31783

Vista previa del material en texto

Carlos Ayala Tesis Doctoral 
CAPÍTULOl 
"Determinación de grado alcohólico en bebidas alcohólicas 
Dor espectrometría FTIR, utilizando un sistema de flujo que 
incorpora una etapa de extracción líquido-líquido en línea" 
49 -----------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
Resumen: 
En el presente trabajo se desarrolló un procedimiento simple y directo para la 
determinación de etanol en bebidas alcohólicas, basado en un sistema de análisis en flujo 
que utiliza a la espectrometría infrarroja de transformada de Fourier (FTIR) como forma de 
detección. El procedimiento propuesto incluye la extracción líquido-líquido -en línea- del 
etanol en cloroformo desde una solución acuosa, utilizando una celda tipo sándwich 
equipada con una membrana de teflón. El método propuesto, no requiere ningún 
tratamiento previo de la muestra (con excepción de la desgasificación simple de las 
muestras de cervezas y dilución de las muestras de mayor grado alcohólico). Para la 
cuantificación del etanol se seleccionó como criterio de medida la absorbancia en los 
máximos de absorción ubicados en 1046 cm-1(cervezas) y 877 cm-1 (vinos y bebidas 
alcohólicas fuertes), corregidas mediante líneas de base establecidas entre 1174 - 935 cm-1 
y 935 - 844 cm- l , respectivamente. Las características analíticas del sistema: Banda: (877 
cm -1): Intervalo dinámico: 0,20-15 % (v/v), límite de detección y cuantificación: 0,06 y 
0,20 % (v/v), precisión: (DER < 0,9 %; [Etanol] = 5 % (v/v); n = 5); Banda: (1046 cm -1): 
Intervalo dinámico: 0,08-7,50 % (v/v), límite de detección y cuantificación: 0,025 y 0,080 
%(v/v), precisión: (DER < 0,8 %; [Etanol] = 5 % (v/v); n = 5), y una frecuencia de análisis 
de 20 muestras por hora, resultaron adecuadas para la aplicación propuesta. Los estudios de 
adición de estándar y de recuperación indicaron que el método es exacto, y está libre de 
interferencias. El método propuesto fue aplicado para determinar el etanol en diferentes 
bebidas alcohólicas como cervezas sin y con alcohol, vinos, ron, whisky y bebidas 
espirituosas. En consecuencia, la metodología representa una alternativa válida para la 
determinación de etanol en las bebidas alcohólicas, y podría ser adecuada para el análisis de 
control de rutina. 
Palabras claves: Etanol, Bebidas alcohólicas, Análisis en flujo, FTIR, Extracción líquido-
líquido. 
50 ----------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
Resumen Gráfico: 
Ha"""o, 
(-) MuestrG deUl'\leztl. 
(-) SohJcién QtUGso5%(v/v). 1-1c.,..,=_Espectr~::;;.:.o.:.FTI.;.:;.R.:./M.:.I.:.R;.;(T:;.;.:ra.:.n",,::;;jsi.:.6n.:.);..._.., I 
(-) Muestra de vino roJO. l' 
.~ 8) Dilución (Bebidas de mayor FrA-FTIR 
•
& i . -
~, , ' A '1, A) DesgOSifiC4, ció. (Cervezas) 
- i grodo alcohóhco) _ 
8ebidos ~ 
alcohólicos j;;:? 
Anlilisls de muestras reales. 
11._ Reftralcio (EtanaQ (l!(y/v» 
Cervezu SIn alcohol 1 ~O.25 O,l5±O,o1 
Cervua ~¡n cdr;ohol 2' 0.50 0,51"'"0,01 
Q:1'Ve%Qt'1po 112.,3 4.00 4..05:<-0.05 Ce....,.. ¡1:Kn4 4..., 4,45+0,05 
Cerveza tlp{) tlstn 6 .po 5,OO±-O,O6 /'1- __ ~? 
CervemtlDQ IJsen6 6,00 6,00-1-0.05 
Vino ro (1 1 Upo U,2.t.o,oa " 
V1nobkmeo 1 6.00 S,30o!- 0,05 
Vodka 1 40,0 4O,5-tO.3 
..,,1 40,0 40,1:<-0,3 
Whiskyt 40,0 42,2 j;: 0.4 
........ 1 40,0 39.9---0.4 ¡-, 
Aguardiente 1 40,0 41.2"0,3 V 
Característieas Analitlcos 
Respuesto Uncal (0,20-15'" (v/v)l(O,08-7.S'It ("Iv) 
Litnitc de detuc:iÓl'l (30') 0,06'" (vfv)lO,0Z!5 .... (V/Y) 
(877 cm ~1/1046 cm-1) 
Fneucnc:IQ de onólisls 20 inyacdones h-1 
Precisl6n (DER) y exactitud 
Rccupcroci6n (96 - 104") 
Rapctibllidad 
(8T7 cm -1/1046 c:tn-1) 
(0,9 .. I O,S"Xn = 5) 
Critulo de evoIuodón. Absorba:nciCl Itn los móximos de 
absorción ubicados en 1046 c:m~.t. '1 877 ctn".t. 
l046cm I 
1100 JO~m_l°00 950 900 850820 
51 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
Introducción. 
El alcohol es un compuesto orgánico que contiene el grupo hidroxilo unido a un radical 
alifático. Los alcoholes alifáticos son depresores del Sistema Nervioso Central (SNC); 
siendo el etanol, o alcohol etílico (CH3-CH2-0H), uno de los más utilizados; principalmente 
en la fabricación de bebidas alcohólicas. Tiene olor agradable, es incoloro, se disuelve 
fácilmente en agua y tiene bajo peso molecular (46 gr ¡mol). Se distribuye con rapidez por 
los líquidos corporales y tiene marcado carácter reductor (1). 
