Introduction to Genetic Engineering

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Genetic	Engineering	
2022SE02
Prof.	Javier	Álvarez	
Basic	literature:	Crommelin	D	J	A,	Sindelar	R	D,	Meibohm	B.	
Pharmaceutical	Biotechnology	Fundamentals	and	Applications	(2019)
Gene manipulation, Gene cloning, Recombinant DNA technology, 
Genetic modification, or New Genetics
GENETIC	ENGINEERING
Role of DNA as the genetic 
material was confirmed (mid 
1940s)
DNA ligase was isolated 
(1967)
Discovery of the structure of 
DNA (1953)
Complete genet ic code 
(1966)
Principles of inheritance and 
genetic mapping
Restriction enzyme (1970)
First recombinant DNA 
molecules were generated 
(1972)
Joining DNA fragments to a 
plasmid (1973) 
CLONING
ERAS OF 
GENETICS 
DEVELOPMENT
Crommelin	et	al.,	2019
GENETIC	ENGINEERING GENETIC	ENGINEERING
Used to control high blood 
sugar in adults and children 
with diabetes mellitus type I
GENETIC	ENGINEERING
Insulina	Recombinante
Insulina	Recombinante
Newly	introduced	biopharmaceuticals	
are	very	expensive
• High	initial	production	costs	
• Low	number	of	patients	(for	many	therapeutic	proteins.	Ex.	orphan	drugs	
and	orphan	diseases)	
• Many	failures	during	the	process	of	drug	discovery	and	development	
• Probability	to	be	marketed:	
• Monoclonal	antibody:	17%	
• Small	molecule	drugs:	7%	
(at	least	there	is	no	antimicrobial	resistance)
Review	of	basic	concepts
REPLICACIÓN	DEL	ADN	EN	EUCARIOTAS
Slower	than	in	prokaryotes	and	with	different	replicative	DNA	polymerases	
Initiation	is	carried	out	by	a	Origin	Recognition	Complex	
Okazaki´s	fragments	are	longer	in	eukariotes
Eukaryotic	DNA	replication	is	conserved	from	prokaryotes	to	eukaryotes.	
A	fork-like	DNA	structure.	Replisome.		
Eukaryotic	DNA	replication	restricts	DNA	replication	to	only	once	per	cell	cycle.
EUKARIOTIC	DNA	REPLICATION
Los	genes	contienen	información	para	hacer	proteínas.	
Las	mutaciones	en	los	genes	alteran	la	función	de	las	proteínas.
Beadle	&	Tatum’s	Neurospora	experiment	(1941)
Beadle and Tatum shared, with J. Lederberg, the 1958 Nobel Prize in Physiology or Medicine
ADN
Figure 11.7 – Part 2
ARN
1
OH
OH
OH
OH
2
U
H
3
RNA	can	form	3D	structures TYPES	OF	RNA	MOLECULES
Clases	de	ARN	(*) Tipo	celular Localización	celular Función
ARN	ribosomal	(ARNr) Bacteriano	y	Eucariótico Citoplasma Estructura	y	función	del	ribosoma
ARN	mensajero	(ARNm) Bacteriano	y	Eucariótico Núcleo	y	Citoplasma Información	genética	para	hacer	proteínas
ARN	transferente	(ARNt)	 Bacteriano	y	Eucariótico Citoplasma Incorpora	AA	a	la	cadena	polipeptídica
ARN	de	interferencia	(ARNi) Eucariótico Citoplasma Regula	la	expresión	génica
(*)	Otros	ARNs	en	Eucariotas:	small	nuclear	RNA	(RNA	splicing);	small	nucleolar	RNA	(processing	and	assembly	of	tRNA).
Transcripción:	síntesis	de	ARN	dirigida	por	ADN
• Three	phases:	
❑ Initiation	
❑ Elongation	
❑ Termination	
• The	double	helix	must	relax	
• Only	one	of	the	two	DNA	chains	serves	as	a	template	for	transcription
Around	1,200	cases	found	in	
mice	and	humans.	More	
common	in	viruses	and	
bacteria.	
They	optimize	the	use	of	the	
DNA.	
However	any	mutation	could	
affect	more	than	one	gene.
OVERLAPPING	GENES	ARE	VERY	RARE
(Example	in	phage	fX174)
ESTRUCTURA	DE	UN	GEN	BACTERIANO	(UNIDAD	DE	TRANSCRIPCIÓN)
• Unidad	de	transcripción:	segmento	de	ADN	que	codifica	para	una	molécula	de	ARN	(región	
codificadora	 de	 ARN	 y	 terminador)	 y	 la	 secuencia	 necesaria	 para	 su	 transcripción	
(promotor).	
• Promotor:	 secuencia	 de	 ADN	 adyacente	 al	 gen	 que	 es	 requerida	 para	 la	 transcripción.	
Contiene	“secuencias	consenso”	=	secuencias	cortas	de	nucleótidos	comunes	a	la	mayoría	
de	 promotores.	 El	 esparcimiento	 y	 la	 posición	 relativa	 respecto	 del	 lugar	 de	 inicio	 son	
similares	en	la	mayoría	de	promotores.
