GuÃ_a de ProteÃ_nas 2023

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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES 
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA 
 
 
GUÍA DE DISCUSIÓN Y TRABAJOS PRÁCTICOS 
 
 
QUÍMICA BIOLÓGICA 
MÓIDULO PROTEÍNAS 
 
 
 
 1 
NORMAS BÁSICAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO 
 
HÁBITOS PERSONALES 
• Mantener en todo momento el guardapolvos puesto y abrochado. 
• No comer o beber en los laboratorios. 
• No utilizar calzado descubierto (ojotas, sandalias, etc.) 
• Se recomienda usar gafas de seguridad cuando se trabaje con productos químicos líquidos de 
cualquier tipo en ebullición. 
• No utilizar lentes de contacto en el laboratorio, ya que en caso de accidentes por 
salpicaduras de productos químicos o sus vapores, al pasar por detrás de las lentes, podrían 
provocar lesiones en el ojo antes de retirarlas. En estos casos se recomienda el uso de 
anteojos. 
 
MANIPULACIÓN EN EL LABORATORIO 
• Toda persona que manipule un producto químico, deberá tener conocimiento de sus 
características físico-químicas y toxicológicas. 
• Utilizar en todo momento gradillas y soportes. 
• No llevar tubos de ensayo ni productos en los bolsillos. 
• No calentar nunca un recipiente totalmente cerrado. Cuando se caliente, dirigir siempre la 
abertura en dirección contraria a uno mismo y a las demás personas cercanas. 
• No efectuar pipeteos con la boca. Se realizará con peras de goma para pipetas o pipetas de 
seguridad. 
• Asegurarse del enfriamiento de los materiales antes de aplicar directamente las manos para 
tomarlos. 
• Deberá mantenerse la limpieza y el orden en los laboratorios en todo momento. 
• Deberá ponerse especial cuidado en cerrar botellas y frascos inmediatamente después de su 
utilización. 
• No transportar frascos o recipientes tomados por la tapa o tapón. 
• Deberán mantenerse libres los espacios de trabajo, así como las zonas de paso y salida de los 
recintos. 
 
 
 
 
 
 2 
 
ACTUACIÓN EN CASO DE ACCIDENTE: 
Salpicaduras o derrames - En piel y ojos 
• Si un producto químico salpica a los ojos, lavarlos durante 15 minutos sin 
interrupción. Actuar con urgencia en menos de 10 segundos. No dirigir una corriente de alta 
presión directamente al ojo porque podría lesionarse. Es necesario mantener los ojos abiertos 
con ayuda de los dedos para el lavado debajo de los párpados. 
• Si el derrame se produce sobre la piel, de inmediato exponer la zona afectada al chorro 
de agua del grifo durante cinco o diez minutos. No intentar neutralizar. - En la ropa 
Debe quitarse rápidamente la ropa, lavándola, o colocarse bajo la ducha, según la magnitud de 
la impregnación. Si hay contacto con la piel, lavar la zona afectada. 
Cortes 
Se deberán lavar con abundante agua corriente durante diez minutos como mínimo. Si son 
pequeños y dejan de sangrar en poco tiempo, lavar con agua y jabón y taparlos con una venda 
o apósito adecuados. Si son grandes y no dejan de sangrar, se requiere asistencia médica 
inmediata. 
Inhalación 
Conducir a la persona afectada a un lugar con aire fresco. Al primer síntoma de dificultad 
respiratoria, iniciar la respiración artificial boca a boca. 
Tratar de identificar el vapor tóxico. 
Incendio 
Dar la alarma inmediatamente. Apagar los fuegos pequeños tapándolos sin utilizar agua. Si 
prende fuego la ropa: -Tenderse en el suelo y rodar sobre sí mismo para apagar las llamas. No 
correr ni intentar llegar a una ducha de emergencia salvo que esté muy cercana. Nunca utilizar 
extinguidores sobre una persona. Si se evacua el laboratorio, cerrar las puertas al salir. 
 
TELÉFONOS IMPORTANTES 
En todos los laboratorios debe haber un listado telefónico con los Centros de URGENCIA que 
enumeramos a continuación, el cual será de conocimiento general. 
SAME 107 
BOMBEROS 100 
SEGURIDAD INTERNA DE LA FACULTAD DE MEDICINA 
5950-9575/ 5950-9500 int 2050/ 2024 
 
 3 
PROTEÍNAS. PARTE I 
ESTRUCTURA Y SECUANCIACIÓN 
 
 
BIBLIOGRAFÍA 
1) Nelson DL, y Cox MM, “Lehninger, Principios de Bioquímica”; Ed. Omega SA 
Barcelona 6º edición, (2014). Capítulos 3 y 4. 
2) J. M. Berg, J. L. Tymoczko y L. Stryer, “Bioquímica” Ed. Reverté, 6º edición (2008), 
Capítulos 2 y 3. 
3) Videos de Proteínas del campus virutal. 
 
 GUÍA DE PROBLEMAS Y DISCUSIÓN 
1) Clasificación de aminoácidos. 
2) Niveles de organización de las proteínas: estructura primaria, secundaria, terciaria y 
cuaternaria. 
3) Características del enlace peptídico. 
4) Diferencias entre proteínas fibrosas y globulares. 
5) ¿En qué consiste la desnaturalización de una proteína? Descripción de agentes 
desnaturalizantes químicos, físicos y mecánicos. Diferencias entre medio desnaturalizante y 
medio disociante. 
6) Ruptura de puentes disulfuro. Concepto de accesibilidad de grupos químicos. 
7) Caracterización de la estructura proteica. 
8) Métodos para determinación de la masa molecular: 
a) Espectrometría de masa. 
b) Cromatografía de exclusión molecular. 
c) SDS-PAGE. 
d) Relación entre la masa molecular de una proteína y la cantidad de aminoácidos que la 
componen. 
9) Anfotericidad de proteínas. Determinación del punto isoeléctrico (pI). 
 4 
10) Procedimientos utilizados para obtener la estructura primaria de una proteína: 
a) Análisis de aminoácidos. 
b) Identificación de restos amino y carboxilo terminales. 
c) Detección de uniones de tipo no covalente. 
d) Hidrólisis parcial y separación de péptidos, secuenciación. 
e) Detección y asignación de enlaces disulfuro inter e intracatenarios. 
11) Microsecuenciación por espectrometría de masa (EM en tandem). 
12) Dada la estructura de la insulina, discutir los pasos requeridos para obtener la secuencia 
completa: 
 
 
Diseñe una estrategia de secuenciación, teniendo en cuenta que puede secuenciar hasta 20 
residuos por vez, y que cuenta con los reactivos del Anexo II. Indique qué tratamiento previo 
requiere la muestra para poder ser secuenciada, qué serie de pasos realizaría y qué 
información obtendría a partir de cada uno. 
* Nota: para referirse a los péptidos generados, hágalo por numeración en vez de por 
secuencia, indique solamente los residuos inicial y final de cada uno. 
13) Proteómica: breve descripción y aplicaciones. 
 
