Técnicas de reacción osmótica y fragmentación de ADN

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TÉCNICAS DE REACCIÓNTÉCNICAS DE REACCIÓN
OSMÓTICA Y FRAGMENTACIÓNOSMÓTICA Y FRAGMENTACIÓN
DE ADNDE ADN
técnicas de reacción osmótica
Grados Aquilino Carme Nicole
López Rengifo Pamela Danuska
Silva Tepe Francesco Stefano
Vitate Lucho Gabriel
TEST DE RESISTENCIA
HIPEROSMÓTICA
La prueba hipoosmótica (HOST) es simple y de bajo costo,
permite evaluar la integridad funcional de la membrana
plasmática del espermatozoide (Jeyendran et al., 1984). 
La suspensión de espermatozoides
en un medio hipoosmótico
ocasiona un desequilibrio entre los
medios intracelular y extracelular,
situación que la célula trata de
compensar difundiendo agua al
compartimento intracelular;
considerando un aumento del
volumen del espermatozoide. Esta
situación se evidencia por cambios
morfológicos característicos, tales
como dilatación y enrollamiento
de la cola (Jeyendran et al., 1984).
11 TEST DE ENDOSMOSIS O EFECTO
DEL MEDIO HIPOOSMÓTICO (HOST)
TEST DE RESISTENCIA
OSMÓTICA (ORT)
Se realizan dos pruebas, se coloca la muestra
espermática en un medio hipoosmótico y
otra muestra del mismo semen en un medio
isoosmótico, ambas se colocan a baño maría
por 30 minutos, una gota de semen se
mezcla con una gota de un eosina-nigrosina
para conseguir ver el acrosoma, se evalúan
ambos en el microscopio con el objetivo de
inmersión 1000x y se cuentan hasta 100 o 200
así distinguiendo los alterados y no alterados.
Se aplica la siguiente fórmula y se establece
la relación con la tasa de fertilidad.
%ORT= (% NAR medio hiposmótico + % NAR
medio isosmótico) / 2
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Desarrollo Sostenible de la Ganadería de Doble Propósito. Capítulo LVIII, 707 714.
Bibliografía: 
Se emplea para analizar si las muestras pueden
resistir la crio preservación, estos se exponen a
condiciones hiperosmóticas del medio
congelado afectándose la integridad de la MP y
la motilidad del semen (Liu y Foote, 1998).
evaluar la resistencia de la membrana
acrosomal del espermatozoide a un cambio
brusco de la osmolaridad, incubando muestras
seminales desde una solución hiperosmótica
hasta una isoosmótica y observando el NAR al
utilizar la tinción doble azul trypan-Giemsa
(Rigau et al., 1995) o la tinción eosina-nigrosina.
En la medida que ocurran más reacciones
acrosómicas o pérdidas completas del acrosoma
después de incubar el semen, menor es la
resistencia de la muestra seminal al cambio
osmótico y por ende, podría presentar menor
congelabilidad y capacidad fecundante a nivel
de campo (Rigau et al., 1995; Caiza de la Cueva,
1998).
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La SCSA desnaturaliza la molécula de ADN
mediante una solución ácida, y una vez
desnaturalizada se tiñe con naranja de
acridina. Este fluorocromo se intercala
entre las dos cadenas de ADN y al ser
excitado emite una longitud de onda de
530 nm y se visualiza de color verde,
mientras que al intercalarse en el ADN de
cadena sencilla (ADN desnaturalizado)
emite una longitud de onda de 640 nm
(color rojo). Las células se separan por
citometría de flujo.
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técnicas de fragmentación de ADN
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Bibliografía: 
11 SCD (SPERM CHROMATIN
DISPERSION)
SCSA O SPERM CHROMATIN
STRUCTURE ASSAY
La prueba de dispersión de cromatina
espermática (SCD) es un ensayo simple y rápido
que detecta la fragmentación del ADN
espermático. Los espermatozoides encerrados
en una matriz inerte delgada se incuban con
una solución ácida que desnaturaliza el ADN,
seguido de una solución de lisis adaptada que
elimina la mayoría de las proteínas nucleares.
Este procedimiento da como resultado que los
bucles de ADN se extiendan hacia la matriz
inerte, produciendo halos de cromatina. En
comparación, el esperma humano con ADN
fragmentado no produce halos o produce halos
que son muy pequeños.
ENSAYO COMETA
El ensayo cometa se lleva a cabo
incluyendo los espermatozoides en un
microgel de agarosa situado sobre un
portaobjetos, y sometiéndolos a una lisis
mediante un agente reductor de grupos
sulfidrilo de las protaminas. Los núcleos
desproteinizados se someten a
electroforesis y se tiñen con sustancias
fluorescentes. El ADN fragmentado
avanza por acción del campo eléctrico
generando una imagen similar a la cola
de un cometa.
ENSAYO TÚNEL
El Tunel consiste en la incorporación de
nucleótidos marcados con un
fluorocromo en los extremos 3’- OH de
las roturas existentes en el ADN, bien
sean de cadena simple o doble. La
reacción se lleva a cabo mediante una
transferasa terminal (Deoxynucleotidyl
Transferase o TdT). La señal es mayor
cuanto mayor sea el grado de
fragmentación del ADN. 
https://doi.org/10.18004/anales/2022.055.01.27