Se puede deftnir por bebida alcohólica, toda aquella bebida que contiene alguna 
cantidad de etanol. Una clasiftcación muy utilizada las agrupa en dos grandes bloques: 
fermentadas y destiladas. Sin embargo, muchos prefieren clasiftcarlas según su tipo: vinos, 
cervezas, licores, aguardientes, whiskies, etc. La ingesta de una pequeña cantidad diaria de 
alcohol no perjudica a las personas; sin embargo, no es recomendable iniciarse en el hábito 
de su consumo. Desde la antigüedad se obtenía el etanol por fermentación anaeróbica de 
una disolución con elevado contenido en azúcares con levadura y posterior destilación. En 
el transcurso de la destilación hay que desechar la primera fracción que contiene 
principalmente metanol, que se forma en procesos secundarios. Aún hoy, éste es el único 
método admitido para obtener etanol para el consumo humano. No obstante, para fines 
industriales el método de obtención preferido es por hidratación del etileno (H2C=CH2) (2). 
Las bebidas alcohólicas son muestras complejas que presentan componentes volátiles, 
responsables del aroma y el sabor; así como compuestos no volátiles, que consisten de una 
gran variedad de sustancias con diferentes características (3). 
El etanol que se utiliza en la fabricación de bebidas alcohólicas, tiene en todos los 
países más impuestos que el de uso industrial; por ello es necesaria una clara distinción 
entre ambos. La diferenciación se logra afiadiendo al de uso industrial ciertas sustancias 
como metanol o gasolina de aviación que le hacen inservible para la fabricación de bebidas, 
recibiendo entonces el nombre de alcohol desnaturalizado. El alcohol etílico se clasifica 
desde el punto de vista médico, como hipnótico, por sus efectos; y por ser el menos tóxico 
de los alcoholes. 
Además, se encuentran presentes pequeñas cantidades de numerosas substancias tóxicas 
- reguladas por las normativas vigentes- de las que destaca por su toxicidad y su historia, el 
metanol. El alcohol metílico (CH3-0H) es volátil, de olor similar al etanol, pero con un 
52 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
sabor más fuerte y menos agradable. Se obtiene por destilación de la madera y es frecuente 
en las destilaciones de los últimos productos de la uva. La concentración de metanol en los 
vinos, sobre todo tintos, varía y depende de factores como tipo de vid, maquinaria, tiempo 
de maceración, temperatura y adición de enzimas, entre otros. Es un tóxico muy potente y 
no puede (debe) utilizarse para el consumo humano; porque su intoxicación produce 
ceguera y muerte. El metanol y el etanol son muy similares en su aspecto y en algunas de 
sus propiedades: olor, sabor, densidad, etc. Esta condición favorece el fraude, al mezclar 
ambos alcoholes o adicionar metanol a las bebidas alcohólicas. Esta adulteración es común 
y se ve potenciada por tres condiciones referidas al alcohol metílico: i) su costo es inferior 
al del alcohol etílico, ii) no se encuentra gravado por impuestos y iii) su control, dada la 
diversificación de su mercado, es muy dificil (l). 
En este punto, es importante aclarar que el metanol puede estar presente en las bebidas 
comerciales, en concentraciones inferiores a los índices establecidos en la legislación 
vigente. Evidentemente, esta condición no está garantizada en las destilaciones caseras y 
por supuesto, en las destilaciones fraudulentas. 
Por otra parte, también es importante resaltar que el etanol tiene muchas aplicaciones en 
el mundo actual, fuera del ámbito de las bebidas alcohólicas. Se utiliza ampliamentecon 
fines culinarios y en muchos sectores industriales. Es un buen disolvente, y se emplea como 
anticongelante, combustible industrial y doméstico. En el uso doméstico se emplea el 
alcohol de quemar, que no es más que etanol desnaturalizado con metanol o piridina. 
Algunos países como Brasil, afiaden etanol a la gasolina para bajar la importación de 
petróleo, dando lugar a la alconafta. Este país es uno de los principales productores (con 14 
mil millones de litros anuales), con lo cual reducen un 40 % de sus importaciones de crudo. 
Esta última aplicación se extiende también cada vez más en otros países para cumplir con el 
protocolo de Kyoto. Estudios del Departamento de Energía de USA indican que el uso en 
automóviles reduce la producción de gases de invernadero en un 85% (2). La industria 
química lo utiliza como compuesto de partida en la síntesis de diversos productos, como el 
acetato de etilo (el mismo actúa de disolvente para pegamentos, pinturas, etc.), el éter 
dietílico, etc. También se aprovechan sus propiedades desinfectantes. 
A través de los años, la evaluación del contenido de etanol en bebidas alcohólicas se ha 
convertido en un problema de gran importancia; no solo porque determina la calidad y 
53 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
conservación del producto, sino también por razones económicas y sociales, especialmente 
relacionadas a los impuestos establecidos sobre el alcohol en diferentes países. Por estas 
razones se requiere la evaluación del grado alcohólico con un alto grado de precisión y 
exactitud. Por ejemplo, en el Reino Unido, el estado exige que el contenido de alcohol en 
las bebidas sea detenninado con un exactitud de ± 0,05 % (v/v) (4). Este tipo de análisis se 
realiza en muchos laboratorios, no solo por parte de los productores sino también por parte 
de dependencias gubernamentales. 