14) Análisis del trabajo científico “Complete amino acid sequence of ananain and a 
comparison with stem bromelain and other plant cysteine proteases”. Biochem. J. (1997) 327, 
199-202. 
a. ¿Por cuántos residuos de aminoácidos está formada la Ananaína? ¿Qué tipo de proteasa es? 
¿Cómo pretendían inactivarla en una primera aproximación y cómo lo lograron? ¿Por qué fue 
preciso inactivarla? 
 5 
b. ¿Qué características presentó la digestión con bromuro de cianógeno? ¿Cuántos sitios de 
corte había en la proteína para el bromuro de cianógeno? Según lo que puede observarse en la 
Figura 1, ¿pudieron cubrir la secuencia completa de la proteína con el clivaje químico? ¿Por 
qué? 
c. Describa la estrategia de clivaje utilizada en el artículo. Mencione la especificidad de cada 
tratamiento. 
d. Según lo que se detalla en la sección Materiales y métodos ¿cómo realizaron la 
secuenciación? ¿En qué posición se encontró la Cys libre? ¿Cómo fue tratada la proteína para 
poder detectarla? ¿Cuál es la importancia de esa Cys? 
e. ¿Cómo determinaron la masa molecular de la proteasa? Tipo de metodología empleada. 
f. ¿Cómo confirmaron la secuencia de la Ananaína (dos estrategias)? 
g. ¿Qué diferencias encontraron al comparar la secuencia de la proteasa aislada y otra 
previamente descripta (bromelaína)? ¿Qué implicancias tendría en la función de la proteasa? 
 
15) Para caracterizar la estructura de una proteína de 400 aminoácidos, se realizaron los 
siguientes ensayos: 
a) SDS-PAGE sin 2-mercaptoetanol: 1 banda de 22.000 Da y una banda de 11.000 Da 
b) SDS-PAGE con 2-mercaptoetanol: 1 banda de 11.000 Da. 
 
Según los resultados obtenidos, indique: 
i. Si la proteína presentaestructura cuaternaria. 
Si posee puentes S-S intercatenarios 
iii. ¿cómo evaluaría la presencia de Cys con SH libres? 
 
16) Según los resultados experimentales que siguen, indique: 
a. el número de cadenas en cada proteína, el número de -SH libres y la cantidad de puentes S-
S, señalando si los mismos son accesibles o no. 
b. ¿qué resultado se hubiera observado si se hacía una reducción con DTT en presencia de 
urea 6 M y posterior bloqueo con IAA 
 
 6 
Nota: Se aplica el mismo protocolo experimental a dos proteínas diferentes (I y II): 
 
PROCEDIMIENTO 
RESULTADOS 
(Proteína I) 
RESULTADOS 
(Proteína II) 
1) Cromatografía de exclusión molecular 
 a) Medio no disociante 
 b) Medio disociante 
 
PM 46.000 
PM 46.000 
 
PM 46.000 
PM 23.000 
2) Bloqueo con IAA 
 Posterior análisis de aminoácidos. 
2 CMCys/moléc. 2 CMCys/moléc. 
3) Bloqueo con IAA en urea 
 Posterior análisis de aminoácidos. 
4 CMCys/moléc. 2 CMCys/moléc. 
4) Oxidación perfórmica 
 a) Análisis de aminoácidos 
 b) CEM en medio disociante 
 c) Isoelectroenfoque 
 
10 Ác. cisteico/moléc. 
PM 23.000 (un pico) 
una sola banda 
 
10 Ác. cisteico/moléc. 
PM 23.000 (un pico) 
una sola banda 
5) Reducción con 2-ME y bloqueo con 
IAA 
 a) Análisis de aminoácidos 
 b) CEM en medio disociante 
 
4 CMCys/moléc 
un pico, PM 23.000 
 
2 CMCys/moléc 
un pico, PM 23.000 
 
 Abreviaturas: CMCys: carboximetilcisteína; DTT: ditiotreitol; IA: ácido iodoacético; IAA: 
iodoacetamida; 2-ME: 2-mercaptoetanol; TNB: tionitrobenzoato 
 
17) Con una solución de una proteína (concentración 3 mg/ml) se realizan los siguientes 
procedimientos experimentales: 
 
 
 
1) Cromatografía de exclusión molecular (CEM) 
en condiciones disociantes y no disociantes 1 pico PM 37.000 
 
PROCEDIMIENTO RESULTADOS 
 7 
2) Proteína + IAA/ urea. 
 Análisis de aminoácidos 
 
0 CMCys/molécula 
 
3) 2,5 ml de solución proteica + 2-ME/ urea 
9 M. Luego se agrega IAA 
 
 
0,81 moles CMCys* 
4) Proteína + 2-ME 
a) SDS-PAGE 
 
 
2 bandas: PM 10.000 y PM 27.000 
 
5) 2 ml de sol. de prot. + DTT + IAA. 
 Análisis de aminoácidos 
 CEM 
 
6) Oxidación perfórmica e isoelectroenfoque 
 
0,324 moles de CMCys 
1 pico PM 37.000 
 
2 bandas 
 
 
 
(*) Nota: Por cada mol de grupo -SH se libera 1 mol de CMCys 
 
Calcule: a) Número de cadenas de la proteína. 
b) Número de grupos -SH accesibles e inaccesibles / molécula de proteína. 
c) Número de puentes -S-S- accesibles e inaccesibles, inter y/o intracatenarios por 
molécula de proteína. 
d) Realice un esquema de la probable estructura de la proteína estudiada. 
 
 
 
 8 
PROBLEMAS ADICIONALES 
 
*Nota: En los ejercicios encontrarán digestiones proteolíticas sobre péptidos cortos para 
obtener la secuencia de aminoácidos. Si bien estos podrían ser secuenciados por degradación 
de Edman en un solo paso, se incluyen con fines didácticos. 
 
1) Un grupo de investigadores aisló una proteína de tejido hepático. Para caracterizar la 
proteína, en primer lugar realizaron un SDS-PAGE y obtuvieron una banda de PM 55.000 Da. 
a) ¿Cuántos aminoácidos tendrá la proteína obtenida? 
b) ¿Qué aproximación pueden realizar para saber de qué proteína se trata? ¿Es necesario 
obtener la secuencia completa? 
c) Si la proteína no corresponde a ninguna descripta hasta el momento ¿Cómo deberá 
proceder para obtener la secuencia de la proteína encontrada? 
d) ¿Cómo demostraría la presencia de estructura cuaternaria en la proteína nueva? 
e) ¿Cómo identificaría la presencia de puentes disulfuro intercatenarios? 
 
Respuesta: 
a) 500 aminoácidos. 
b) Si se desea averiguar si la banda obtenida corresponde a una proteína conocida, no es 
necesario secuenciar completamente la proteína. Se podría comenzar probando la digestión 
con tripsina, separación y secuenciación de los péptidos obtenidos. Luego, se compararían 
las secuencias en una base de datos (por ej. Swiss Prot). 
c) Si los péptidos ingresados en una base de datos no coincide con alguna proteína 
previamente ingresada, se deberá proceder a la secuenciación completa. Para ello, se 
realizarán proteólisis específicas, ordenamiento de los fragmentos y superposición. 
d) Se podría analizar el PM de la proteína en condiciones nativas y en condiciones 
desnaturalizantes. 
 9 
e) Los puentes disulfuro intercatenarios se pueden poner en evidencia al reducir y bloquear la 
proteína (en condiciones desnaturalizantes para acceder a todos). Luego, se comparan los 
valores de PM obtenidos con el PM de la proteína nativa. 
 
