Transcripción en eucariotas

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Transcripción en eucariotas
Presentan tres ARN polimerasas. Pol I se encarga de la síntesis de pre ARNr. Pol II se encarga de la síntesis de ARNm y algunos especializados. Pol III lleva a cabo la síntesis de ARNt, ARNr y algunos especializados.
Los eucariontes presentan promotores (tata box), enhancers, proteínas activadoras y mediadores.
Maduración del transcripto primario
· Casquete 5´: Capping. Se adiciona un cap de 7 – metilguanosina. Esta estabiliza el ARN además de alinear los ARNm eucarióticos sobre el ribosoma durante la traducción. 
· Splicing: Existen intrones y exones. Son dos subunidades en las que solo las últimas poseen información útil. Se cortan los intrones dejando solo los exones. Corte y empalme.
· Cola de poli A: La ARN pol sigue transcribiendo pero copia una secuencia, una región que atrae un complejo enzimático (endonucleasa) que corta la cadena (transcripto primario) y se agrega una secuencia (cola) de adeninas. 
Transcriptoma
Todo el ARN que se transcribe en un determinado momento. Solo una pequeña porción de ADN codifica para proteínas y sin embargo gran parte de ADN se transcribe en ARN.
Traducción
Conversión del código de cuatro elementos al código de veinte aminoácidos
· Codón: secuencia de tres nucleótidos.
· Código degenerado.
· Codón stop: donde terminan de sintetizar la proteína.
· Codón inicio: Metionina (AUG).
ARNt
Molécula adaptadora, se une al codón por un extremo (anticodón) y al aminoácido por el otro extremo (3´). La aminoacil – ARNt sintetasa es la que se encarga de cargar el aminoácido al ARNt. Une ARNt con aminoácidos utilizando energía de ATP. Es un enlace de alta energía. 
ARN ribosomal y ribosomas
Dan el lugar para que ocurra la síntesis de proteínas. Tiene un lado mayor y otro menor.
· Iniciación: El ribosoma se une al extremo 5´de ARNm.
· Elongación: A medida que el ARNm entra al núcleo del ribosoma. El ARNt lee la secuencia y si el codón es correspondiente con el anticodón se agrega cada aminoácido en la secuencia correcta para formar un polipéptido.
· Terminación: Se agrega un codón stop y termina la síntesis.
Marco de lectura
Secuencia de ADN comprendido entre el codón de inicio de la traducción y el codón de terminación, descontando los intrones.
Inserciones: Se agregan nucleótidos a la cadena.
Deleciones: Se le quitan nucleótidos a la cadena.
Tecnicas de estudio
El objetivo es alcanzar la pureza deseada con el mayor rendimiento posible. El aislamiento de una molécula se logra a partir de las propiedades fisicoquímicas y biológicas de la misma.
Fases de la purificación
· Preparación, extracción y clarificado: Se obtiene la biomasa y se produce el disgregamiento celular mediante lisis (ruptura de células sin pared celular en medio hipotónico) o mediante un mortero o sonicacion. Es importante tener en cuenta el pH ya que podrían romperse proteínas, la temperatura y presencia de proteasas (a baja temperatura hay menos velocidad de reacción de las proteasas), la fuerza iónica, etc. 
· Captura: Mediante centrifugación diferencial se obtienen fracciones celulares. Se distinguen el sobrenadante (macromoléculas) y el pellet (restos celulares grandes). 
· Purificación intermedia: Puede ser por salting – out o por diálisis. La primera es una técnica de precipitación diferencial a elevadas concentraciones salinas. Aprovecha la diferencia de solubilidad de las distintas proteínas. Luego se separan por centrifugación a baja velocidad.
Diálisis es una técnica de separación por tamaño. El extracto parcialmente purificado se coloca en una membrana que permite el paso de moléculas pequeñas. 
· Refinamiento: Puede ser por cromatografía en columna o por electroforesis. La primera es un método físico de separación de mezclas por el principio de retención selectiva. Hay una fase móvil y una fase estacionaria. Existen cuatro tipos:
Exclusión molecular cuyo principio de separación es por tamaño.
Intercambio iónico cuyo principio de separación es por carga.
Afinidad cuyo principio de separación es la bioafinidad (alta pureza en menos pasos).
Interacción hidrofóbica cuyo principio de separación es por hidrofobicidad.
Electroforesis es una técnica de separación de moléculas con carga en una matriz porosa bajo la aplicación de un campo eléctrico. La matriz es un polímero entrecruzado de tamaño regulable. El principio de separación es por carga y tamaño. El revelado se hace con agentes intercalantes que se insertan entre las bases de ADN o ARN. Hay dos tipos principales de electroforesis:
Electroforesis en gel de agarosa: Corrida horizontal (matriz sostenida por enlaces no covalentes). Para separación de polinucleótidos. Preparativa o cuantitativa. Debo colocar un buffer de corrida.
Electroforesis en gel de poliacrilamida: Corrida vertical. Separación de proteínas y oligonucleótidos pequeños. Preparativa o cuantitativa y con mayor resolución. En moléculas de ADN la carga es proporcional al tamaño, a mayor cantidad de bases más carga negativa. Para obtener este efecto en proteínas se usa SDS. Como este detergente tiene carga negativa, al unirse a una parte hidrofóbica y formar una hidrofílica compensa la relación carga – tamaño. Hay que tener en cuenta que el SDS rompe los enlaces disulfuro.
Cromatografía en columna