Tinciones permanentes de parásitos

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PRACTICA #10 
 
TINCIONES PERMANENTES DE PARASITOS 
II. Parte 
 
OBJETIVO DE LA PRACTICA 
Que el alumno se familiarice con diferentes técnicas de tinción de parásitos para 
poder distinguirlos al microscopio y utilizarlas en diagnóstico. 
 
 
INTRODUCCION. 
En la mayoría de los casos los protozoarios intestinales se pueden observar 
bien con tinciones temporales, como es el caso de los exámenes directos con 
lugol, solución salina o Sudán, como se vió en prácticas anteriores. En algunas 
ocasiones es necesario teñir los parásitos en forma definitiva, para obtener 
preparaciones permanentes; otras veces estas tinciones son necesarias porque 
se necesita distinguir algunas de sus estructuras celulares, usando tinciones 
especiales permanentes. Algunos parásitos requieren tinciones especiales, para 
poder observarse. 
 
MATERIALES Y METODOS 
 
1. Tinción de Ziehl-Neelsen (ácido-resistente) Modificada : 
Esta técnica es útil en la identificación de ooquistes de coccidios como 
Cryptosporidium, Isospora, y Cyclospora, que son difíciles de detectar con 
colorantes rutinarios. Esta tincion de Ziehl-Neelsen Modificada no require el 
calentamiento de los reactivos al teñir. 
 
Especimen: 
Puede utilizarse el sedimento concentrado, de heces frescas o preservadas en 
formalina. 
 
Reactivos para la tinción: 
Se efectúan cuatro pasos en el proceso, con diferentes reactivos: 
Metanol Absoluto 
Alcohol Acido: 10 ml de acido Sulfurico + 90 ml de etanol Absoluto. Almacene a 
temperature ambiente. 
Carbol fuchsina 
Verde de Malaquita al 3% : disuelva 3 g de verde de malaquita en 100 ml de 
agua destilada. Almacene a temperatura ambiente. 
 
Procedimiento de la tinción : 
Preparar un frote con 1 a 2 gotas del especimen fecal sobre un portaobjetos y 
secar en una platina caliente a 60°C. Los frotes no deben quedar demasiado 
gruesos. 
Fijar con metanol absoluto durante 30 segundos. 
Teñir con carbol Fuchsina por un minuto. 
Lavar con agua destilada brevemente y escurrir. 
Decolorar con alcohol- ácido durante 2 minutos. Enjuagar con agua destilada y 
escurrir. 
Teñir con el colorante de contraste verde de malaquita durante 2 minutos. 
Lavar brevemente con agua destilada y escurra. 
Secar el portaobjetos sobre una platina caliente a 60 °C durante 5 minutos. 
Montar la preparación con un cobreobjetos usando un medio de montaje. 
Examinar 200 a 300 campos usando el objetivo seco fuerte 40× . 
Para confirmar la morfologia interna, use el objetivo de aceite de inmersión 
100x . 
 
2 . Tinción de Fenol- Auram ina 
Este colorante puede ser usado como una alternativa a la tinción modificada de 
Ziehl-Neelsen, para ooquistes de Cryptosporidium parvum. 
 
Metodo 
a. Haga frotes fecales como para Ziehl-Neelsen y fije con metanol por 1 min , 
escurra y deje secar. 
b. Tiña con fenol-auramina (Lemperts) por 10-15 minutos. 
b. Enjuague con agua de la llave 
c. Decolore con alcohol-ácido (como en el Ziehl-Neelsen) 
d. Enjuague con agua de la llave. 
e. Cubra el frotis con el colorante de contraste, permanganato de potasio 0.1% 
por 30 seg. 
f. Enjuague con agua de la llave y deje secar al aire libre. No aplique papel para 
secar. 
g. Observe los frotes con luz azul en el microscopio de fluorescencia a 10 X y a 
100 X . Los ooquistes de Cryptosporidium parvum aparecen de color Amarillo 
brillante sobre un fondo oscuro. 
 
 3 . Tinción Tr icrom o- m odif icada 
Frotes fecales delgados, en la detección de Microsporidios intestinales. 
 
Reactivos 
Cromotropo 2R (Gurr) 6.0 g 
Verde rapido 0.15 g 
Acido Fosfotungstico 0.7 g 
(use guantes al pesar) 
Mezcle los componentes en 3 mL de acido acetico glacial y deje reposar por 
30 minutos. 
Añada 100 mL de agua destilada. Mezcle bien. El acido acético no disuelve 
totalmente el colorante (es normal). 
 