2) Indique el pI de los siguientes péptidos. ¿Cuál será la carga neta a pH 9? 
a. Gly-Lys-Asn-Ala-Trp-Val 
b. Gln-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg-Phe-Asp-Ala 
 
Respuesta: 
a. pI 11; carga neta a pH 9= +1 
b. pI= 4; carga neta a pH 9= -1 
 
3) Con una solución de una proteína (concentración 3 mg/ml) se realizan los siguientes 
procedimientos experimentales: 
 
PROCEDIMIENTO RESULTADOS 
 
1) Cromatografía de exclusión molecular (CEM) en 
condiciones disociantes y no disociantes 
 
 
 
1 pico PM 37.000 
2) Proteína + IAA/ urea. 
 Análisis de aminoácidos 
 
 
0 CMCys/molécula 
3) Proteína + 2-ME/ urea 9 M. 
Luego se agrega IAA 
 
 
4 CMCys/molécula 
4) Proteína + 2-ME 
a) SDS-PAGE 
 
2 bandas: PM 10.000 y PM 27.000 
 
5) Proteína + DTT + IAA. 
 Análisis de aminoácidos 
 CEM 
 
6) Oxidación perfórmica e isoelectroenfoque 
 
 
2 CMCys/molécula 
1 pico PM 37.000 
 
2 bandas 
 
 
 
 
 10 
Calcule: a) Número de cadenas de la proteína. 
b) Número de grupos -SH accesibles e inaccesibles / molécula de proteína. 
c) Número de puentes -S-S- accesibles e inaccesibles, inter y/o intracatenarios por 
molécula de proteína. 
d) Realice un esquema de la probable estructura de la proteína estudiada. 
 
Respuesta: 
 
 
 
 
4) Observe la siguiente secuencia e indique qué resultado obtendría luego de una hidrólisis 
ácida y análisis de aminoácidos. 
Arg Pro Asp Phe Cys Leu Glu Trp Pro Pro Gln Tyr Thr Gly Pro Cys Lys Ala Asn Ile Ile Gly 
 
Respuesta: 
Arg (1) Pro (4) Asp (2) Phe (1) Cys (2) Leu (1) Glu (2) NH4
+
 (2) Tyr (1) Gly (2) Lys (1) Ala 
(1) Ile (2) Thr (1) 
 
5) El análisis de aminoácidos en medio ácido y alcalino de un heptapéptido indicó que su 
composición era la siguiente: 
Asp; 2 Leu; Lys; Met; Tyr; Trp; NH4
+
 
Se efectuaron además los siguientes tratamientos: 
-Digestión con tripsina: no se observó ningún efecto. 
-Reacción de Edman: Tyr. 
 11 
-Digestión con quimotripsina: se obtuvieron varios productos incluyendo un dipéptido y un 
tetrapéptido; la composición en aminoácidos del tetrapéptido reveló la presencia de Lys, Met 
y Leu. 
-Reacción con bromuro de cianógeno: un tetrapéptido y un tripéptido. 
¿Cuál es la secuencia del heptapéptido? Justifique sus respuestas. 
 
Respuesta: Tyr-Asn-Trp-Met-Leu-Leu-Lys 
 
6) El análisis de aminoácidos de un decapéptido indicó la presencia de: 
Asp, Glu, Tyr, Arg, Met, Pro, 2 Lys, Ser y Phe y no se detectó la presencia de NH4
+
. Se 
realizaron además los siguientes procedimientos, a partir de los cuales se obtuvieron los 
respectivos resultados: 
-Tratamiento con carboxipeptidasa: Pro. 
-Reacción con reactivo de Sanger: Ser. 
-Tratamiento con tripsina: dos tetrapéptidos y Lys libre. 
-Tratamiento con clortripaína (endopeptidasa Arg (C)): un tetrapéptido y un hexapéptido. 
-BrCN: se obtuvo un octapéptido y un dipéptido; análisis en aminoácidos del dipéptido: Pro y 
Asp. 
-Tratamiento con quimotripsina: dos tripéptidos y un tetrapéptido; análisis de aminoácidos de 
uno de los tripéptidos: Glu, Tyr y Ser. 
¿Cuál es la secuencia del péptido? Justifique surespuesta. 
 
Respuesta: Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asp-Pro. 
 
 
 
 
 12 
ANEXO I 
 CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA DE AMONOÁCIDOS 
 
Aminoácido Abreviatura Símbolo 
 No polares, alifáticos 
Glicina 
 
Gly 
 
G 
Alanina Ala A 
Prolina Pro P 
Valina Val V 
Leucina Leu L 
Isoleucina Ile I 
Metionina 
 
Met 
 
M 
 
 Aromáticos Fenilalanina 
 
Phe 
 
F 
Tirosina Tyr Y 
Triptofano 
 
Trp 
 
W 
 
 Polares sin carga 
Serina 
 
Ser 
 
S 
Treonina Thr T 
Cisteína Cys C 
Asparragina Asn N 
Glutamina 
 
Gln 
 
Q 
 
 Polares con carga positiva 
Lisina 
 
Lys 
 
K 
Histidina His H 
Arginina 
 
Arg 
 
R 
 
 Polares con carga negativa 
Ácido Aspártico 
 
Asp 
 
D 
Ácido Glutámico 
 
Glu E 
 
 13 
ANEXO II 
 
ESPECIFICIDAD DE ALGUNOS MÉTODOS DE FRAGMENTACIÓN DE LA 
CADENA POLIPEPTÍDICA 
 
 
Tratamiento Sitios de clivaje 
Tripsina Lys, Arg (C) 
Proteasa (Submaxillarus) Arg (C) 
Quimotripsina Phe, Trp, Tyr (C) 
Proteasa V8 (S. Aureus) Asp, Glu (C) 
Proteasa Asp N Asp, Glu (N) 
Pepsina Phe, Trp, Tyr (N) 
Endoproteinasa Lys C Lys (C) 
Trombina (C-terminal Arg = R) Arg (C) 
Bromuro de cianógeno Met (C) 
 
 
 
 14 
PROTEÍNAS. PARTE II 
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS 
 
ESPECTROFOTOMETRÍA 
Ley de Lambert y Beer: Cuando un haz de luz monocromática atraviesa una solución, la 
intensidad de la luz transmitida disminuye exponencialmente a medida que aumenta 
aritméticamente el espesor de la capa de solución atravesada. 
Siendo: 
Io = intensidad de la luz incidente (es decir, la luz que llega a la solución). 
I = intensidad de la luz transmitida (o sea, la luz que sale de la solución). 
c = concentración de la solución. 
b = espesor del absorbente. 
T = I/Io = Transmitancia de la solución. 
100 T = T% = porcentaje de transmitancia de la solución. 
A = Absorbancia o Densidad óptica de la solución 
 
A = log 
I
I
0 = log
1
T
 = - log T 
Por lo tanto: 
T = 
I
I
kbc
0
10  
A = - log T = kbc 
La constante k se denomina absortividad o coeficiente de extinción (). Si la concentración de 
la solución se expresa en moles/l,  será el coeficiente de extinción molar. Si la concentración 
se expresa en g/ml,  es el coeficiente de extinción específico. 
 