APARATO	BASAL	PARA	LA	TRANSCRIPCIÓN	EN	BACTERIAS
• Las	 bacterias	 poseen	 una		
única	 ARN	 polimerasa	 que	
produce	 todas	 las	 clases	 de	
ARN	bacterianos	
• El	 factor	 sigma	 permite	 a	 la	
ARN	 polimerasa	 unirse	 a	 las	
“secuencias	 consenso”	 del	
promotor
El	factor	σ	(sigma)	de	la	ARN	polimerasa	procariótica	reconoce	
secuencias	consenso	de	la	región	promotora	a	la	izquierda	del	
punto	de	inicio	de	la	transcripción.	
El	factor	σ	se	separa	de	la	polimerasa	una	vez	la	transcripción	se	
ha	iniciado.
Iniciación Elongation
Under	 the	 electron	 microscope	 DNA	
molecules	 undergoing	 transcription	 exhibit	
“Christmas-like	tree	structures”.
Any	gene	can	be	transcribed	into	
mRNA	simultaneously	by	several	
RNA	polymerases
El	bucle	de	terminación
Termination:	RNA	polymerase	transcribes	a	
termination	sequence	(inverted	repeat	
followed	by	6	A)	
Other	times	there	is	a	Rho	protein	complex
In	operons	with	related	genes	there	are	no	
termination	sequences	in	between	them,	and	
the	RNA	is	called	polycistronic
www.bio.miami.edu
Transcription	and	translation	
can	occur	simultaneously	in	
prokaryotes
Eukaryotic	Transcription
El	 núcleo	 eucariótico	 posee	 tres	 clases	 de	 ARN	 polimerasas	 con	
diferente	especificidad	y	que	reconocen	diferentes	tipos	de	promotores.
ARN	POLIMERASAS	EUCARIÓTICAS
La	ARN	polimerasa	II	es	la	encargada	de	generar	ARN	mensajero.
Las	secuencias	que	codifican	para	diferentes	genes	
pueden	encontrarse	en	cualquiera	de	las	dos	cadenas
• In the nucleus 
• Initiation, elongation & termination 
• Transcription factors help recruit the 
appropriate polymerase 
• Chromatin remodeling necessary 
• RNA Polimerase II 
• Only 25% of pre-mRNA is further processed, 
the rest gets degraded
Eucariotic	Transcription
Eucariotic	Transcription Transcripción:	Iniciación
No	primers
Transcripción:	Elongación
• 5’	to	3’	direction,	antiparallel	to	the	template	chain		
• 40	nt/sec	added	
• To	protect	from	degradation,	a	CAP	of	20-40	nt	is	added	to	nascent	
mRNA	at	the	5’	end,	some	20-40	nt	from	start
T	becomes	U
Transcripción:	Terminación
• El	“transcrito"	se	separa	del	ADN	tras	transcribir	una	secuencia	de	poliadenilación	
(AAUAAA).	A	ella	se	unen	entonces	varias	proteínas	unas	10-35	bases	más	abajo,	que	
liberan	el	pre-ARNm	
• Este	“Transcrito	primario”	se	llama	“pre-ARNm”	
• Solo	un	25%	del	pre-ARNm	se	procesa	para	generar	el	ARNm	maduro	
• *La	ARN	polimerasa	sigue	polimerizando	pero	el	ARNm	es	degradado	inmediatamente	
por	no	tener	protección	en	el	extremo	5’.
MODIFICACIONES	POST-TRANSCRIPCIONALES	DEL	pre-ARNm
Modificación Función
Adición	del	5´CAP Da	más	estabilidad	al	ARNm	y	facilita	la	unión	del	ribosoma	en	la	traducción
Corte	del	3’	y	adición	de	cola	de	poli-A Aumenta	la	estabilidad	del	ARNm.	Migración	fuera	del	núcleo.
Splicing	del	ARNm Elimina	intrones	y	permite	generar	proteínas	diferentes
Edición	del	ARNm Altera	la	secuencia	del	ARNm
5´	CAP
Cola	de	Poli(A):	50-250	A
Campbell	Biology,	Tenth	Edition	-	Reece,	Urry,	Cain	et	al.pdf
Lewin’s	Genes
Splicing
*En	algunos	organismos	no	hay	
spliceosoma	sino	que	el	mismo	intrón	
de	ARN	tiene	actividad	catalítica,	se	
pliega	sobre	sí	mismo	y	hace	el	corte	
=	es	una	ribozima.
Summary
	How	many	RNA	polymerases	in	Prokaryotes?	And	in	Eukaryotes?	
	Where	does	transcription	take	place?	
	Do	transcription	and	translation	occur	at	the	same	time?	
	Where	does	it	take	place	the	processing	of	pre-mRNA?	
	Does	bacterial	RNA	polymerase	produce	a	high	or	a	low	number	of	
transcripts?	What	about	the	eukaryotic	RNA	polymerase?	
