Problemas integradores (no resueltos)_

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Problema integrador I
 Usted desea evaluar los lípidos y las proteínas presentes en el cerebro de rata. 
a) ¿Cómo procedería para realizar el estudio del perfil lipídico del homogenado de cerebro de rata? Enumere los principales pasos necesarios para poder llevarlo a cabo, considerando primero la obtención del homogenado. Mencione que lípidos espera observar. ¿Cuál de estos lípidos determina la estructura de las biomembranas? cuál o cuáles son reserva energética?
 b) Si Ud. quisiera comparar el perfil de proteínas presentes en los peroxisomas, los núcleos y los lisosomas obtenidos a partir del cerebro de rata, responda: 
- ¿Qué fracciones subcelulares debería aislar? Realice un esquema del protocolo desde el homogenado hasta su obtención.
 - ¿Qué técnica utilizaría para aislar las organelas puras? ¿Cómo comprueba su pureza? Justifique sus respuestas.
 - ¿Qué metodología utilizaría para comparar el perfil de proteínas presentes en las organelas puras? Indique los pasos a seguir. 
c) Indique la técnica que utilizaría para evaluar la presencia de la proteína X en estas organelas. Justifique.
 Problema integrador II 
Ud. está estudiando una nueva terapia para una enfermedad grave de la piel que se produce por el déficit de la proteína laminina. Recibe una biopsia de piel de un paciente en la que decide probar una terapia génica con un plásmido recombinante que contiene el cDNA de la laminina. A partir de la biopsia, Ud. realiza un cultivo. Responda: 
a) El cultivo de las células de la piel del paciente ¿se trata de un cultivo primario o de una línea celular? Justifique su respuesta. Explique qué requerimientos presentan los cultivos de células eucariontes. Indique si este tipo de cultivo alcanzará el límite de Hayflick (p50) o no. Justifique su respuesta. 
b) Explique qué es un plásmido recombinante. El plásmido utilizado permite su clonación en bacterias y la expresión de proteínas en células eucariontes. ¿Qué elementos debe contener el vector para cumplir estas funciones? Justifique. 
c) Explique cómo se obtiene el cDNA de la laminina. Una vez obtenido, cómo procedería a insertarlo en el vector plasmídico. 
d) Realice un esquema del protocolo experimental de transformación bacteriana e indique los controles que debe incluir y la función de los mismos. 
e) En relación con la extracción del plásmido de las bacterias, indique el fundamento de la separación del DNA plasmídico del DNA cromosómico bacteriano. 
f) Una vez obtenidos los queratinocitos transfectados en cultivo decide criopreservar parte de las células para posteriores tratamientos. Si Ud. dispone de una botella confluente de estas células, ¿cómo procedería para cosecharlas y contarlas? Indique los pasos del protocolo y fundamente el uso de cada reactivo