La absortividad depende de: 
 15 
 la naturaleza de la especie química absorbente, o sea que es característica de una 
combinación particular de soluto y disolvente. 
 la longitud de onda de la radiación incidente. 
 
La temperatura influye sólo en forma secundaria sobre el valor de k, a menos que 
varíe en un rango demasiado amplio. La absortividad es independiente de la concentración del 
soluto, del espesor de la solución absorbente y de la intensidad de la radiación luminosa. 
 
Factores que provocan desviaciones a la ley de Lambert-Beer 
La representación gráfica de la absorbancia de una solución en función de su 
concentración es una línea recta cuando se trabaja con soluciones diluidas; a mayores 
concentraciones la curva se desvía de la recta hacia el eje de las ordenadas (desviaciones 
positivas) o hacia el eje de las abscisas (desviaciones negativas). Los factores más 
importantes que provocan estas desviaciones son: 
1) Monocromaticidad. La ley de Lambert-Beer es válida sólo para luz monocromática. 
Cuando se usa un filtro como monocromador (caso de los fotocolorímetros), se selecciona un 
rango relativamente amplio de longitudes de onda y, por lo tanto, se pueden encontrar 
desviaciones aún en soluciones diluidas. 
En un espectrofotómetro, el prisma o la red de difracción producen espectros 
continuos de los cuales se selecciona un pequeño intervalo espectral mediante una rendija 
variable. Cuanto menor sea el rango de longitudes de onda seleccionadas, más 
“monocromática” será la luz incidente. 
2) Fluorescencia. En un proceso normal de absorción, las especies absorbentes consumen 
energía radiante y son llevadas a un estado excitado. Cuando estas especies vuelven a su 
estado basal, la energía absorbida se disipa como calor. En algunos casos, sin embargo, la 
energía absorbida o parte de ella es emitida como luz. Si el fototubo es sensible a la longitud 
de onda de la radiación emitida por el fenómeno de fluorescencia, se producirán desviaciones 
negativas de la ley. 
 16 
3) Partículas en suspensión. Provocan dispersión de la luz incidente y, por lo tanto, 
desviaciones positivas de la ley. 
4) Cambios en el grado de solvatación, asociación, disociación o de ionización cuando varía 
la concentración de la especie química absorbente. 
5) Temperatura. Si bien la absortividad es independiente de la temperatura (en el rango de 
trabajo de laboratorio), un aumento importante de la misma provoca el corrimiento del 
espectro de absorción a longitudes de onda mayores. Además, el calor puede concentrar la 
solución por la evaporación del solvente o provocar el desprendimiento de aire absorbido en 
forma de burbujas; las burbujas adheridas a las paredes de la celda interfieren en el paso de la 
luz y producen alteración de los valores de absorbancia. 
 
Curva de calibración 
Si se conoce el coeficiente de extinción (molar o específico) de una sustancia, y se 
determina la absorbancia de la solución, se puede determinar su concentración según la ley de 
Lambert y Beer. Sin embargo, este procedimiento es válido sólo cuando se trabaja con luz 
monocromática, por ejemplo cuando se determina la concentración de una proteína en 280 
nm. 
En las mediciones basadas en reacciones colorimétricas es imprescindible realizar 
una curva de calibración utilizando un patrón de concentración conocida. Se determina la 
absorbancia de diferentes diluciones de la solución patrón y se grafica la absorbancia (A) en 
función de la cantidad de soluto, siempre que el volumen final de la reacción se mantenga 
constante. El valor de A de la muestra problema se interpola en la curva de calibración y se 
calcula su concentración. El blanco de reacción se prepara del mismo modo que la muestra, 
pero omitiendo el agregado de la sustancia en estudio. 
Para el trazado de la recta de una curva de calibración se puede aplicar un método 
estadístico, tal como la regresión lineal, que consiste en estimar la pendiente y la ordenada al 
origen de dicha recta por el método de cuadrados mínimos. Procedimiento: sobre un par de 
ejes (x,y) se marcan todos los puntos experimentales, obteniéndose así el “diagrama de 
dispersión”. 
 17 
umoles X
0,0 0,2 0,4 0,6
A
b
s
o
rb
a
n
c
ia
0,0
0,20
0,40
0,60
0,80
umoles X
0,0 0,2 0,4 0,6
0,0
0,20
0,40
0,60
0,80
 
 Absorbancias leídas contra Absorbancias leídas contra 
 blanco de agua blanco de reactivos 
 
 Cuando las absorbancias son leídas contra blanco de agua, el valor de absorbancia del 
blanco de reactivos se grafica (es la ordenada al origen) y el par de valores (x,y) 
correspondiente al mismo se incluye en el cálculo de la pendiente y la ordenada al origen de 
la recta. 
 Una vez realizado el diagrama de dispersión, se efectúa el cálculo de la pendiente () y la 
ordenada al origen () de la recta por el método de cuadrados míninos con los valores de los 
puntos experimentales que cumplan con la linealidad. 
 Luego se traza la recta según la pendiente y la ordenada al origen estimadas. Es la recta que 
mejor ajusta todos los puntos. 
umoles X
0,0 0,2 0,4 0,6
A
b
s
o
rb
a
n
c
ia
0,0
0,20
0,40
0,60
0,80
Y = 1,15 X + 0,034
umoles X
0,0 0,2 0,4 0,6
0,0
0,20
0,40
0,60
0,80
Y = 1,23 X
 
 Absorbancias leídas contra Absorbancias leídas contra 
 blanco deagua blanco de reactivos 
 18 
 
 Una vez hallada la recta de cuadrados mínimos se puede utilizar para interpolar en ella la 
absorbancia de la muestra problema y así poder determinar la concentración de la misma. 
 Abs =  x +  x = moles, mg, concentración 
 
La ecuación estimada sólo es válida para el cálculo de concentraciones de muestras problemas 
si la absorbancia de las mismas está dentro del rango de absorbancias que cumplen con la 
linealidad. 
 