	Does	it	happen	at	the	same	level	in	different	tissues?
Reverse	Transcriptase Transcriptomics:	Microarrays
https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_microarray
A microarray is a pattern of ssDNA probes which 
are immobilized on a surface (called a chip 
or a slide). The probe sequences are designed 
and placed on an array in a regular pattern of 
spots. The chip or slide is usually made of glass 
or nylon and is manufactured using 
technologies developed for silicon computer 
chips. Each microarray chip is arranged as a 
checkerboard of 105 or 106 spots or features, 
each spot containing millions of copies of a 
unique DNA probe (often 25 nt long). 
A microarray is a pattern of ssDNAprobes which 
are immobilized on a surface (called a chip 
or a slide). The probe sequences are designed 
and placed on an array in a regular pattern of 
spots. The chip or slide is usually made of glass 
or nylon and is manufactured using 
technologies developed for silicon computer 
chips. Each microarray chip is arranged as a 
checkerboard of 105 or 106 spots or features, 
each spot containing millions of copies of a 
unique DNA probe (often 25 nt long). 
Ejemplo de un microarray de levaduras. Dos condiciones: 
levaduras creciendo en presencia de oxígeno (respiración aerobia) 
o en ausencia de oxígeno (fermentación).
• Aislar ARNm de levaduras crecidas aeróbicamente. Etiquetar el 
ADNc de ROJO.
• Aislar ARNm de levaduras crecidas anaeróbicamente; Etiquetar 
el ADNc de VERDE.
• Unión al chip y lavado.
• Análisis de datos:
*Puntos rojos = el gen se expresa SOLO en condiciones aerobias
*Puntos verdes = el gen se expresa SOLO en condiciones 
anaerobias 
*Puntos amarillos = el gen se expresa en AMBAS condiciones 
*Puntos negros = no hay expresión de genes en ninguna de las 
condiciones
*** Se conoce la posición de cada gen en el chip.
RNA-seq
Diagram	showing	the	translation	of	
mRNA	and	the	synthesis	of	proteins	
by	a	ribosomeBased	mostly	on	Raven	et	al,	2011.	Biology,	9th	edition
El	“adaptador”	ARNt
The	3-D	structure	(determined	by	X-ray)	of	the	tRNA	is	
a	 conserved	 inverted	 L	 structure	 (left).	 The	 2-D	 view	
(clover-shaped	structure	at	the	right)	reveals	the	three	
loops	resulting	from	intramolecular	base	pairing.		
• 5’	UTR	y	3’	UTR	tanto	en	Procariotas	como	en	Eucariotas.	En	
Procariotas,	unas	3-10	bases	de	longitud.	En	Eucariotas,	de	cientos	a	
miles	de	bases	de	longitud	
• El	5’UTR	ayuda	en	la	unión	del	ribosoma	al	inicio	de	la	traducción	
• El	3’UTR	ayuda	con	las	modificaciones	post-transcripcionales	y	con	la	
terminación	de	la	traducción
EL	CÓDIGO	GENÉTICO
Universal	(con	algunas	excepciones)	
Triplete:	tres	nucleótidos	para	un	aminoácido	
Degenerado	(el	3er	nucleótido	es	flexible):	un	
aminoácido	 puede	 ser	 especificado	 por	 más	
de	un	codón	
No	 hay	 solapamiento:	 un	 nucleótido	 solo	
puede	formar	parte	de	un	codón	
Sin	espacios.	La	lectura	del	ARNm	es	continua	
El	marco	 de	 lectura	 lo	 decide	 el	 codón	 de	
iniciación	 (AUG)	 y	 los	 codones	 de	 parada	
-UAA,	 UAG	 y	 UGA-	 que	 no	 codifican	 para	
aminoácidos
RIBOSOMA:	un	organelo	complejo	(2	subunidades)		
formado	por	varias	moléculas	de	ARNr	y	muchas	proteínas
Estas	diferencias	
permiten	a	muchos	
antibióticos	impedir	
la	traducción	de	
proteínas	sin	afectar	
a	la	traducción	de	
genes	eucarióticos	
Unidades	Svedberg	
(S)
Density	Gradient	Centrifugation	
(ex.	in	Cesium	Chloride,	CsCl)
Todos	los	ARNt	tienen	una	
secuencia	CCA	en	el	extremo	3´	
El	grupo	carboxilo	del	aminoácido	
se	une	al	hidroxilo	del	carbón	2´-	
or	3´-	de	la	adenina	en	el	extremo	
3´	del	ARNt
EL	PRIMER	PASO	DE	LA		TRADUCCION:	CARGA	DEL	ARNt
La	clave	para	la	especificidad	la	dan	unas	enzimas	llamadas	
aminocil-ARNt-sintetasas,	una	por	cada	aminoácido
