento de alcalinización cuando esta prueba es 
positiva se dice que el microorganismo utilizó el malonato y al sulfato de amonio 
como fuentes de carbono y nitrógeno respectivamente, sin hacer uso de los otros 
componentes. El medio se alcaliniza debido a la liberación del sodio y la 
consecuente formación de NaOH. En este sentido, el indicador de pH (azul de 
bromotimol) hace virar el color del medio de verde hacia azul cuando el pH es igual 
o mayor a 7,6. El azul puede ser claro o intenso (azul de Prusia). Finalmente, el 
cloruro de sodio mantiene la osmolaridad del medio y el agua es el diluente de 
todos los componentes por el uso de las peptonas será contrarrestada por la 
producción de ácidos generados por la ​fermentación​ de la dextrosa. Así mismo, los 
fosfatos dipotásico y monopotásico actúan como tampón manteniendo el pH a 6,7. 
Es por ello que, cuando la prueba es negativa, el caldo queda del mismo color 
original (verde). En raras ocasiones el medio podría acidificarse debido a la 
fermentación de la dextrosa; sin el uso de las peptonas y el indicador de pH haría 
virar el color del medio hacia amarillo. Para que ello ocurra el pH debe bajar a 6. 
Para el Agar citrato de Simmons 
Algunas bacterias tienen la capacidad de sobrevivir en ausencia de ​fermentación​ o 
producción de ácido láctico, necesitando conseguir energía a través de la utilización 
de otros sustratos. En esta prueba la única fuente de carbono ofrecida es el citrato. 
Las bacterias que son capaces de sobrevivirbajo estas condiciones metabolizan el 
citrato de forma rápida por una vía alterna a la tradicional, utilizando el ciclo del 
ácido tricarboxílico o el ciclo de fermentación del citrato. El catabolismo del citrato 
por parte de las bacterias comprende un mecanismo enzimático sin la intervención 
de la coenzima A. Esta enzima se conoce con el nombre de citricasa (citrato 
oxalacetato-liasa) o citrato desmolasa. La reacción requiere la presencia de un 
catión bivalente, que en ese caso es suministrado por el magnesio. 
https://www.lifeder.com/fermentacion/
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La reacción genera oxaloacetato y piruvato, que luego dan origen a ácidos 
orgánicos en medio de un pH alcalino formado por la utilización de la fuente de 
nitrógeno. Estos ácidos orgánicos son usados como fuente de carbono generando 
carbonatos y bicarbonatos, alcalinizando aun más el medio. 
 METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS: PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SULFHÍDRICO E INDOL​. 
Los elementos del medio posibilitan la determinación de tres actividades por las que 
se pueden diferencias las bacterias entéricas. El tiosulfato sódico y el sulfato ferroso 
de amonio son indicadores de producción de ácido sulfhídrico. El sulfato ferroso de 
amonio reacciona con gas de H2S para producir sulfuro ferroso, un precipitado de 
color negro. La peptona de caseína es rica en triptofano, que determinados 
microorganismos atacan, lo que da como resultado la producción de indol. El indol 
se detecta mediante la adición de reactivos químicos, posteriormente al periodo de 
incubación. La detección de motilidad es posible gracias a la naturaleza semisólida 
del medio. Un crecimiento que se propague hacia el exterior a partir de la línea 
central de inserción de la muestra indica que el organismo de prueba es móvil. 
 
 
METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS: PRODUCCIÓN DE AMONIACO E INDOL 
 
La prueba del indol es una ​prueba bioquímica​ realizada en ​especies​ ​bacterianas 
para determinar la habilidad del ​organismo​ de romper el ​indol​ del ​aminoácido 
triptófano​. Esta división ​molecular​ es lograda por una serie de ​enzimas 
intracelulares diferentes, un sistema que en conjunto se le llama con frecuencia 
triptofanasa. 
 
Se genera el indol por una ​desaminación​ reductiva del triptófano via la molécula 
intermediaria ácido indolpirúvico. Las triptofanasas catalizan la reacción de 
desaminación, durante el cual se remueve el grupo ​amino​ (NH2) de la molécula de 
triptófano. Los productos finales de la reacción son el indol, ​ácido pirúvico​, 
amoníaco​ (NH3) y ​energía​. Como ​coenzima​ de la reacción se requiere al ​fosfato de 
piridoxal​. 
 
