BMTM_U3_ADL_JEMP - Jessica Mendoza (7)

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Universidad Abierta y a Distancia de México
División de Ciencias de la Salud, Biológicas y Ambientales
Ingeniería en Biotecnología
Microbiología y Taxonomía Microbiana
Asignación a cargo del docente en línea
Técnicas microbiológicas
2 de mayo de 2021
Prácticas virtuales 
Tincion de Gram
Fue publicado por el bacteriólogo Hans Christian Gram en 1884. Es una tinción diferencial compuesta que permite dividir a casi todas las bacterias en dos grupos: Gram positivo y Gram negativo, basado en las características de la pared celular. Las únicas bacterias que no pueden ser clasificadas con este método son las bacterias que carecen de pared celular como las de los géneros Micoplasma, Ureaplasma y las intracelulares obligadas. 
Fundamento 
Se basa en la diferencia que hay entre la pared de las células Gram positiva y Gram negativas. En la pared celular se encuentra un peptidoglicano que es mureína forma una malla porosa alrededor de la pared celular, proporcionando rigidez y forma a las bacterias. 
Aplicación 
· Diagnóstico rápido preliminar en contexto clínico medico 
· Mejor dirección de la antibioterapia 
· Establecimiento de grupos bacterianos en Gram + y Gram –
· Clasificación de bacterias de acuerdo con su forma y agrupación 
· Identificación de bacterias con ayuda de pruebas bioquímicas 
Procedimeinto 
Materiales 
· 
· Cristal violeta 
· Alcohol acetona
· Lugol (Yodo de Gram)
· Safranina 
· Asa bacteriológica 
· Portaobjetos 
· Microscopio óptico 
· Aceite de inmersión 
· Muestra 
· Cerillo o encendedor 
· Marcador 
· Mechero 
Método 
1. Con el asa bacteriológica colocar la muestra sobre la laminilla. De ser necesario añadir una gota de agua destilada para distribuir uniformemente la muestra en la laminilla. Esta no debe ser demasiada, pues podría impedir la observación bacteriana. 
2. Dejar secar al medio ambiente, después fijar exponiendo la laminilla brevemente al calor del mechero durante 3 segundos aproximadamente. Rotular con el marcador. 
3. Cubrir el portaobjetos con cristal violeta por 1 minuto. Lavar después con agua, inclinando el portaobjetos, de forma delicada. No secar. 
4. Aplicar Lugol y dejar por 1 minuto. Lavar de igual forma, no secar. 
5. Aplicar alcohol acetona de 15 a 30 segundos, gota a gota, con el portaobjetos inclinado. Cuando este deje de arrastrar color, lavar con agua nuevamente. No secar. 
6. Cubrir el portaobjetos con safranina de 30 segundos a 1 minuto. Lavar con agua y dejar secar. 
7. Colocar la laminilla en el microscopio, usar el objetivo de 100x con aceite de inmersión. 
8. Al finalizar, limpiar el objetivo con papel seda o una torunda con alcohol al 50%
Prueba de la catalasa 
Es una prueba realizada en laboratorio para ayudar a determinar qué tipo de bacteria es la encontrada en algún cultivo. Permite diferenciar entre microorganismos estreptococos y estafilococos, a través de la aplicación de peróxido de hidrogeno o agua oxigenada. La prueba se considera positiva cuando la muestra burbujea tras la aplicación de esta. Se realiza posterior a la tinción de Gram procedente de colonias Gram positivo. 
Fundamento
Los estafilococos se consideran catalasa positivos pues poseen la enzima catalasa, la cual reacciona con el agua oxigenada formando agua y liberando oxígeno. 
Por otra parte, los estreptococos son catalasa negativos pues carecen de esta enzima, por lo que cuando se añade el agua oxigenada no hay reacción alguna. 
Aplicación 
· Diferenciación entre microorganismos de las especies Streptococcus y Staphylococcus 
· Es de bajo costo, por lo que se realiza con facilidad. 
· Permite la identificación y clasificación de las bacterias de interés. 
· En el ámbito clínico se usa para el diagnóstico de enfermedades. Por ejemplo, se realiza durante la identificación de S. pyogenes, agente etiológico de la faringoamigdalitis. 
Procedimiento 
Materiales 
· 
· Muestra de cocos Gram +
· Laminilla
· Agua oxigenada (H2O2) al 3%
· Asa bacteriológica 
Metodo
1. Se coloca una gota de agua oxigenada sobre el portaobjetos 
2. Con el asa se toma la colonia Gram + y se lleva al portaobjetos. 
3. Se mezcla la colonia con el agua, se observa si existe reacción a través de la formación de burbujas. 
Prueba de la coagulasa
Es una prueba que permite diferenciar a Staphylococcus aureus de otros estafilococos. Esto se realiza normalmente con fines diagnósticos, frente a infecciones cuyo agente etiológico necesita ser conocido para la realización de antibioterapia dirigida. Puede ser seguido de un antibiograma. 
Fundamento 
Se basa en la diferenciación de S. aureus frente a otros estafilococos, hacienda uso de la característica de S. aureus de poseer una coagulasa, que al ser colocada una colonia que se presume es de esta especie, coagula el plasma confirmando su presencia. 
Aplicaciones 
· Identificación de S. aureus frente a otros estafilococos 
· Capacidad diagnóstica
· Tratamiento antibiótico más adecuado 
Procedimiento 
Materiales 
· 
· Colonia de cocos Gram + catalasa positiva
· Estufa a 35°C
· Asa en punta 
· Gradilla
· Plasma oxalatado en tubo de ensayo
Método 
1. Tomar con el asa una colonia con las características requeridas. 
2. Hacer la siembra de la muestra en el plasma, inoculando por agitación. 
3. Incubar de 24 a 48 horas a 35°C
4. Posterior a la incubación, observar si el plasma se coagulo y determinar si la prueba es positive o negativa.
Conclusión 
Tras la realización de estas prácticas aprendí algunos de los procesos que permiten al laboratorista identificar las bacterias, ya sea para realizar algún diagnóstico médico o con motivos de investigación. Son procesos sencillos que tienen base en las características bioquímicas de las bacterias, que están ampliamente extendidos y que son muy importantes en la formación del biotecnólogo. 
Referencias
1. Departamento de Microbiología y Patología (2019) Microbiología I Manual de Prácticas. Universidad de Guadalajara. Segunda Edición.
2. TechnoServe. (s.f) Prueba de la catalasa. Hato Sano. Recuperado de http://www.vivo.colostate.edu/hatosano/topics/catalase.html 
3. Rodriguez, F. (2018) Prueba de la coagulasa. Blog de laboratorio clínico y biomedico. Recuperado de https://www.franrzmn.com/prueba-de-la-coagulasa/
Las bacterias Gram positivas la estructura de peptidoglicano es gruesa con gran cantidad de acido teicoico asociado por enlaces covalentes, que forman una gruesa malla. Esta es la responsable que después de la decoloración con alcohol acetona, el colorante de cristal violeta y el Lugol queden atrapados al interior de la misma después del cierre de los espacios en la malla posterior a la deshidratación. 
Las bacterias Gram negativas el peptoglicano no representa mas del 10% de la pared, además de estar rodeado de una membrana externa, que es sensible a los solventes por ser de estructura lipídica y contener moléculas de lipopolisacárido. Por ello, cuando se realiza la tinción de Gram, epigmento de cristal violeta no es retenido mientras que la safranina si tiñe