Amino	acid	+	tRNA	+	ATP	→	aminoacyl-tRNA	+	AMP	+	PPi
20	aminoácidos	
61	codones	
31-41	tRNAs	
20	aminoacil-ARNt	
sintetasas
LA	IMPORTANCIA	DE	LA	FASE	DE	CARGA	DEL	ARNt
1. La	carga	del	ARNt	puede	ser	considerada	la	traducción	real:	asegura	
que	cada	aminoácido	es	cargado	en	su	ARNt	correspondiente	
2.Después,	 durante	 la	 fase	 de	 elongación,	 el	 ribosoma	 no	 sabrá	 si	 el	
ARNt	porta	el	aminoácido	equivocado	
3. En	un	experimento	se	cambió	el	aminoácido	que	portaba	el	ARNt	de	
cisteína	 a	 alanina	 y	 se	 generó	 un	 polipéptido	 con	 el	 aminoácido	
equivocado	=	el	ribosoma	es	incapaz	de	detectar	el	error
http://lab.concord.org/embeddable.html#interactives/
sam/DNA-to-proteins/4-mutations.json
Animación	de	los	procesos	de	transcripción	y	traducción
INICIO	DE	LA	TRADUCCIÓN
1. EL	ARNm	se	une	a	 la	 subunidad	pequeña	del	 ribosoma.	 Secuencias	 “consenso”	en	 la	
región	 5’UTR	 del	 ARNm	 (“Shine-Dalgarno”	 en	 Bacteria,	 “Kozak”	 en	 Eukariotas)	 se	
emparejan	con	el	ARNr	de	la	subunidad	pequeña	
2. El	primer	ARNt	se	une	al	codón	de	inicio	en	el	sitio	P	
3. La	subunidad	grande	del	ribosoma	se	une	al	complejo	de	iniciación
Shine-Dalgarno	sequence:	AGGAGG		
(located	just	5’	of	the	AUG	initiation	codon).	
	
Kozak	sequence:	ACCAUGG	(AUG	is	the	
initiation	codon).	Expression	levels	change	
up	to	95%	when	the	-3	position	is	changed	
from	a	purine	to	a	pyrimidine.
1. En	procariotas	el	complejo	de	iniciación	son	factores	que	ayudan	a	posicionar	el	ARNt	
(que	lleva	formil-metionina	en	procariotas)	y	el	ARNm	en	su	lugar.	
2. En	eucariotas	son	más	de	9	proteínas.	El	primer	ARNt	 lleva	metionina	y	 la	subunidad	
pequeña	del	ribosoma	se	une	al	5’	CAP	del	ARNm
COMPLEJO	DE	INICIACIÓN
INICIO	DE	LA	TRADUCCIÓN A	P	E
ELONGACIÓN
1. Un	ARNt	cargado	con	su	aminoácido	
ocupa	el	sitio	A.	La	descodificación	
ocurre	en	la	subunidad	pequeña	del	
ribosoma	
3. Un	enlace	peptídico	entre	los	
aminoácidos	de	los	sitios	A	y	P	tiene	
lugar	por	la	acción	de	la	enzima	
peptidil	transferase	de	la	subunidad	
grande	del	ribosoma	(una	ribozima)	
5. El	ribosoma	avanza	al	siguiente	codón,	
con	lo	que	el	polipéptido	en	formación	
se	mueve	al	sitio	P
1
2
3
The	elongation	
cycle	repeats	itself
Polyribosomas:	
Una	molécula	de	
ARNm	puede	ser	
transcrita	
simultáneamente	por	
varios	ribosomas
https://youtu.be/_7AWsnbAfj0
Formación	del	enlace	
peptídico
“Wobble	pairing”:	since	there	are	fewer	tRNAs	than	codons,	one	tRNA	can	read	more	than	one	codon.	
This	happens	because	of	the	degeneracy	of	the	code,	the	bond	at	the	last	letter	of	the	triplet	is	less	
stringent	than	at	the	other	two	letters.	The	tRNA	wobbles	(moves)	at	the	A	site	till	it	fits.
TERMINACIÓN
• Cuando	aparece	un	codón	de	
STOP	no	hay	ARNt	que	pueda	
unirse	al	sitio	A	
• En	su	lugar,	un	factor	de	
liberación	se	introduce	en	el	
sitio	A	
• El	ARNt,	el	polipéptido	y	el	
ARNm	se	liberan	al	separarse	
las	dos	subunidades	del	
ribosoma
COMPARACIÓN	DE	LA	TRADUCCIÓN	BACTERIANA	Y	EUCARIOTA
• La	transcripción	y	la	traducción	son	simultáneas	en	bacterias,	pero	separadas	por	la	
membrana	nuclear	en	eucariotas.		
• El	 ARNm	 bacteriano	 tiene	 una	 vida	 muy	 corta	 (minutos).	 En	 eucariotas	 puede	
persistir	de	horas	a	días*	
• Las	 subunidades	 ribosomales	 de	 bacterias	 y	 eucariotas	 tienen	 diferencias	
significativas	en		su	tamaño	y	composición	
• N-formylMetionina	es	el	primer	aminoácido	en	bacterias	(metionina	en	eucariotas)
(*)	5´Cap	and	polyA	tail	estabilize	mRNA
LA	VÍA	SECRETORA
VIDEOS	MOSTRANDO	LA	VÍA	SECRETORA
https://youtu.be/wJyUtbn0O5Y
VIDEOS	MOSTRANDO	LA	VÍA	SECRETORA
https://youtu.be/VdmbpAo9JR4
https://classroom.google.com/c/NDkxOTQ0MTIwODQy?cjc=kxiwxzo
Código	del	Google	Classroom
CONTROL	DE	LA	EXPRESIÓN	GÉNICA
Diagrama mostrando en qué pasos de la ruta ADN-
ARNm-proteína la expresión puede ser controlada.