Por lo general, la determinación del grado alcohólico se lleva a cabo por métodos 
oficiales, que se fundamentan en la medición de propiedades fisicas como la densidad o el 
índice de refracción, después que las muestras han sido sometidas a un proceso simple de 
destilación (5,6). También se han desarrollado métodos basados en volumetrías redox (7). Sin 
embargo todos estos procedimientos son lentos, tediosos y consumen mucho tiempo. Por 
esta razón, se han desarrollado diversos métodos instrumentales que ofrecen alternativas 
validas para la detenninación rápida y precisa de etanol. Entre ellas destacan el uso de 
técnicas de separación como la cromatografía tanto en fase liquida (8) como en gaseosa (9), 
aunque también se ha descrito el uso de técnicas electroanaIíticas como la potenciometría 
(10), polarografia de pulso diferencial (11); y otras como la espectroscopia de resonancia 
magnética nuclear (12, 13). Sin embargo, en líneas generales, estos métodos requieren 
instrumentación de elevado costo de adquisición y mantenimiento. En este panorama, 
muchos investigadores han trabajado en el diseño de nuevas alternativas para el análisis de 
etanol, proponiendo nuevas estrategias en las que destacan tres o cuatro aspectos: i) análisis 
directo (sin pre-tratarniento de la muestra), ii) el uso de instrumentación de bajo costo 
(costo de adquisición y mantenimiento), iii) tiempo de análisis corto (alta frecuencia de 
análisis) y iv) automatización del procedimiento. 
En ese camino, para la determinación de etanol en muestras con bajo contenido 
alcohólico, los métodos enzimáticos han demostrado ser muy exitosos, proporcionando 
excelente sensibilidad y precisión (14), basados en la oxidación del etanol a acetaldehído en 
presencia de aldehído deshidrogenasa. Adicionalmente se han propuesto métodos que se 
fundamentan en la oxidación del alcohol deshidrogenasa en presencia de la coenzima 
NAD+, otros han utilizados las enzimas como agentes disolvente o inmobilizadores (15), en 
estos casos se monitoreo la reducción de la coenzima, para ello se utilizaron diferentes 
54 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
técnicas de detección como la fluorescencia y la espectro fotometría. Además, pueden ser 
fácilmente automatizados incorporando sistemas de análisis en flujo en el diseño 
metodológico (16). 
La espectrometria Infrarroja de transformada de Fourier (FTIR) es una técnica versátil 
que proporciona importante y valiosa información cualitativa y cuantitativa acerca de la 
composición de la muestra y los efluentes cromatográficos (17). En los últimos 10 años ha 
tenido un gran auge, ya que ha sido muy utilizada para el análisis directo de muestras 
complejas, sin ningún tratamiento previo. Además, ha demostrado ampliamente su utilidad 
y versatilidad como detector en los sistemas de flujo (18). 
La espectrometria Infrarroja es una técnica poderosa para la determinación de etanol; y 
en ese sentido se han desarrollado diversos procedimientos tanto en el infrarrojo cercano 
(NIR) como en el infrarrojo medio (MIR). El NIR ofrece la posibilidad de determinar 
etanol en presencia de agua ya que se puede trabajar con celdas comunes de vidrios o 
cuarzo con amplios pasos ópticos (16, 19). En contraste, en el MIR se requiere el uso de 
celdas equipadas con ventanas resistentes al agua y con pasos ópticos pequeños (b ~ 0.05 
mm), para reducir la fuerte absorción de radiación IR por parte del agua (20,21). 
Existen algunos precedentes sobre el uso de la espectrometría infrarroja para la 
determinación de etanol en bebidas alcohólicas en ambas regiones espectrales (NIR y 
MIR); que se han desarrollado básicamente bajo filosofias distintas. En el año 1993 un 
grupo de investigadores españoles encabezados por Miguel de la Guardia (16), propusieron 
un procedimiento para la determinación de etanol en todo tipo de bebidas alcohólicas. El 
método se basa principalmente en el uso de la primera derivada del espectro de absorción 
en el infrarrojo próximo. Las muestras no requieren de ningún pretratamiento previo, solo 
una desgasificación para las cervezas y una simple dilución para las muestras de mayor 
contenido alcohólico. La figura 1 presenta el espectro en el NIR del etanol absoluto que se 
obtiene utilizando una celda de vidrio de 1 mm de paso óptico con diversas referencias. 
Como se puede observar, en la región comprendida entre 1670 y 1740 nm hay tres bandas 
bien defmidas que pueden ser identificadas con claridad, aún en presencia de agua. Sin 
embargo, los investigadores encontraron serios problemas de interferencias por parte de la 
matriz al momento de tratar de establecer una línea de base apropiada para la 
cuantificación. Este inconveniente fue resuelto utilizando la primera derivada del espectro 
55 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
de absorción (ver figura 2). El método propuesto se aplicó al análisis de muestras 
comerciales de cervezas, vinos, ron ginebra, vodka, whisky, entre otras, y los resultados 
fueron comparables con los indicados en las etiquetas de las muestras. 
A B 
1.50 0.150 
0.075 
1.00 
A 
0.50 
-0.075 
-0.150 
1640 1680 !nO 1760 
1100 1300 
lID 
1500 Wavelenglhlnm 
Figura l. Espectros NIR de etanol absoluto en agua utilizando como referencia: A) Tetracloruro de 
carbono y B) Agua 
0.120 
0.080 
-0.040 
-0.080 L-...-----"'--''-:----__ --L ______ ...J 
1640 1680 . 1720 
Wavelengthlnm 
1760 
Figura 2. Derivada de primer orden correspondientes a los espectros en el 
NIR obtenidos a partir de estándares acuosos de etanol de 10,12 y 15 (% 
(v/v» (-) y muestra de vino (---) con una concentración aproximada de 
etanol de 12,5 (% (v/v», con un paso óptico de 1 mm. De la Guardia y 
colaboradores (16). 