 ​METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS: PRODUCCIÓN DE LISINA-DESCARBOXILASA 
 
Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido 
para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad. La descarboxilación es el 
proceso mediante el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas 
específicas son capaces de atacar a los aminoácidos en su grupo carboxilo, dando 
una amina o una diamina y anhídrido carbónico. La descomposición de los 
aminoácidos se produce anaeróbicamente. El proceso de descarboxilación es 
irreversible, no oxidativo y requiere una coenzima en común, el fosfato de 
piridoxal. 
 
El aminoácido L-lisina sufre la descarboxilación para dar cadaverina y CO2 por 
acción de la enzima específica lisina descarboxilasa. 
 
 
https://es.wikipedia.org/wiki/Prueba_bioqu%C3%ADmica
https://es.wikipedia.org/wiki/Especie
https://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria
https://es.wikipedia.org/wiki/Ser_vivo
https://es.wikipedia.org/wiki/Indol
https://es.wikipedia.org/wiki/Amino%C3%A1cido
https://es.wikipedia.org/wiki/Tript%C3%B3fano
https://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9cula
https://es.wikipedia.org/wiki/Enzima
https://es.wikipedia.org/wiki/Desaminaci%C3%B3n
https://es.wikipedia.org/wiki/Amino
https://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_pir%C3%BAvico
https://es.wikipedia.org/wiki/Amon%C3%ADaco
https://es.wikipedia.org/wiki/Energ%C3%ADa
https://es.wikipedia.org/wiki/Coenzima
https://es.wikipedia.org/wiki/Fosfato_de_piridoxal
https://es.wikipedia.org/wiki/Fosfato_de_piridoxal
 RESPIRACIÓN: REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS 
Esta prueba determina la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en 
nitritos o en nitrógeno libre. La reducción de nitrato en nitrito y en gas nitrógeno 
tiene lugar generalmente en condiciones anaerobias, en las cuales un organismo 
obtiene su oxígeno del nitrato. El oxígeno sirve como aceptor de hidrógeno. 
 
 
La reducción de nitrato en nitrito está indicada por la aparición de color cuando el 
nitrito reacciona con los dos reactivos. La reacción de color resultante se debe a la 
formación de un compuesto diazoico, p-sulfobenceno-azo-alfa.naftilamina. 
 
 
RESPIRACIÓN: PRUEBAS DE CITOCROMO OXIDASA Y CATALASA.  
es un método diagnóstico que evidencia la presencia del complejo enzimático 
denominado citocromo oxidasa c. Este sistema induce la transformación del 
citocromo reducido a oxidado, ya que capta el oxígeno y este a su vez actúa como 
último aceptor de electrones (H+) en la cadena respiratoria. 
 
En esta prueba utiliza sustancias que actúan como aceptores artificiales de 
electrones, sustituyendo los naturales dentro de la cadena de transporte de 
electrones. 
Principalmente se utilizan colorantes como el parafenilendiamina y el indofenol, que 
actúan como sustratos receptores y donadores de electrones artificiales. 
El parafenilendiamina es oxidado por el sistema del citocromo oxidasa c. El 
colorante en su forma reducida es incolora, pero en su forma oxidada es coloreado. 
Es así como se pone en evidencia la presencia del sistema citocromo oxidasa c; 
pues una reacción positiva generará una coloración lavanda o azul –púrpura 
dependiendo del reactivo utilizado. 
En cambio, si la última sustancia aceptora de electrones en la cadena respiratoria es 
diferente al oxígeno, la prueba de oxidasa dará negativa (no hay producción de 
color); este es el caso de los microorganismos anaerobios. 
Así mismo, si el citocromo utilizado por el microorganismo es diferente al citocromo 
oxidasa c, también dará la prueba negativa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Parte 2. Pruebas bioquímicas en ​Pseudomonas aeruginosa 
 
Prueba de fermentación de carbohidratos Cepa aislada 
 Glucosa Ácido - 
Gas - 
Durham Sacarosa Ácido - 
Gas - 
 Manitol Ácido - 
Gas - 
 
Kligler 
Glucosa - 
Gas - 
H2S - 
Alcalinización + 
MR (Rojo de Metilo) + 
VP (Voges Proskauer) + 
Prueba de utilización de ácidos orgánicos 
Citrato de Simmons + 
Malonato ++ 
Prueba metabolismo de aminoácidos 
 
SIM 
H ​2 ​S - 
Indol - 
movilidad + 
Caldo triptona Amoniaco + 
Indol - 
 
LIA 
Descarboxilación - 
+ 
+ 
Desaminación 
H ​2 ​S 
Respiración 
Reducción de nitratos a nitritos + 
Oxidasa + 
Catalasa +