Layout	
• Functional	organization	of	the	genome.		
• Gene	regulation	in	bacterial	cells:	the	Operon	model.		
• Chromatin		structure,	packing,	and	remodeling..	
• Epigenetics.	
• Coordinated	gene	regulation	in	Eukaryotes.	
• The	potential	role	of	RNAs	in	the	control	of	gene	
expression.	
• Post-translational	control	of	gene	expression
ORGANIZACIÓN	FUNCIONAL	DEL	GENOMA
• El	genoma	contiene	genes	(secuencias	de	ADN	que	codifican	para	ARN)	y	elementos	
reguladores:	secuencias	de	ADN	que	regulan	la	expresión	del	ADN	
• Para	qué	codifican	los	genes:	
• Genes	estructurales:	codifican	para	enzimas	(incluyendo	algunos	tipos	de	ARN)	y	
proteínas	estructurales	
• ARNm	→	Proteínas	
• Otros	ARN	involucrados	en	la	traducción	(ARNr	y	ARNt),	procesamiento	del	ARN	
(ADN	y	ARN	nucleares	pequeños),	y	control	de	la	expresión	génica	(RNAi)	
• Genes	reguladores:	producen	proteínas	que	se	unen	al	ADN	o	miARN
Control	de	la	Expresión	Génica	en	Procariotas
EL	CONTROL	DE	LA	EXPRESIÓN	GÉNICA	EN	BACTERIAS	OCURRE	
MAYORMENTE	AL	NIVEL	DE	LA	INICIACIÓN	DE	LA	TRANSCRIPCIÓN
• Los	procariotas	son	simplesen	su	forma	de	regular	la	expression	génica	
• Los	 genes	 se	 activan	 o	 reprimen	 en	 respuesta	 a	 cambios	 del	 medio	 donde	
viven	(ej.,	presencia	de	un	metabolito)	
• La	transcripción	es	siempre	alta	
• La	transcripción	y	la	traducción	ocurren	simultáneamente	(no	hay	membrana	
nuclear)	
• El	ARN	bacteriano	tiene	vida	corta	(poca	estabilidad)	
• El	Operón	–	genes	bacterianos	con	funciones	similares	están	agrupados	bajo	
el	 control	 de	 un	 único	 promotor.	 Su	 producto	 es	 un	 único	 ARNm	
“policistrónico”
• Cuatro	formas	de	terminar	la	producción	de	proteínas	innecesarias:	
• Bloqueando	la	transcripción	del	ADN	en	ARNm	
• Degradando	ese	ARNm	
• Previniendo	su	traducción	en	el	ribosoma	
• Degradando	la	proteína	resultante	
• La	forma	más	utilizada	es	también	la	más	económica	para	la	célula
EL	CONTROL	DE	LA	EXPRESIÓN	GÉNICA	EN	BACTERIAS	OCURRE	
MAYORMENTE	AL	NIVEL	DE	LA	INICIACIÓN	DE	LA	TRANSCRIPCIÓN
El	control	de	la	transcripción	puede	ser	positivo	o	negativo	
El	control	positivo	aumenta	la	frecuencia	de	inicio	de	la	
transcripción	
El	control	negativo	reduce	esa	frecuencia	
El	control	tiene	lugar	gracias	a	proteínas	reguladoras	
Los	procariotas	ajustan	la	expresión	génica	en	respuesta	a	las	
condiciones	del	medio	en	el	que	crecen
EL	MODELO	DEL	OPERÓN
• El	 operón	es	 la	 unidad	 funcional	 del	 ADN	 genómico	 que	 contiene	 un	 grupo	 de	
genes	bajo	el	control	de	un	promotor	único.	
• Misma	 secuencia	 terminadora:	 todos	 los	 genes	 son	 transcritos	 juntos	 en	
un	”ARN	policistrónico”	(un	ARNm	único	que	codifica	para	más	de	una	proteína).	
• Estructura	 del	 Operón:	 promotor	 (lugar	 de	 unión	 de	 la	 ARN	 polimerasa),	
operador	(lugar	de	unión	del	regulador)	y	genes	estructurales.	
• Los	 operones	 son	 inducibles	 (la	 transcripción	 está	 normalmente	 apagada)	 o	
reprimibles	(la	transcripción	está	normalmente	encendida)	
• Un	“gen	regulador”	independiente	ayuda	a	controlar	(+	activador,	-	inhibidor)	la	
transcripción	del	operón.