UNIDADES DE MASA Y CONCENTRACIÓN 
Unidades de masa: 
gramo (g) 
miligramo (mg) , 1 mg = 10-3 g 
microgramo(µg) , 1 µg = 10-6 g 
nanogramo (ng) , 1 ng = 10-9 g 
picogramo (pg) , 1 pg = 10-12 g 
 
Concentración: masa o peso de un soluto por unidad de volumen de solución. 
Unidades: 
g / l 
% P/V = masa en gramos de un soluto contenida en 100 ml de solución. 
% P/P = masa en gramos de un soluto contenida en 100 g de solución. 
MOLAR (M): 1 M = 1 mol / l = 1 mmol / ml. 
MILIMOLAR (mM): 1 mM = 1 mmol / l = 1 µmol / ml = 10-3 M 
MICROMOLAR (µM): 1 µM = 1 µmol / l = 1 nmol / ml = 10-6 M 
NANOMOLAR (nM): 1 nM = 1 nmol / l = 1 pmol / ml = 10-9 M 
 19 
Ejercicio de repaso 
 
Indicar si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas: 
 
1) La unidad de concentración µmol/ml es equivalente a µM 
2) La unidad de concentración µg/ml equivale a µM 
3) La unidad µM es igual a µmol 
4) µmol es unidad de concentración 
5) 1 µg equivale a 1.10
6
 g 
6) 1 µg equivale a 1.10
-3
 mg 
7) 1 ng equivale a 1.10
9
 mg 
 
Seleccione la respuesta correcta: 
 
La absortividad depende de: 
a. La naturaleza de la especie química absorbente únicamente 
b. de la concentración de soluto 
c. La longitud de onda de la radiación incidente únicamente 
d. de la sustancia que absorbe y de la longitud de onda utilizada 
 
 20 
GUÍA DE DISCUSIÓN Y PROBLEMAS 
1) Ley de Lambert-Beer. Aplicación a la determinación de la concentración de biomoléculas. 
 
2) Métodos de determinación del contenido proteico: directos (medición de la absorbancia en 
220 nm o 280 nm) e indirectos (colorimétricos). Fundamentos. 
 
3) Para determinar la concentración de una proteína purificada de hígado se realizó la lectura 
de la Absorbancia en 280 nm de la muestra diluida 1/3 y se obtuvo la siguiente información: 
Abs 280 nm = 0,142 
 280 nm proteína hepática = 39,2 x 10
3
 M
-1
 cm
-1
 
Paso de luz del espectrofotómetro: 1 cm 
PM: 90.000 
a. Calcule la concentración en M, µM y mg/ml. 
b. ¿Podría utilizar un método directo para determinar la concentración de proteínas en un 
homogenato de hígado? ¿Con qué finalidad se coloca un detector de absorbancia 280 nm a la 
salida de una columna cromatográfica? 
 
4) Métodos colorimétricos: Biuret, Lowry, Bradford, Ácido bicinconínico. Uso de solución 
patrón: seroalbúmina bovina (BSA). Equivalencia en masa entre la BSA y la muestra a dosar. 
 
5) Para determinar la concentración de proteínas de dos muestras se realizó el método de 
Biuret. La proteína seroalbúmina bovina se utilizó como patrón. El protocolo empleado fue el 
siguiente: 
 
 
 
 
 
 21 
Tubo 
(nº) 
Solución 
patrón 
1 mg/ml 
(ml) 
Muestras 
 
(ml) 
H2O 
 
(ml) 
Reactivo de 
Biuret 
(ml) 
Abs 1 
 540 nm 
Abs 2 
 540 nm 
1-2 - - 1,0 4,0 0,107 0,1 
3-4 0,2 - 0,8 4,0 0,152 0,143 
5-6 0,4 - 0,6 4,0 0,21 0,19 
7-8 0,6 - 0,4 4,0 0,244 0,258 
9-10 0,8 - 0,2 4,0 0,3 0,29 
11-12 1,0 - 4,0 0,302 0,31 
13-14 0,8 - 4,0 0,263 0,270 
15-16 0,5 0,5 4,0 0,180 0,175 
 
Muestra 1 (tubos 13 y 14): Ovoalbúmina 
Muestra 2 (tubos 15 y 16): Homogenato de hígado de rata (dil 1/5) 
 
a. Identifique el conjunto de tubos que constituyen la curva de calibración. 
b. ¿Cómo son los volúmenes finales en todos los tubos del protocolo? 
c. Grafique la curva de calibración representando la absorbancia en función de la 
concentración de BSA. 
d. Analice la distribución de los puntos experimentales y realice un ajuste lineal. 
e. Calcule la concentración de la muestra 1 en mg/ml. 
f. ¿Cómo procedería si la Absorbancia de la muestra fuera 0,320? 
g. Realice los cálculos para obtener la concentración a partir de la ecuación de la recta 
correspondiente a la calibración realizada como Abs en función de la masa. 
¿Qué condición del diseño del experimento le permite hacer esta simplificación? 
h. ¿Cuál de las dos maneras de graficar y procesar los datos considera más ventajosa (menor 
número de cálculos) para obtener el valor de la concentración de la muestra original? 
i. Indique la concentración de la muestra 2. ¿Por qué es posible obtener la concentración de 
una mezcla de proteínas como es el homogenato de hígado? 
 22 
PROBLEMAS ADICIONALES 
1) Para determinar la concentración de proteínas de una muestra de lisado total de hígado de 
rata se realizó la cuantificación por el método de Bradford. Se empleó el siguiente protocolo 
experimental: 
 
H2O 
 
(ml) 
BSA 
1,5 mg/ml 
(ml) 
Muestra 
(ml) 
Reactivo 
Bradford 
(ml) 
Abs 1 595 nm Abs 2 595 nm 
2,0 - - 3,0 0,028 0,033 
1,5 0,5 - 3,0 0,065 0,064 
1,0 1,0 - 3,0 0,089 0,087 
0,5 1,5 - 3,0 0,128 0,130 
_ 2,0 - 3,0 0,183 0,152 
1,5 - 0,5 3,0 0,097 0,100 
 
a. ¿Cómo son los volúmenes finales de cada uno de los tubos del protocolo de trabajo? 
b. ¿Podría graficar la Absorbancia en función de la masa y/o de la concentración? 
c. Represente los puntos que corresponden a la curva de calibración como pares ordenados 
independientes. ¿Eliminaría algún valor para mejorar el R
2
 de la ecuación de la recta? 
d. Calcule la concentración de proteínas en mg/ml. 
 
Respuestas: 
a. Los volúmenes finales en todos los tubos son iguales. 
b. Podría graficar la curva de calibración de ambas maneras. 
c. Si se elimina el valor de absorbancia de 0.183 se logra obtener mejor ajuste de los puntos 
que conforman la ecuación de la recta (R
2
= 0,9908). 
d. 3,27 mg/ml. 
 
2) Para obtener la concentración de la proteína A luego de un proceso de purificación se 
realizó la lectura de la absorbancia en 280 nm de una muestra diluida de la siguiente manera: 
0,2 ml de muestra + 0,8 ml H2O. 
a) Indique el valor de la concentración de proteína en mg/ml. 
 23 
b) ¿Qué consideraciones se deben tener en cuenta al elegir este método de cuantificación? 
c) ¿Cuál será el valor de absorbancia que se obtendría al realizar la reacción colorimétrica de 
Biuret si la muestra se diluye al 1/2 y se emplean 0,3 ml para su dosaje (curva de calibración: 
Abs540nm = 0,208 mg
-1
 x + 0,035) 
Datos: 
Abs 280 nm= 0,327 
 280 nm proteína A= 26 x 10
3
 M
-1
 cm
-1
 
Paso de luz del espectrofotómetro: 1 cm 
PM=100.000 
 
Respuestas: 
a) 6,29 mg/ml 
b) Se debe tener en cuenta que la proteína presentes aminoácidos aromáticos, tales como Trp 
y en menor medida, Tyr. 
c) Abs545nm= 0,231 
 
3) Se desea determinar la concentración de una proteína en una muestra utilizando un método 
colorimétrico. Se utiliza como patrón una solución de BSA 2 mg/ml. 
 
