Biologia de los microorganismos-1068 (413)

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196 G E N Ó M I C A , G E N É T I C A Y V I R O L O G Í A
una sola molécula HeliScope, fragmentos de DNA de cadena 
sencilla y tamaño de alrededor 32 bases se adhireren a una 
matriz en un portaobjetos. Mientras se sintetiza la cadena com-
plementaria, se controla por un microscopio los nucleótidos 
que se van incorporando gracias a un marcador fluorescente. La 
máquina puede controlar mil millones de fragmentos de DNA 
simultáneamente. Finalmente un ordenador ensambla los frag-
mentos en una secuencia completa.
La secuenciación SMRT (del inglés, single-molecule real-
time) de Pacific Biosciences emplea una técnica conocida como 
guía de onda de modo cero (ZMW, del inglés zero-mode wave-
guides). En este método, la DNA polimerasa alarga la cadena 
creciente añadiéndole desoxirribonucleótidos etiquetados con 
cuatro marcadores fluorescentes diferentes. Dichos desoxirri-
bonucleótidos emiten un destello de luz según se van incorpo-
rando en su lugar. Hay dos elementos nuevos que son cruciales 
para la secuenciación de una única molécula. Primero, las reac-
ciones se realizan dentro de nanocavidades (las guías de onda 
de modo cero o ZMW), que son pequeños pocillos cilíndricos 
de metal con una amplitud de 20 nm que reducen suficiente-
mente la luz de fondo, de modo que permite la detección de un 
destello único de luz de cada nucleótido individual. Segundo, el 
marcador fluorescente está anclado al grupo pirofosfato que es 
escindido durante la reacción, en lugar de estarlo a la parte del 
desoxirribonucleótido que se incorpora a la cadena. Por tanto, 
los marcadores coloreados no se acumulan en el DNA, sino que 
cada reacción produce una explosión de color microscópica.
La característica clave de la secuenciación de cuarta gene-
ración, también conocida como «secuenciación post-light», es 
que no se emplea la detección por métodos ópticos. El método 
de secuenciación Ion Torrent no utiliza la secuenciación de 
una sola molécula de DNA. En vez de utilizar desoxirribonu-
cleótidos marcados, este método mide la liberación de proto-
nes (H+) cada vez que un desoxirribonucleótido se incorpora 
a la cadena creciente de DNA (Figura 6.4a). Un semiconductor 
orden definido. El que produzca un pulso de luz identificará qué 
base ha sido insertada. El método de Illumina/Solexa se asemeja 
a la secuenciación de Sanger en que emplea la síntesis de DNA 
y nucleótidos terminadores de cadena. Sin embargo, en el sis-
tema Illumina, los terminadores son ribonucleótidos desoxi (en 
lugar de didesoxi) y pueden ser incorporados reversiblemente. 
Además, cada uno de los cuatro desoxirribonucleótidos porta 
su propio marcador fluorescente, que funciona como grupo blo-
queador para el 3′-OH, causando la terminación de la cadena. 
Secuenciación de DNA de tercera y cuarta 
generación
La característica clave de la secuenciación de tercera generación 
es que se secuencia una única molécula de DNA. Existen dos 
enfoques fundamentales: uno basado en la microscopía y el otro 
basado en la nanotecnología. En el método de secuenciación de 
Figura 6.3 Mecanismo de pirosecuenciación. Cada vez que se inserta
un nuevo desoxirribonucleótido en la cadena creciente de DNA (flechas rojas), 
se libera pirofosfato (Pp
i
), que es usado por la enzima sulfurilasa para producir 
ATP a partir de AMP. El ATP es consumido por la enzima luciferasa que emite 
luz. Los desoxirribonucleótidos no utilizados son degradados por la enzima 
apirasa (flecha gris).
G
3′ 5′G T T TGT C A C G TC A T AC AGCA GC A
5′ 3′C AA GT CG T
DNA polimerasaCadena molde
Cadena creciente
dGTP
dNTPs
dNDPs
dNMPs
+ Pi
PPi
ATP
La apirasa escinde los 
desoxirribonucleótidos 
no utilizados.
La sulfurilasa 
convierte AMP + PPi 
en ATP.
La luciferasa 
consume ATP y 
emite luz.
Un sensor detecta 
el destello de luz.
P
O
O–O
H2C
HOH
Base
HH
HH
O
O
P
O
OH
OO
H2C
HOH
Base
HH HH
O
P O P OH
OO
OH OH
3′
3′
5′
5′
Señal eléctrica 
para 
monitorizar.
El protón (H+) 
liberado cambia el 
pH, generando 
una señal eléctrica.
Según el DNA 
pasa a través del 
poro, se emite 
una carga de 
corriente 
específica para 
cada base.
H+
PPi
Cadena creciente de DNA DNA de cadena doble
Nanoporo de proteína
Trifosfato de desoxirribonucleótido
que se incorpora
Punto de
crecimiento
DNA de cadena
sencilla 
Secuenciación por semiconductor Ion Torrent(a) Secuenciación por nanoporo(b)
Figura 6.4 Secuenciación de cuarta generación. (a) El sistema de secuenciación semiconductor Ion Torrent se basa en la liberación de protones (H+)
cada vez que un desoxirribonucleótido es insertado en la cadena creciente de DNA. Un electrodo mide el cambio de pH resultante. (b) En la secuenciación por 
nanoporos, la doble hélice de DNA se convierte en una cadena sencilla para pasar a través de un poro. El paso del DNA ella través del nanoporo causa cambios en 
la carga eléctrica que son específicos para cada base.
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