Esquema	del	operón	de	la	lactosa	(lac)	y	su	comportamiento	“tipo	interruptor”.	
Los	genes	lacZ,	lacY,	lacA	son	genes	metabólicos	de	la	lactosa	localizados	más	
abajo	del	promotor	Plac	
EL	OPERÓN	lac	DE	LA	LACTOSA	(E.	coli):	OPERÓN	INDUCIBLE
A)	No	hay	ni	lactosa	ni	glucosa
EL	OPERÓN	lac	DE	LA	LACTOSA	(E.	coli):	OPERÓN	INDUCIBLE
B)	No	hay	glucosa	pero	sí	hay	lactosa
EL	OPERÓN	lac	DE	LA	LACTOSA	(E.	coli):	OPERÓN	INDUCIBLE LA	GLUCOSA	IMPIDE	LA	ACTIVIDAD	DEL	OPERÓN	LAC
Poca	glucosa	=	mucho	cAMP.	Ello	hace	que	el	regulador	positivo	CAP	
(Catabolite	Activator	Protein)	se	una	al	operón.	Ello	dobla	el	ADN,	lo	cual	
ayuda	a	que	se	una	después	al	ADN	también	la	polimerasa.
Si	hay	glucosa,	el	
operón	de	la	lactosa	
está	apagado	
porque	la	bacteria	
prefiere	la	glucosa	
antes	que	otros	
azúcares.	
La	proteína	CAP,	al	
no	unirse	al	ADN,	
tampoco	facilita	la	
union	de	la	ARN	
polimerasa. Hay	glucosa	y	no	hay	lactosa
LA	GLUCOSA	IMPIDE	LA	ACTIVIDAD	DEL	OPERÓN	LAC
Molecular Biotechnology_Principles and Applications of Recombinant DNA. 
4th Edition - ASM Press (2009). p. 197
EL	OPERÓN	DEL	TRIPTÓFANO	trp	(E.	coli):	OPERÓN	REPRIMIBLE
El	operón	Trp:	
• Codifica	para	5	genes	
• 5	polipéptidos	se	combinan	para	hacer	3	enzimas	
• Cada	enzima	participa	en	un	paso	para	sintetizar	Trp
El	operón	Trp:	
Cuando	hay	
demasiado	Triptófano	
ya	sintetizado,	este	se	
une	al	represor	para	
inhibir	la	transcripción	
de	los	genes	para	la	
producción	de	
triptófano
EL	OPERÓN	DEL	TRIPTÓFANO	trp	(E.	coli):	OPERÓN	REPRIMIBLE Comparativa	de	los	operones	Lac	vs.	trp	
Lactosa	!	catabolismo Triptófano	!	anabolismo
El	repressor	Lac	es	un	tetrámero	
de	4	proteínas	hélice-giro-hélice
El	repressor	del	triptófano	
	es	un	dímero
1. Zinc	fingers	(Eukaryotes)	
2. Helix-turn-helix	(Prokaryotes	and	Eukaryotes)	
3. Leucine	zipper	-	dimers	(Eukaryotes)
COMMON	DNA-BINDING	PROTEIN	MOTIFS	
These	different	structural	motifs	result	in	transcription	factor	specificity	for	the	
consensus	sequences/regulatory	elements	to	which	they	bind.
Control	de	la	Expresión	Génica	en	Eucariotas
If our genes are so similar, what really makes a eukaryote 
different from a prokaryote, or a human from E. coli? 
  Prokaryotes Eukaryotes
Structure of genome Single, generally circular genome 
sometimes accompanied by 
smaller pieces of accessory DNA, 
like plasmids
Genome organized in several 
chromosomes; 
nucleosome structure limits DNA 
accessibility
Size of genome Relatively small Relatively large
Location of gene transcription 
and translation
Coupled; no nuclear envelope 
barrier
Nuclear transcription and 
cytoplasmic translation
Gene clustering Operons where genes with similar 
function are grouped together
Operons generally not found in 
eukaryotes; each gene has its own 
promoter element and enhancer 
element(s)
Default state of transcription On Off
DNA structure Highly supercoiled DNA with 
some associated proteins
Highly supercoiled chromatin 
associated with histones in 
nucleosomes
Table: Differences between Prokaryotic and Eukaryotic gene expression and 
regulation
In	multicelular	eukaryotic	organisms,	gene	regulation	brings	about	celular	
differentiation.	Eukaryotes	require	complex	control	over	gene	expression
POINTS	OF	CONTROL	OF	GENE	EXPRESSION		
IN	EUKARIOTIC	CELLS
1. Cambios	en	el	genoma	(raro):	Amplificación	y	reordenamientos	
2. Cambios	en	la	estructura	de	la	cromatina:	enrollamiento,	
modificaciones	de	las	histonas,	metilación	del	ADN	
3. Aumento	de	la	transcripción	por	factores	de	transcripción	
específicos	(TFs)	
4. Procesamiento	del	ARNm:	splicing,	corte,	transporte	
5. Traducción	del	ARNm:	ARN	de	interferencia	(miRNA	y	siRNA)	
6. Procesamiento	de	las	proteínas:	plegamiento,	corte,	
polimerización	y	fosforilación	
7. Proteólisis:	autofágica	y	mediada	por	la	ubicuitina
Chromatin	 is	 found	 in	 two	 states:	 euchromatin	 (transcriptionally	 competent)	 and	
heterochromatin	 (transcriptionally	 silent).	 Euchromatin	 shows	dispersed	appearance	
while	 heterochromatin	 condensed	 appearance.	 Epigenetic	 events	 such	 as	 DNA	
methylation	and	histone	modification	may	alter	chromatin	between	these	states.