Un año más tarde estos investigadores utilizan la misma filosofía de trabajo, la 
espectroscopia derivativa, para afrontar este tipo de análisis pero en el infrarrojo medio 
(MIR); y publican el trabajo titulado "Derlivative Fourier transform infrared 
56 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
spectrometric determination of ethanol in alcoholic beverages" (20). La figura 3 ilustrael 
montaje instrumental utilizado; el procedimiento desarrollado fue aplicado para la 
determinación directa de etanol en diferentes muestras de licores desde cervezas hasta 
aguardientes. La metodología propuesta se basa en la medida de la derivada de primer 
orden del espectro de absorción en el MIR, entre el pico de 1052 cm-t yel valle de 1040 cm 
-1 
La figura 4a presenta los espectros FTIR correspondientes al blanco ( agua), una 
solución estándar de etanol al 10 % (v/v) y algunas de las muestras analizadas; mientras la 
figura 4b muestra las representaciones correspondientes a la derivada de primer orden de 
dichos espectros. El método propuesto presenta características analíticas adecuadas para la 
determinación del alcohol en diferentes bebidas alcohólicas. Es importante destacar que en 
este trabajo, para las muestras que presentaban alto contenido de azúcares como los vinos, 
fue necesario realizar una evaluación previa del contenido total de azúcares a través de la 
medida de la derivada de primer orden del espectro entre 1164 y 1147 cm -1 y realizar la 
respectiva corrección de la interferencia negativa que producen los azucares en la 
cuantificación del etanol entre 1052 cm-} - 1040 cm -1. 
A 
MUESTRA 
B 
AGUA MUESTRA 
o 
BOMBA 
o 
BOMBA 
DRENAJE 
~ MICRO CELDA 
~DEFLU"'O 
DRENAJE 
Figura 3. Montaje experimental utilizado Gallignani y colaboradores (20). 
57 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
0.95 0.70 
eA 
l' 
l' 
b 
0.75 I~I 0.42 ¡.! 
.., I 
t.I ¡i~1 = 0.55 r' 0.14 = I~\ -= .> :s j" I~ ~ .E I '\ 
< 0.35 I . -0.14 \ 
\, l \ 
\\\t:/ , 0.15 ' . 
L,:' -0.42 
,., 
-0.05 I , , , I -0.70 +-1200 1150 1100 1050 1000 I 1197 1147 1097 IO·ti 92~ 
Wavenumber (cm-1) Wavenumber (cm-l ) 
Figura 4. a) Espectros de absorción FTIR obtenidos para el blanco (agua) y algunas muestras 
analizadas. b) Derivadas de primer orden corres~ndientes a los diferentes espectros 
mostrados en la figura 4a. Gallignani y colaboradores ( ). 
En los trabajos que se han descrito, tanto en el NIR como en el MIR, resulta evidente 
que los azúcares presentan un serio inconveniente, ya que afectan -interfieren- claramente 
las bandas de absorción del etanol. Las estrategias que se han propuesto para solventar ese 
problema incluyen la simulación de matriz, el uso de la espectroscopia derivativa y 
calibraciones binarias o ternarias que toman en cuenta el efecto etanol-azúcares. 
Para dar solución a este problema de una forma más definitiva y contundente, 
recientemente se han propuesto métodos de análisis desarrollados bajo la óptica de la 
Quimiometría, a través del uso de los modelos de calibraciones multivariables para el 
tratamiento de la data espectral obtenida por vía de la espectrometría IR. A manera de 
ejemplo, Luque de Castro y colaboradores publicaron un trabajo titulado, "Comparison 
and joint use of near infrared spectroscopy and Fourier transform mid infrared 
spectrocopy for the determination of wine parameters" (22). Estos investigadores 
propusieron una metodología para la determinación de etanol y otros parámetros 
etnológicos -densidad, acidez, glicerol, índice total de polifenoles, ácido láctico, y dióxido 
de azufre total- que son de importancia y caracterizan a los vinos. Para ello, realizaron la 
determinación de los diferentes componentes por espectrometría infrarroja tanto en el 
infrarrojo cercano (NIRS) como en el infrarrojo medio (FT-MIR), y los resultados obtenidos 
fueron tratados estadísticamente combinando dos técnicas quimiométricas conocidas como 
el análisis del componente principal (peA) y la regresión parcial de mínimos cuadrados 
58 ---------------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
(PLS). En general, se obtuvieron mejores resultados por NIRS que por (FT-MIR) debido a la 
menor relación sefial/ruido obtenida en la región del NIR. 
Por su lado, Alison Nordon y colaboradores (4) propusieron una metodología bajo la 
misma filosofia, pero en esta oportunidad utilizaron además de la técnica de espectrometria 
infrarroja en el NIR, la espectrometría Raman. Para el análisis de la data espectral del NIR 
utilizaron un método combinado de algoritmos (PCA-PLS); mientras que los datos 
obtenidos mediante espectroscopia Raman fueron tratados por el método clásico 
univariado. El más reciente de los trabajos publicados siguiendo esta línea de investigación 
(marzo del 2006), fue desarrollado en Brasil por Araujo y colaboradores (3). Ellos realizaron 
una clasificación de bebidas alcohólicas destiladas y analizaron sus posibles adulteraciones 
por espectrometría infrarroja en el NIR. Debido a la complejidad de las muestras, la 
caracterización de las mismas se llevó a cabo utilizando técnicas quimiométricas como el 
análisis del componente principal (PCA) y la analogía flexible independiente del modelo 
de clase (SIMCA). El método propuesto resultó ser una estrategia atractiva y poderosa en la 
clasificación y verificación de adulteraciones en bebidas como: ron, brandy, vodka, whisky, 
entre otros. Tanto las muestras puras como adulteradas fueron clasificadas con un 95 - 100 
% de confidencia 
El serio inconveniente que representan los azúcares para la determinación de etanol por 
espectroscopia IR fue abordado por otros investigadores bajo una óptica totalmente distinta; 
y más radical: la eliminación de los azúcares de la matriz, por vía de una etapa de 
separación. Las estrategias utilizadas se pueden agrupar en dos bloques: 
a) Volatilización del analito mediante una etapa de calentamiento. En este caso se plantea la 
volatilización del analito así como la volatilización total o parcial de la matriz. 
b) Separación del analito mediante un procedimiento de una extracción liquido-liquido. 