El protocolo experimental y los resultados obtenidos son los siguientes: 
 
Tubo Nº Solución 
patrón 
 Muestra Agua Rvo. de color Absorbancia 
en 540 nm 
 (µl) (µl) (ml) (ml) 
1 0 -- 1,00 1,00 0,040 
2 50 -- 0,95 1,00 0,110 
3 100 -- 0,90 1,00 0,127 
4 150 -- 0,85 1,00 0,200 
5 200 -- 0,80 1,00 0,239 
6 300 -- 0,70 1,00 0,341 
7 400 -- 0,60 1,00 0,435 
 24 
8 500 -- 0,50 1,00 0,525 
9 600 -- 0,40 1,00 0,590 
10 700 -- 0,30 1,00 0,622 
11 -- 100 0,90 1,00 0,291 
12 -- 100 0,90 1,00 0,285 
 
a. ¿Cuál es la concentración límite para la aplicabilidad de la ley de Lambert-Beer en este 
caso particular? 
b. Si en el protocolo experimental se variasen solamente los volúmenes de agua, tal que en 
cada caso se cumpliese que: Vpatrón (o muestra) + Vagua = 0,5 ml, 
¿hasta qué tubo esperaría que se cumpla la linealidad? 
c. Calculela concentración de la muestra. ¿Por qué se realiza la determinación por duplicado? 
d. Siguiendo el protocolo precedente para la curva de calibración, ¿qué volúmenes de las 
siguientes muestras utilizaría para realizar una cuantificación correcta de su concentración?: 
i. una solución que contiene X en concentración cercana a 10 µg/µl; 
ii. una solución que contiene alrededor de 2 g/l de X; 
iii. una solución que contiene X en concentración cercana a 5 x 102 µM (PMX=100); 
Respuestas: 
a. 1,2 mg/ml (independiente del volumen de reactivo usado) 
b. Hasta el tubo 6 
c. 5,07 mg/ml 
d.i. Hasta 0,12 ml de X 
 ii. Hasta 0,6 ml de X 
 iii. 1 ml 
 25 
TRABAJO PRÁCTICO N° 1 
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS 
 
Objetivo: Determinar la concentración de una solución de ovoalbúmina por un método 
colorimétrico (parte A) y espectrofotométrico (parte B). Medir la concentración proteica de 
un homogenato de hígado de rata mediante el método colorimétrico de Biuret. En primer 
lugar, establecer cuidadosamente el protocolo de trabajo. 
 
A) Se aplicará la reacción colorimétrica de Biuret (A.G. Gornall y col., J. Biol. Chem. 177: 
751, 1949). La misma se basa en la reacción de iones Cu
2+
 en medio alcalino con compuestos 
que poseen enlaces peptídicos o amida consecutivos o separados por un átomo de carbono 
intermedio. Se obtiene un complejo de color purpúreo, cuya estructura no ha sido aún 
definida (Figura 1). Esta técnica simple se aplica frecuentemente para determinar la 
concentración de soluciones de péptidos (a partir de tripéptidos en adelante) y proteínas. 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. La solución alcalina de CuSO4 del reactivo de Biuret reacciona con moléculas que 
contienen dos o más enlaces peptídicos consecutivos formando un compuesto color púrpura. 
 
B) Se comparará el resultado obtenido por el método de Biuret con el determinado por 
medida de absorbancia en 280 nm. La absorbancia en esta longitud de onda se debe a los 
aminoácidos aromáticos triptofano y tirosina que componen las proteínas. 
 
 Se empleará como proteína modelo la ovoalbúmina, principal proteína de la clara de 
huevo, cuya función biológica es la nutrición y protección del embrión. La ovoalbúmina se 
 26 
sintetiza en el oviducto y constituye aproximadamente el 54% del peso de la clara seca; es 
una glicoproteína fosforilada de PM 42.700 que pertenece al tipo de proteínas globulares y 
posee un puente disulfuro intracatenario y 4 grupos -SH libres (Mc Reynolds L y col., Nature, 
273:723, 1978). 
 El homogenato de hígado de rata se obtuvo disgregando mecánicamente el tejido en 
una relación 100 mg de hígado en 1 ml de buffer de lisis (Hepes 100 mM. Tritón X-100 1% 
v/v, EDTA 10 mM, FNa 100 mM, PMSF 2 mM, pH 7,4). Luego se centrifugó durante 50 
minutos a 10.000 r.p.m y se tomó el sobrenadante; el pellet se descartó. El sobrenadante se 
diluyó al 1/5 en agua para la cuantificación. 
 
Materiales y Reactivos 
Soluciones de proteínas: 
a) Solución patrón de albúmina de suero bovino (BSA), 2 mg/ml en H2O. 
b) Cuatro soluciones de ovoalbúmina (A, B y C), llevadas a pH neutro con NaOH. 
c) Homogenato de hígado de rata, diluido al 1/20 en agua. 
 
Reactivo de Biuret 
 CuSO4.3 H2O 1,5 g 
 KOCO(CHOH)2COONa.4H2O 6,0 g 
 NaOH 3,0 g 
 H2O c.s.p 1 litro 
 
Procedimiento 
A) Reacción colorimétrica de Biuret: 
- Complete el protocolo de trabajo para realizar la curva de calibración y la determinación de 
la concentración de proteínas de una muestra de ovoalbúmina. 
Consideraciones: Teniendo en cuenta los volúmenes de H2O y proteínas utilizados para la 
muestra, prepare una curva de calibración para poder trabajar tanto en función de la 
concentración (mg/ml) como en función de la masa (mg). 
 27 
* Para la curva de calibración, no superar los 2 mg de BSA. 
 
Tabla I. Protocolo de trabajo 
Tubo 
 
(nº) 
H2O 
 
(ml) 
BSA 2 mg/ml 
 
(ml) 
Solución de 
ovoalbúmina 
 (ml) 
Homogenato 
de hígado 
de rata 
(dil 1/20) 
Reactivo de 
Biuret 
(ml) 
1-2 - 1,0 
3-4 - 1,0 
5-6 - 1,0 
7-8 - 1,0 
9-10 - 1,0 
11-12 - 1,0 
13-14 0,6 - 0,4 1,0 
15-16 0,5 - - 0,5 1,0 
 
- Agregar los reactivos en orden (H2O, BSA, ovoalbúmina y homogenato de hígado de rata) y 
finalmente el reactivo de Biuret a todos los tubos, de manera que la reacción de color 
transcurra simultáneamente en todas las muestras. 
- Mezclar el contenido de cada tubo por inversión y después de 10 minutos determinar la 
absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro. 
 