CHROMATIN	STRUCTURE
DNA	methylation	
Histone	modificationes	
NucleosomesDegree	of	DNA	condensation	varies	as	function	of	gene	regulation
• Histones	are	highly	alkaline	proteins	
of	chromatin,	around	which	DNA	winds	to	
form	structural	units	called	nucleosomes.	
• The	nuclesome	consists	of	an	octamer	of	four	
histones	(two	copies	each	of	H2A,	H2B,	H3	and	
H4).	
• Positively	charged	tails	of	nucleosomal	histone	
proteins	probably	interact	with	the	negatively	
charged	phosphate	groups	of	DNA.	
• Histone	acetylation	and	DNA	methylation	
condense	chromatin	and	prevent	some	
transcription	factors	from	binding	to	the	DNA.
HISTONES	ARE	RESPONSIBLE	FOR	CHROMATIN	PACKING
CHEMICAL	CHANGES	IN	CHROMATIN	STRUCTURE
Acetylation	 of	 histones	 leads	 to	 the	
formation	of	a	loose	condition	of	chromatin	
(euchromatin),	permitting	transcription.		
Histone	 methylation	 does	 not	 alter	 the	
charge	of	the	histone	protein,	it	can	result	in	
both	gene	activation	and	repression.	
DNA	methylation	is	most	common	in	Cytosine	
adjacent	 to	 Guanine	 bases	 thus	 forming	 CpG	
islands.	Heavily	methylated	DNA	 is	associated	
with	the	repression	of	transcription.
EPIGENETICS: THE DOGMA-DEFYING DISCOVERY THAT GENES LEARN FROM EXPERIENCE
DNA	can	be	
methylated.	This	is	
then	recognized	by	
proteins	that	keep	
the	region	silenced.	
Histones	can	also	be	
methylated	to	
silence	regions	of	
the	chromosome	or	
acetylated	to	
actívate	them.	
Abnormal	patterns	
of	DNA	methylation	
are	associated	with	
some	types	of	
cáncer
https://phys.org/news/2015-03-creatures-great-small-environment-traits.html
By altering the degree of DNA methylation (a biochemical process that controls the expression of certain 
genes - a bit like a dimmer can turn a light up or down) of a gene involved in controlling growth called 
Egfr, they were able to create a spectrum of worker ant sizesdespite the lack of genetic difference 
between one ant and the next. The less methylated the gene, the larger the size of the ants. This 
affected all the other genes involved in cellular growth.
https://www.the-scientist.com/daily-news/sperm-rnas-transmit-stress-34647
El	miedo	y	el	estrés	se	pueden	heredar
• Los	hijos	ratones	de	un	macho	sometido	a	estrés	nacen	con	síntomas	
de	estrés,	como	si	lo	hubieran	heredado	del	padre	
• El	esperma	del	padre	sometido	a	estrés	tenía	niveles	altos	de	9	
miRNAs	
• Al	inyectar	en	cigotos	normales	esos	9	miRNAs	e	implantarlos	en	una	
hembra	no	sometida	a	estrés,	la	prole	heredaba	el	estrés,	pese	a	que	
los	padres	biológicos	no	habían	sido	sometidos	a	estrés.
EUKARYOTIC	GENE	TRANSCRIPTION	REGULATION
La regulación de la transcripción génica ocurre por complejas 
interacciones entre factores de transcripción que se unen 
específicamente al ADN y un complejo de transcripción basal formado 
cerca del sitio de inicio.
Los factores de transcripción (FTs) son proteínas reguladoras cuya 
función es activar la transcripción al unirse a secuencias de ADN 
específicas.
Los FTs poseen dominios de unión al ADN (elementos reguladores) 
definidos de hasta 106 veces más alta afinidad por sus secuencias 
objetivo que por el resto de la cadena de ADN.
REGULACIÓN	DE	LA	TRANSCRIPCIÓN	GÉNICA	EN	EUCARIOTAS
Los FT generales ayudan a formarse el complejo de iniciación de la 
transcripción, al cual se une luego la ARN polimerasa para comenzar la 
transcripción a un nivel basal.
Los FT específicos se unen a los FT generales según qué tejidos o en 
qué momento para aumentar los niveles de transcritos.
Los potenciadores (enhancers) son regiones de ADN en los que se 
unen FT específicos. Pueden estar muy lejos de los genes que activan, 
incluso en cromosomas diferentes. 
Los represores compiten con los FT.