En el año 1996, De la Guardia y colaboradores (23) publican el trabajo "Vapour 
generation-Fourier transform infrared direct determination of ethanol in alcoholic 
beverages" en el cual desarrollan a plenitud la primera estrategia. La propuesta 
metodológica es muy simple, y se fundamenta en la introducción de un microvolumen (1 
J.lL) de muestra dentro de un reactor que ha sido previamente calentado a una temperatura 
adecuada. En esas condiciones, el analito (el etanol) se volatiliza y se separa de los 
componentes no volátiles de la matriz, especialmente los azúcares. La fase gaseosa 
59 ----------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
generada se transporta por un gas de arrastre (N2) a la celda de gases IR, en donde se 
registran los espectros FTIR en función del tiempo, el montaje experimental usado se 
muestra en la figura 5. Para este trabajo se utilizó una celda de múltiples reflexiones 
Wilmad modelo 3.2, provista de ventanas de SeZn, con un paso óptico de 3,2 m y un 
volumen interno de 100 mI. El etanol muestra en el MIR una serie de bandas interesantes 
desde el punto de vista analítico, entre las cuales los autores seleccionaron la banda de 1050 
cm -1 para la cuantificación del analito, utilizando como criterio de medida la absorbancia 
corregida entre 950 y 1150 cm -1 números de onda. El método desarrollado no presentó 
problemas de interferencias por parte del vapor de agua y de los azucares. En cuanto a las 
características analíticas del sistema obtuvieron un limite de detección de 0.02% (v/v) y una 
desviación estándar relativa que oscila entre 0,11 Y 0,5% para un análisis de 5 muestras 
independientes. Con una frecuencia de análisis de 51 inyecciones por horas. Este sistema 
fue propuesto para la determinación directa de etanol en bebidas alcohólicas como 
cervezas, vinos, entre otras. Y los resultados presentaron buena concordancia con los 
obtenidos por diversos métodos de referencia establecidos (NIR-IR y procedimientos 
picnométricos ). 
Figura S. Diagrama esquemático del sistema propuesto de análisis por inyección en flujo-
generación de fase gaseosa y espectrometría infrarroja de transformadade Fourier (AIF-GFG-
FTIR). 
En relación a la segunda estrategia de trabajo, Tipparat y colaboradores (24) propusieron 
un método simple para la determinación de etanol en licores utilizando como forma de 
detección la espectroscopia de absorción de radiación en el infrarrojo cercano. La 
metodología desarrollada está basaba en un acoplamiento entre la técnicas de Análisis por 
Inyección en flujo (FIA) y la espectroscopia infrarroja. En la propuesta, inicialmente la 
60 
------------------------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
muestra de licor es sometida a una extracción liquido-liquido manual con cloroformo; y a 
continuación la fase orgánica es introducida en un canal de cloroformo de un sistema 
simple FIA, monocanal, que fluye continuamente a través de la celda de flujo con un paso 
óptico de lmm (ver figura 6). Para la cuantificación del analito -etanol- se monitoreo las 
bandas de absorción de 2305 y 2636 cm -1. El procedimiento propuesto fue aplicado para la 
determinación de etanol en licores comerciales en Tailandia. Los porcentajes de 
recuperación obtenidos por estos investigadores, fueron bastantes sastifactorios para las 
muestras claras. Sin embargo, las muestras coloreadas presentaron valores muy altos y ellos 
se lo atribuían a posibles interferencias por parte de los agentes responsables del color y el 
sabor que contenían las diferentes muestras. Los análisis realizados fueron comparados con 
los obtenidos utilizando la técnica de cromatografia de gases, y no encontraron diferencias 
significativas entre los valores obtenidos con los dos métodos. 
P 
s---+-+----, D 
1---- \V 
1 
COMPUTER 
Figura 6. Di~ama esquemático del sistema utilizado por Tipparat y 
colaboradores (24. 
Está bien establecido que el etanol presenta una elevada solubilidad en cloroformo; un 
solvente orgánico con amplias zonas de transparencia en el IR medio. Por otra parte, las 
bandas de absorción más intensas del etanol, localizadas en 1046 cm -), 1086 Y 877cm -1, se 
encuentran en una de las regiones de transparencia de este solvente. 
Estas tres condiciones permiten esbozar una nueva estrategia de trabajo para la 
determinación de etanol en bebidas alcohólicas, utilizando a la espectrometría infrarroja de 
transformada de Fourier (FTIR) en el IR medio como técnica de detección. Es importante 
destacar que los avances de la química analítica en cuanto a sistemas automatizados han 
permitido mejorar las diferentes metodologías mediante diversos acoplamientos. Por 
ejemplo, la hibridización entre la técnica de análisis en flujo (FA) y la espectrometría 
61 ----------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
infrarroja de transformada de Fourier (FTIR) (25-29), ha aportado una serie de ventajas entre 
las que destacan: a) un llenado rápido y sencillo de las celdas de flujo de IR, b) menor 
manipulación de las muestras por parte del operador, c) mínimo consumo de solventes, d) 
determinación simultánea de varios componentes en una misma muestra, o de varias bandas 
de absorción de un mismo analito, e) monitoreo continuo de la línea de base espectral, f) 
determinación exacta y precisa del máximo de la banda de absorción, g) drástica reducción 
en el tiempo de análisis y h) automatización del procedimiento de análisis (30). 