B) Medición de la absorbancia en 280 nm: 
Se realizó una dilución ¼ de cada una de las muestras incógnita de ovoalbúmina. Se 
determinó la absorbancia en 280 nm utilizando una cubeta de cuarzo, ya que el plástico 
absorbe la radiación UV. 
Los valores de absorbancia obtenidos fueron los siguientes: 
Muestra A: 0,247 
Muestra B: 0,414 
Muestra C: 0,586 
 
 28 
 
Análisis de los resultados: 
Graficar los valores de absorbancia en 540 nm en función de la masa de albúmina 
bovina (mg) y en función de la concentración del mismo patrón (mg/ml). Estimar la 
concentración de ovoalbúmina presente en la muestra incógnita a partir de los dos métodos de 
representación. 
Calcule la concentración molar de la muestra y compare dicho valor con el obtenido 
a partir de la lectura de la absorbancia de la misma solución en 280 nm. El coeficiente de 
extinción molar de la ovoalbúmina en esa longitud de onda es de 28,5 x 10
3
 M
-1 
x cm
-1
. 
Identificar cuál es la muestra incógnita (A, B o C). 
Estime la concentración de proteínas totales en mg/ml del homogenato de hígado de 
rata. 
 
Preguntas: ¿Qué aproximación se hace cuando se mide la concentración de ovoalbúmina 
frente a un patrón de una proteína diferente como es la seroalbúmina? 
¿Por qué es posible determinar la concentración de proteínas por el método de Biuret tanto a 
una muestra pura como a una mezcla de proteínas? 
¿Qué control consideraría necesario realizar para evaluar interferencias con el reactivo de 
Biuret, teniendo en cuenta los reactivos empleados para preparar el homogenato de hígado de 
rata? 
 
 
 29 
GUÍA DE ORIENTACIÓN Y RECOMENDACIONES PARA LLEVAR 
A CABO EL TRABAJO PRÁCTICO 
 
 En este caso, no es necesario hacer un tratamiento previo a la muestra, que puede ser una 
proteína pura o una mezcla de proteínas (como homogenatos de tejidos, lisados celulares, 
etc). Es muy importante usar volúmenes de muestra que estén dentro del rango de 
linealidad del método. Es por ello, que si no contamos con información de la muestra, es 
conveniente utilizar diferentes diluciones, por si la muestra sin diluir sobrepasa el límite 
de linealidad. 
 Es aconsejable realizar un protocolo con el mismo volumen final en todos los tubos para 
facilitar los cálculos. 
 Revisar cuidadosamente la pipeta que va a emplearse para colocar los volúmenes 
deseados. 
 Seguir el orden de los siguientes pasos: 
1. Agregar el volumen indicado de agua en cada condición del protocolo (tubos 1 a 14). 
2. Colocar el volumen de muestra patrón (seroalbúmina bovina) en los tubos del 1 al 10. 
3. Agregar la muestra a dosar: ovoalbúmina en los tubos 11 y 12 y homogenato de 
hígado en los tubos 13 y 14. 
4. Dispensar 1 ml del reactivo de Biuret. Es importante que este reactivo que permitirá 
el desarrollo de la reacción colorimétrica en el mismo momento para todos los tubos. 
Mezclar el contenido de los tubos por inversión. Así se produce la reacción 
simultáneamente en todos los tubos, tanto de la curva de calibración como de las 
muestras. 
5. Dejar transcurrir el tiempo necesario para que se desarrolle la reacción colorimétrica. 
En estecaso, se dejan 10 minutos y luego se determina la absorbancia en un 
espectrofotómetro a 540 nm. 
 
 30 
PROTEÍNAS. PARTE III 
ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) 
 
Introducción: 
La electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio 
(SDS) permite separar las proteínas de acuerdo a su tamaño. 
La carga eléctrica de una proteína es proporcional a la diferencia entre su punto 
isoeléctrico y el pH del medio en el cual se encuentra disuelta. Si una mezcla de proteínas es 
sometida a un campo eléctrico, cada proteína migrará de acuerdo a la carga neta que el medio 
le otorgue. Para poder separar las proteínas en un campo eléctrico según su tamaño se 
aprovecha su capacidad de unir un detergente iónico, el SDS, para que la carga negativa del 
detergente enmascare la carga de la proteína nativa. En presencia de un exceso de agente 
reductor (2-mercaptoetanol o ditiotreitol), se unen 1,4 g de SDS por g de proteína, por lo cual 
los complejos SDS-polipéptido adquieren la misma densidad de carga negativa y al ser 
colocados en un campo eléctrico migran hacia el ánodo a idéntica velocidad. 
Cuando la relación carga/masa y la forma de todos los complejos es la misma, la 
movilidad electroforética de los complejos a través de una malla porosa resulta proporcional 
al peso molecular del polipéptido o proteína. Si se cumplen estas condiciones, la 
representación gráfica del logaritmo decimal de la masa molecular del polipéptido o proteína 
en función de su movilidad relativa (Rf) muestra una relación lineal. 
La malla porosa de los geles de poliacrilamida, que permite separar los complejos 
según su tamaño molecular, se obtiene por la polimerización de moléculas de acrilamida 
(polímero lineal) y de bisacrilamida (que une a las cadenas lineales entre sí); el tamaño de los 
poros puede ser regulado variando la concentración de acrilamida y bisacrilamida (Figura 1). 
En una misma corrida de SDS-PAGE se pueden analizar varias proteínas de peso 
molecular conocido (marcadores) y proteínas cuyo PM se desea determinar. La distancia de 
migración de cada uno de los marcadores servirá para construir una curva de calibración, 
cuyo uso permitirá calcular el PM de diferentes polipéptidos tratados con 2-mercaptoetanol. 
 31 
Se determina la distancia de migración (d) y se calcula la movilidad relativa o Rf como la d 
de una proteína / d del frente de corrida (Azul de bromofenol). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. (A) Partes de un equipo para SDS-PAGE. (B) Entramado del gel de poliacrilamida y 
separación de moléculas según su tamaño molecular. 
 
 
Además de obtener el PM de una proteína desnaturalizada, se puede realizar un 
análisis de la estructura proteica: Si se compara la movilidad electroforética de proteínas 
tratadas en presencia y en ausencia del agente reductor, será posible detectar la presencia de 
puentes disulfuro intercatenarios. 
Asimismo, es posible hacer una análisis semicuantitativo de una muestra comparando 
la intensidad de las bandas obtenidas. Para ello, se realiza una densitometría mediante un 
software (ej. Gel Pro Analyzer o Image J) de las bandas de interés y se obtiene un valor 
numérico que corresponde a la intensidad óptica integrada (IOD). 
 