El remodelamiento de la cromatina expone el promotor al complejo 
de transcripción.
REGULACIÓN	DE	LA	TRANSCRIPCIÓN	GÉNICA	EN	EUCARIOTAS
Transcription	Factor-only	Interactome.	
Over	1,000	nodes	found.
https://www.mskcc.org/research-
areas/labs/raju-chaganti/overview
https://www.the-scientist.com/features/enhancers-
conserved-in-activity-not-in-sequence-69331
Enhancer Function
Enhancers mediate gene expression 
by recruiting transcription factors 
(TFs) that subsequently recruit 
additional machinery to initiate 
transcription. Enhancers often act 
across great distances in the genome
—up to about 1 million base pairs, as 
is the case for the developmental 
patterning gene Shh—and their 
location relative to the genes they 
regulate is variable: they can be 
upstream or downstream, and they 
can reside outside of coding areas 
entirely or within introns of other 
genes.
Transgenic expression of sponge 
enhancers in zebrafish and mice 
demonstrates that these sequences 
can drive cell type–specific gene 
expression across species.
•	Control	de	la	salida	de	los	ARNm	del	núcleo	al	citoplasma	(solo	
un	5%	del	ARNm	llega	al	citoplasma)	
•	miRNA	(micro	ARN)	y	siRNA	(ARN	de	interferencia	pequeño)	
•	Modificación	de	proteínas	
•	Mantener	proteínas	en	lugares	específicos	como	el	RE	
•	Degradación	de	proteínas:	el	proteasoma	
	 -	de	proteínas	mal	plegadas	
	 -	de	proteínas	de	vida	corta	(como	las	ciclinas)	
•	Hay	enfermedades	asociadas	a	un	control	defectuoso	de	la	
cantidad	o	estructura	de	las	proteínas:	Alzheimer,	Parkinson,	mal	
de	las	vacas	locas...
ALGUNOS CONTROLES 
POST-TRANSCRIPCIONALES Y POST-TRADUCCIONALES
Fosforilación y desfosforilación de proteíns PROTEASOMA
El	ARN	de	interferencia	controla	un	30%	de	los	genes	humanos
El	ARNi	o	ARN	de	interferencia	es	un	mecanismo	utilizado	por	las	células	eucariotas	para	
limitar	la	invasión	de	genes	exógenos	(virus)	y	para	reprimir	sus	propios	genes.	
(A)	El	ARNi	se	estimula	por	la	presencia	de	ARN	de	doble	cadena	(dsRNA)	de	diversos	
orígenes*	que	pasan	a	ser	cortados	por	la	enzima	Dicer.	
(B)	Una	de	las	cadenas	(20-21	bp)	se	combina	con	proteínas	para	formar	el	complejo	RISC	
(RNA-induced	silencing	complex)	
(C)	Dicha	cadena	se	aparea	entonces	con	ARNm	para	inhibir	su	traducción	(miRNA	
function)	or	degradarlo	(siRNA	function)	
(*)	Sintético,	viral	o	miRNA	endógeno	(transcription	of	inverted	DNA	repeats)	
miRNA	=	microRNA	
siRNA	=	small	interfering	RNA
ARNi:	matando	al	mensajero
Diferencias	principales	entre	el	miRNA	y	el	
siRNA:	
(A)	El	miRNA	tiene	como	objetivo	el	ARNm	de	
genes	distintos	de	él	mismo,	mientras	que	el	
siRNA	tiene	como	objetivo	el	ARNm	del	gen	
del	que	fue	derivado	
(B)	El	miRNA	está	conservado	en	la	evolución,	
y	el	siRNA	no	
(C)	Solo	hay	un	miRNA	derivado	de	un	pre-
miRNA,	mientras	que	muchos	siRNAs	pueden	
derivar	de	la	misma	molécula	de	dsRNA	
(D)	En	animales	es	más	común	la	inhibición	
del	ARNm	y	en	plantas	su	corte	(¿mejor	
apareamiento?)
http://www.rxipharma.com/
https://www.the-scientist.com/news-opinion/plants-use-rna-to-talk-to-neighbors-69337
DOI:10.1126/science.aar4142
*Knockdown, not knockout. 
In k/o the gene is deleted.
Model	Organisms
• Especially	suited	for	genetic	studies	and	genetic	
manipulation:	
– short	generation	time	
– large	progeny	
– can	grow/be	propagated	in	labs	
• For	the	study	of	human	diseases	(ex.	cancer)	
• For	basic	biology	(ex.	DNA	repair,	cell	cycle)	
• For	biotechnology	(ex.	crop	improvement,	novel	
pathways	for	production	of	biomolecules,	etc)
source:	Concepts	of	Genetics.	Klug	et	al.	10th	Edition
Colocación	de	elementos	al	inicio	del	trabajo Colocación	de	elementos	durante	la	exposición	al	UV
Extracción	
	manual
Extracción	
	automática
Ciclos	de	la	PCR
Paso	de	ARN	
a	ADNc
www.smobio.com
Ct 10 Ct 19 Ct 33 Ct 39