El objetivo de este trabajo es desarrollar una metodología analítica automatizada 
alternativa para la determinación de etanol en bebidas alcohólicas basada en el 
acoplamiento de un sistema de análisis por inyección en flujo (FIA) con la espectrometría 
FTIR. El método involucra un proceso de extracción cuantitativa -en línea- de etanol en 
cloroformo, utilizando una celda de extracción líquido-líquido tipo sándwich equipada con 
una membrana de Teflón. 
El procedimiento FIA- FTIR que se propone representa una excelente opción, ya que 
permite la automatización del método, reduce drásticamente el consumo de solventes, el 
tiempo de análisis y la manipulación de la muestra. Por otra parte, el proceso de extracción 
en línea proporciona una ventaja importante, ya que induce la separación del analito de la 
matriz; y por esa vía elimina de entrada a los azucares, que son, como se explicó con 
anterioridad, los principales interferentes en la determinación de etanol en el infrarrojo 
medio en este tipo de muestras. Adicionalmente, el cambio de solvente (de agua a 
cloroformo) permite incrementar el paso óptico; lo cual se traduce directamente en un 
incremento de la sensibilidad analítica Por todo esto, la metodología propuesta representa 
una alternativa interesante y válida para la determinación de etanol en bebidas alcohólicas 
que puede ser implementada para el control de calidad rutinario de este tipo de muestras. 
Parte experimental. 
Instrumentación. 
Todos los espectros de absorción fueron adquiridos con un espectrómetro de absorción 
de radiación Infrarroja de transformada de Fourier (FTIR) Perkin Elmer, modelo Spectrum 
2000 (Nolwack, eT. USA). El control del equipo, así como la adquisición y procesamiento 
de los espectros se llevo a cabo con dos softwares, el Spectrum 2000 y el TR-IR ("Time 
base- Time resolved infrared"), 
62 ----------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
La figura 7a, muestra el diagrama esquemático del sistema de Análisis de Inyección en 
Flujo con detección por Espectrometría de Infrarrojo de transformada de Fourier (FIA-
FTIR) utilizado para el desarrollo de este trabajo. 
En este montaje experimental, para realizar el acoplamiento descrito, se emplearon dos 
bombas peristálticas (Pi y P2) de cuatro canales Ismatec IPC (Glattburg, Suiza) dotadas con 
tubería de Tygon y VitonR, tres canales para propulsar la muestra / estándar (CM), la 
solución portadora, agua, (CPort) y el agente extractante, cloroformo, (CClor); un serpentín de 
reacción -extracción- (R); una válvula de Inyección (VI) Reodyne que permite la 
introducción de la muestra (Alltech, Waukegan, USA), una celda de extracción líquido-
líquido (CE) y un espectrofotómetro FTIR. El diagrama utilizado fue ensamblado en su 
totalidad a partir de equipos y accesorios comerciales, con la excepción de la celda de 
extracción líquido-líquido que es de fabricación casera (figura 7b). Esta unidad es de tipo 
sándwich y representa una modificación del separador propuesto por Kuban (31). La celda 
incluye una entrada para la introducción de la solución resultante de la mezcla de la 
muestra y el cloroformo que se produce en el serpentín de extracción y dos salidas: una 
para la fase orgánica que se dirige a la celda infrarrojo, y la otra que conduce a la fase 
acuosa al desecho. Además el diseño incorpora 8 tornillos para el ajuste adecuado de la 
membrana entre los dos bloques de nylon. 
63 ----------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
A 
VI 
C_ R 
l' c:FZR 
CE 
B 
l· 6Dmm 
(1) (4J 
~)<i 
T 
cf3) 41!J mm 
~ 
VIiIIo~ (5) 
!I o e 
• • • 
e~' @-~, ""l=.~<"",é ~ill ~, ' 
• :1 • 
e 
Figura 7. (a): Diagrama esquemático del sistema FIA-FTIR propuesto. P¡, P2: bombas 
peristálticas, CM: Canal de la muestra/estándares, CPort: canal del portador (agua), Celor: canal del 
agente extractante (cloroformo), R: serpentín de reacción, VI: válvula de Inyección, CE: celda de 
extracción líquido-líquido, CFIR: celda de flujo para infrarrojo; FTIR: espectrómetro infrarrojo 
de transformada de Fourier. (b): Detalles de fabricación de la celda de extracción (1) entrada del 
canal que transporta la mezcla hidro-alcohólica a la celda, con tomillo, (2) bloques de nylon, (3) 
membrana de teflón, (4) canal para el transporte de la fase acuosa al drenaje, con tornillo y (5) 
canal para el transporte de la fase orgánica a la celda de medida, con tomillo. Las condiciones 
experimentales de trabajo se indican en la tabla l. 
Reactivos y muestras.Todos los reactivos utilizados en este trabajo fueron de grado analítico. El solvente 
usado como agente extractante fue el cloroformo (CHCh) de grado HPLC de Mallinckrodt 
(Paris, Francia). Sin embargo, previo al análisis el solvente fue secado por varias horas 
sobre CaCh anhidro BDH (Poole, Inglaterra). Se utilizó alcohol etílico (99,5% v/v) grado 
analítico de T. J. Baker (Xalostoc, México) para la preparación de los estándares, los cuales 
se prepararon a diario con agua destilada y des-ionizada (DI) obtenida de un sistema Milli-
Q SP TOC (Water. Millipore, Milford, MA, USA). 
64 
Carlos Ayala Tesis Doctoml 
Las muestras analizadas fueron bebidas alcohólicas comerciales con un contenido de 
etanol que oscila entre « 0,5 y 42 % (v/v», que se encuentran disponibles en el mercado 
nacional. 
Metodología propuesta. 