PREGUNTAS DE ORIENTACIÓN 
1. Fundamento de la electroforesis en geles de poliacrilamida. 
2. Ventajas de los geles de acrilamida sobre otros soportes. 
3. Describa la reacción química de formación de los geles de poliacrilamida. 
 32 
4. Parámetros que definen las características de los geles de poliacrilamida: %T y %C. Geles 
en gradiente. 
5. Tipos y usos de los geles de poliacrilamida: geles continuos y discontinuos; geles disciantes 
(SDS-PAGE) y no disociantes; geles en lámina y en cilindro, electroforesis bidimensional. 
6. Geles discontinuos: mecanismos de los geles concentrador y de separación. 
7. Composición de los buffers de muestra y de corrida. 
8. Coloración de los geles de poliacrilamida 
9. Aplicaciones de los geles de poliacrilamida en presencia de SDS. 
10. Análisis de los geles: determinación del PM de una proteína desnaturalizada. Curva de 
calibración con marcadores de PM. 
11. Evaluación de la estructura proteica, corrida electroforética en ausencia y presencia de 
reductor. 
12. Análisis semi-cuantitativo, densitometría de las bandas. 
13. Electroforesis bidimensional. Dado el siguiente resultado, indique: 
 
 
¿Qué características presentan las proteínas presentes en A y en B? 
¿Qué resultado se hubiera obtenido si se realzaba un SDS-PAGE para las proteínas de A y B? 
¿Y qué resultado se hubiera obtenido en un isoelectroenfoque? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A 
B 
 33 
TRABAJO PRÁCTICO: PROTEÍNAS- SDS-PAGE 
 
Objetivo: A. Estimar el peso molecular de polipéptidos y proteínas y evaluar la presencia de 
puentes disulfuro en los mismos. 
B. Realizar un análisis semicuantitativo de diferentes muestras de ovoalbúmina. 
 
Materiales y reactivos: 
* Soluciones necesarias para preparar los geles 
 - Solución de acrilamida/bisacrilamida (al 30 %: 29,2 % acrilamida, 0,8 % bisacrilamida) 
 - Tris/HCl 1,5 M pH 8,8 
 - Tris/HCl 0,5 M pH 6,8 
 - SDS 10 % (p/v) 
 - Persulfato de amonio 10 % (p/v) 
 - TEMED (N,N,N′,N′-Tetrametiletilendiamina) 
 
* Buffer utilizado para la preparación de las muestras (Buffer de muestra) 
 Concentraciones finales: - Tris/HCl 0,0625 M, pH 6,8 
 - SDS 2 % (p/v) 
 - Sacarosa o Glicerol 10% 
 - 2-Mercaptoetatol 5 % (v/v) 
 - Azul de bromofenol 0,01 % (p/v) 
* Buffer de corrida 
 Concentraciones finales: - Tris 25 mM, pH 8,3 
 - Glicina 190 mM 
 - SDS 0,1 % (p/v) 
 
 
 
 
 
 
 34 
* Patrones de PM 
 
Proteína Peso molecular 
Miosina 200.000 
 galactosidasa 116.250 
Fosforilasa b 97.400 
Seroalbúmina bovina 66.200 
Ovoalbúmina 45.000 
Anhidrasa carbónica 
Inhibidor de tripsina 
Lisozima 
Aprotinina 
31.000 
21.500 
14.400 
6.500 
 
Procedimiento: 
Seguir el siguiente protocolo de la tabla I (preparación de 2 geles): 
 
 
Tabla I. Reactivos para preparar 2 geles de poliacrilamida 
 
 
Concentración final de acrilamida/bisacrilamida 
 Gel Running 10% (ml) Gel Stacking 4% (ml) 
Agua 4,00 3,00 
Tris/HCl 1,5 M pH 8,8 2,5 - 
Tris/HCl 0,5 M pH 6,8 - 1,25 
SDS 10 % (p/v) 0,1 0,05 
Acrilamida/bisacrilamida (30 %) 3,3 0,65 
Persulfato de amonio 10 % (p/v) 0,1 0,035 
TEMED 0,01 0,008 
Volumen total 10,00 5,00 
 
- Armar el aparato de electroforesis según las indicaciones del docente. 
- Preparar los geles de corrida y apilamiento. 
- Sembrar las muestras. 
- Conectar los equipos de geles a la fuente de poder. El ánodo (+) se conecta desde la parte 
inferior del aparato y el cátodo (-) desde la parte superior. La corrida electroforética se realiza 
a 200 V. 
 35 
- Una vez finalizada la corrida, las proteínas se detectan por tinción con colorante. Se desarma 
el soporte del gel y luego el gel se incuba 20 min a 50 ºC con el colorante (Coomassie blue R-
250 0,25 % p/v en metanol: ácido acético: agua 45:7:48 v/v). Posteriormente, se remueve el 
exceso de colorante con solución decolorante (metanol: ácido acético: agua 45:7:48 v/v). 
Alternativamente, puede realizarse la decoloración en agua hirviendo. 
-Medir la distancia de migración de cada banda desde el inicio del gel de corrida en 
centímetros. Medir la distancia de migración del frente de la corrida. 
 
Gel 1: Análisis semi-cuantitativo de las muestras de ovoalbúmina A, B y C (parte 2 del 
trabajo práctico) 
Se sembrarán por duplicado 15 µl de las muestras A, B y C diluidas 1/10. En la primera calle 
sembrar patrones de PM (10 l). 
Tabla II (Gel 1) 
Calle Muestra Volumen a sembrar 
1 Patrones de peso molecular 10 l 
2 Ovoalbúmina (A) 20 l 
3 Ovoalbúmina A) 20l 
4 Ovoalbúmina (B) 20 l 
5 Ovoalbúmina (B) 20 l 
6 Ovoalbúmina(C) 20 l 
7 Ovoalbúmina (C) 20 l 
8 Muestra de ovoalbúmina X 20 l 
 
Gel 2: Evaluación de la presencia de puentes disulfuro intracatenarios e intercatenarios. 
Determinación del PM 
Tabla III (Gel 2) 
Calle Muestra Volumen a sembrar 
1 Patrones de peso molecular 10 l 
2 Ovoalbúmina con -ME (OVO +) 20 l 
3 Ovoalbúmina con -ME (OVO +) 20l 
4 Ovoalbúmina sin -ME (OVO -) 20 l 
5 Ovoalbúmina sin -ME (OVO -) 20 l 
 36 
6 -globulina sin -ME ( -) 15 l 
7 -globulina sin -ME ( -) 15 l 
8 -globulina con -ME ( +) 15 l 
9 -globulina con -ME ( + ) 15 l 
 
Análisis de los resultados: 
- En el gel 1 evaluar la intensidad de las bandas a través de la densitometría de las mismas 
(ver video demostrativo en el Campus virtual). Representar gráficamente el valor de 
intensidad óptica obtenido en función de la masa sembrada de muestra en cada calle. 
- Estimar la concentración de una muestra X de ovoalbúmina. 
- Para el gel 2, representar gráficamente el logaritmo de los pesos moleculares de los patrones 
en función de la distancia que ha migrado cada uno de ellos. 
- Calcular el peso molecular de los polipéptidos contenidos en las muestras tratadas con 2-
mercaptoetanol. 
- Analizar si las proteínas utilizadas contienen puentes disulfuro intercatenarios y proponga la 
estructura probable de la/las proteínas. 
- Analizar si la concentración relativa de acrilamida/bisacrilamida usada fue la correcta para la 
separación de todas las bandas y, en caso contrario, proponga las modificaciones que 
mejorarían la resolución.