Método. 
a. Suspenda las heces sin concentrar en formol de 10% (en proporcion 1:3) 
b. Extienda una pequeña gota de suspensión fecal y extiéndala en las 2/3 
partes de la superficie de un portaobjetos 
c. Seque y fije en metanol durante 5 minutos. 
a. Tina en Tricromo durante 90 minutos a temperatura ambiente o tina por 
 10 minutos a 50° C 
b. Enjuague en alcohol acido (4.5 mL de acido acetico glacial en 95.5 mL de 
etanol de 90% ) por 10 segundos 
c. Enjuague en etanol de 95 % para lavar el exceso de colorante 
d. Deshidrate en etanol de 95% por 5 minutos. 
e. Deshidrate con etanol absoluto 100% por 5 minutos. 
f. Aclare con xileno por 5-10 minutos. 
g. Mount en DPX mientras este humedo usando un cubreobjetos de 22x40 y 
examine a 100 X. 
 Las esporas de los microsporidios son muy pequeñas ( 1.0 x 0.5 µm), ovales y 
con frecuencia exhiben una estructura central como banda, flankeada en el otro 
lado con areas sin teñir. Las esporas se tiñen de rosa-rojo, contra un fondo 
verde oscuro. 
 
 
 
 
 
 
4 . Fijación de Nem atodos 
La mayoría de los Nematodos puede fijarse en alcohol 70° caliente o en alcohol 
acético (1 parte de ácido acético y 3 partes de alcohol 95°). Los Nematodos se 
almacenan en alcohol 70°. Se agregan unas pocas gotas de glicerina a fin de 
impedir la desecación en caso de evaporarse el alcohol durante ese tiempo. Los 
adultos y larvas de 2–3 mm o menos se fijan mejor usando una solución de 
ácido acético al 0,5%. Se utiliza una mezcla de 4% de formol y 1% o 0,5% de 
ácido acético para la fijación y almacenamiento. Los Nematodos se pueden 
aclarar en glicerina, alcoholfenol o en lactofenol. Luego, y antes de colocarlos 
nuevamente en la solución de preservación se lavan en alcohol 70°. 
Alcohol-
fenol: 
80 partes de cristales de fenol fundido y 
20 partes de alcohol absoluto 
 
20 partes de agua destilada, 
40 partes de glicerina, 
20 partes de ácido láctico y 
Lactofenol: 
20 partes de cristales de fenol fundido. 
 
5. Fijación de protozoarios 
Para la fijación de protozoos se pueden utilizar varios métodos, entre ellos el de 
líquido de Schaudinn: 
Esparza la muestra donde están contenidos los parásitos en una capa fina 
sobre el portaobjeto. Luego coloque el portaobjeto con el material hacia abajo en 
una jarra con líquido de Schaudinn por un período de 15 a 20 minutos, 
lavándolo entonces con etanol 70°. Luego transfiéralo a una solución de yodo- 
etanol 70° (la solución deberá tener color té fuerte). El yodo remueve el cloruro 
de mercurio. Manténgalo en dicha solución hasta que quede de color marrón. 
Entonces lávelo con alcohol 70° hasta su completa decoloración y guárdelo en 
un envase de portabojetos. Para prevenir que los portaobjetos se toquen entre 
sí, se colocan aros de papel grueso entre ellos para separarlos. El diámetro 
interior de estos aros deberá dejar libre el frotis. Finalmente, etiquete los 
portaobjetos y tíñalos con hematoxilina de hierro. 
RESULTADOS, DISCUSION Y CONCLUSIONES. 
Describa sus observaciones y resultados. 
Dibuje los organismos observados en su cuaderno de prácticas 
Que beneficios observo en cada una de las tecnicas desarrolladas 
 
 
Bibliografía 
Taghi-Kilani,R. and L. Sekla. 1987. Purification of Cryptosporidium oocysts and 
sporozoites by Cesium Chloride and Percoll discontinuos density gradient. J. 
Tropical Med. Hyg., 36: 505. 
 
DPDx – CDC. Diagnostic procedures for stool specimens. 2006. 
 
http://www.btinternet.com/~ukneqas.parasitologyscheme/index.html 
 
Diagnostic Automation , Inc.23961 Craftsman Road, Suite E/F 
Calabasas, CA 91302. Tel: 818-591-3030 , Fax: 818-591-8383