Inicialmente los reactivos y muestras fueron introducidas a través de los respectivos 
canales a temperatura ambiente como se muestra en la figura 7, bajo las condiciones de 
operación que se indican en la tabla l. La bomba peristáltica (P2) permanece encendida 
durante todo el análisis para propulsar de forma continua a la solución portadora (CPort), y al 
agente extractante (CClor). 
El sistema FIA-FTIR propuesto en este trabajo involucra cuatro pasos: i) introducción 
de la muestra al sistema, ii) extracción en línea del etanol en la fase orgánica y la 
separación de las fases orgánica y acuosa por medio de la celda de extracción líquido-
líquido, iii) adquisición del respectivo espectro de absorción FTIR y iv) tratamiento de los 
espectros. 
Al iniciar cada sesión experimental de trabajo se debe establecer la señal de fondo -el 
"background" - del sistema. Para lograr este propósito se propulsan de forma continua agua 
y cloroformo por los canales del portador (CPort) y del extractante, cloroformo (CClor), 
respectivamente, hacia R, y se obtiene de esta manera el "background" y el espectro 
correspondiente al blanco del sistema mediante la acumulación y ponderación de 5 
espectros. 
La inicialización del sistema, definición de la señal de fondo, y adquisición del espectro 
del blanco- toma un tiempo aproximado de 2 min, y en este punto el sistema esta listo para 
el análisis. Este paso se realiza sólo al comienzo de cada sesión experimental. 
En la secuencia 1, se llena el bucle de inyección utilizando la bomba peristáltica, 
colocando la válvula de Inyección en posición de carga. Esto permite la introducción 
selectiva de los estándares o muestras (CM) en el sistema. De esta forma, la solución 
contentiva del etanol se mezcla en línea con el cloroformo en R; donde el analito es 
extraído cuantitativamente dentro de la fase orgánica. A continuación -en el camino hacia el 
detector- la mezcla de la fase acuosa y la fase orgánica establece contacto con la membrana 
de Teflón de la celda de extracción. En este proceso, la fase orgánica atraviesa la membrana 
65 ----------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
y fluye de forma continua hacia la celda (CFIR), mientras que la fase acuosa va 
directamente al drenaje (ver fig. 8). 
La verificación del blanco del sistema se puede realizar en cualquier momento, 
adquiriendo el espectro de absorción del blanco, entre la medida de dos muestras o 
estándares cualesquiera, durante el ciclo de limpieza. 
Agua 
Fase acuosa 
A~ua --t ~II!~---~~== --t Desecho 
Cloroformo ... Membrana 
__ --t Celda 
"'"-----.. Fose orgánica 
Figura 8. Proceso de separación entre la fase orgánica y acuosa en el interior de la 
celda de extracción. 
En este punto (secuencia 2), se adquiere el espectro FTIR de la solución resultante del 
etanol en cloroformo. La secuencias previamente descritas (1 y 2) se repiten cuando se 
analiza la misma muestra o estándar. Un ciclo completo del procedimiento descrito, 
incluyendo el paso de limpieza, requiere cerca de 4 mino 
66 ----------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
Tabla l. Condiciones experimentales de operación del sistema FIA-FTIR propuesto. 
Especfrómetro de Absorción Infrarrojo (FTIR). 
Fuente de radiación 
Detector 
Divisor de haz 
Intervalo espectral 
Resolución 
Criterio de medida: 
Sistema de Análisis en Dujo. 
Fuente para el infrarrojo medio MIR (Perkin 
Elmer) 
MCT 
KBr extendido 
4500- 600 cm -1 (1200 -800 cm -1) 
2cm-1 
Banda analítica: 877 cm-I y 1046 cm-I 
Criterio de medida: 
Banda Analítica: 877 cm -1 
Máximo de absorción de la banda de 877 cm-I 
con corrección de línea de base establecida 
entre 935 y 844 cm-l. 
Banda Analítica: 1046 cm-1 
Máximo de absorción de la banda de 1046 cm 
-1 con corrección de línea de base establecida 
entre 1174 y 935 cm-l. 
Wilmad: Celda de transmisión estándar, de 
geometria rectangular, utilizada como celda de 
flujo. 
Ventanas rectangulares de ZnSe (38xl9x2 
mm). 
Paso óptico: 0,5 mm. Este parámetro se fIja 
mediante un es aciador de Te ón. 
Composición del canal portador (CP01tt) Agua destilada 
Volumen de Inyección 1 mi 
Flujo del canal portador (CPOJtt) 0,25 ml/min 
Flujo del canal de la muestra/estándares (CM) 0,25 ml/min 
Composición de la muestra:(CM) Muestras comerciales de bebidas alcohólicas. 
Composición de los estándares (CM) Estándares acuosos de etanol: 0,01 -15 % (v/v) 
Flujo del canal del agente extractante (CClor) 0,32 ml/min 
Cloroformo 
100 cm (0,8 mm de diametro interno). 
Composición del canal extractante (CClor) 
Longitud del serpentín de reacción (R) 
Celda de extracción Celda de nylon (6Omm x 20mm), con una 
membrana de teflón TF-450 de 0,45 J.1ffi de tamailo 
de poro. El volumen interno es de 140 J.ll y el área 
efectiva de la membrana es de 76 mm2• 
67 ------------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
Resultados y discusiones. 
Estudios preliminares. 
La optimización del sistema propuesto de FIA-FTIR se llevó a cabo por el método 
univariado, que consiste en variar un parámetro a la vez. Sin embargo, tras la selección de 
cada parámetro se chequeo la validez de los valores previamente seleccionado. Para la 
evaluación de cada parámetro se utilizó una solución de etanol de 5 % (v/v), así como una 
solución de muestra problema de concentración aproximada. 
Caracterización espectral. 
Espectro del solvente (cloroformo). Def"mición de la señal de fondo. 
El cloroformo es un solvente orgánico, que en la región del infrarrojo medio presenta 
amplios intervalos de transparencia que pueden ser utilizadas para la determinación de 
etanol (ver figura 9a). El C2HsOH presenta una solubilidad elevada en cloroformo, lo cual 
permite la extracción del alcohol en cloroformo. Por otro lado, el cloroformo es muy 
transparente en la región comprendida entre 1200 y 800 cm-I ; zona donde se presentan las 
bandas de absorción del etanol. En la figura 9b, se muestra el fondo (background) que se 
obtiene utilizando el sistema propuesto FIA*FTIR, con un paso óptico de 0,5 mm. Como se 
puede observar, el blanco obtenido es prácticamente ideal: limpio y plano. 
lOO 
!Il 
%T 
60 
4l 
lO 
.ooJJl 4DJ mJ lIJ(I) 
_1 
A 
IjI) um «lI 
1,Ill 
1.8 
1~ 
1,4 
l,l 
1~ 
o,¡ 
0,6 
~ ~4 
D,2 ----
~~~~--~~~--~~~~ 
~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ m ~ 
... 1 
Figura 9. a) Film de c1orofonno puro. b) Espectro de c1orofonno obtenido en el sistema propuesto FIA-
FTIR. 
68 
--------------~------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
Espectro del etanol (C2H,OID. 
El espectro FTIR de etanol absoluto muestra tres bandas interesantes desde el punto de 
vista analítico, como se puede observar en la figura 10. Una banda intensa centrada en 1046 
cm -1 y otras dos de mediana intensidad centradas en 1086 Y 877cm -1, respectivamente. Las 
absorciones de 1086 Y 1046 cm -., corresponden a la vibración de tensión simétrica y 
asimétrica del enlace C-O, características de un alcohol primario (p- OH). La otra banda sedebe a vibraciones de flexión del enlace O-H, fuera del plano (877 cm -1) (32). 
2,00 
~ 1,8 
1\ 
* 
1,6 1I 
1 I 
1,4 
1 1 
I I 
1,2 
!\ 
: I 
I I 
1,0 I \ 
A f \ ¡ I 
o.s 
LA 
( \ I \ 
I \ I 1 1'. 
) 
, 
.... J \ 1\ 0,6 ( ~ 11 
I \ I \ 0.4 
~ 
I '\ I , ---- .... " .... ----' -- -- -'" 0.2 
0,00 
1~0 1200 1150 1100 1050 1000 950 900 850 800,0 
cm,.! 
Figura 10. Espectro FTIR (1250-800 cm .1) en film de cloroformo puro (-) de etanol (---), 
Inserto: Molécula de etanol, (Gris: Carbono; Rojo: Hidrogeno; Azul: Oxigeno), 
La figura 11 muestra, en forma comparativa, los espectros FTIR obtenidos partir de 
soluciones de 1 y 5 % (v/v) de etanol preparadas en cloroformo y en medio acuoso. (Los 
espectros solo incluyen las bandas de 1046 y 877 cm-1). La figura lla corresponde a 
soluciones de etanol preparadas directamente en cloroformo, mientras las figuras 11 b y 11 c 
corresponden a soluciones acuosas en las que se realizó la extracción con cloroformo, fuera 
de línea y en línea, respectivamente, Como se puede observar, los espectros son muy 
similares; y no se observan diferencias significativas en la forma de las bandas. No 
obstante, sí contrastan con el espectro obtenido a partir de etanol absoluto (figura 10), ya 
que la banda de 1086 cm -) en los espectros mencionados anteriormente, prácticamente 
desaparece y se observa como un pequefio hombro de la banda de 1046 cm -l. Esto puede 
tener su origen en interacciones intermoleculares entre el analito y el solvente. 
69 --------------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
En la literatura especializada se encontró que las bandas de 1046 cm -1 y 1086 cm -1 
han sido extensamente utilizadas para la cuantificación de etanol en soluciones acuosas (20, 
21,33,34), principalmente por razones de sensibilidad, mientras que la banda de 877 cm -1 
solo ha sido usada en un sistema en fase gaseosa (35). El poco uso de la banda de 877 cm -1 
en fase acuosa se debe principalmente a que el agua presenta una intensa absorción 
alrededor de 890 cm -1 lo que la descalifica para esta aplicación. 
B 
1,11 
I,t 
I,J 
~ ~ ~ 
llII,I UI 111 IR 111 11 11 IIIIlt,1 1'" UI 111 111 l1li 111 JI 1111,1 !2II,t lIS l1li 18 111 flI JI IIII1l.t,1 
~ ~ ~ 
Figura 11. Espectros FTIR obtenidos partir de: blanco (-), solución de 1 o/o(v/v) de etanol (- ... ), y 
5(o/o(v/v» (---) de etanol; a) en clorofonno; b) solución acuosa de etanol de concentración similar 
extraída en fonna manual (off-Iine) y c) en el sistema propuesto FIA-FTIR (on-Une). 
La figura 12 muestra los espectros obtenidos mediante el sistema propuesto de una 
solución acuosa de etanol alS %(v/v) y de muestras reales (cerveza, vino rojo, ron blanco y 
whisky). En ella se observa que los espectros correspondientes a la solución patrón y la 
muestra de cerveza son muy similares. Sin embargo, en la banda localizada en 1046 cm -1, 
las muestras de mayor grado alcohólico -y coloreadas- mostraron una pequeño hombro 
alrededor de 1020 - 1030 cm -1, indicativo de la presencia de posibles interferentes por 
parte de la matriz. Esta observación concuerda con los resultados presentados por Tipparat 
y colaboradores (24\ quienes reportan porcentajes de recuperación muy inconsistentes en el 
análisis de muestras con estas características. 
Sobre la base de estos resultados preliminares se decidió utilizar la banda de 877 cm-) 
para la cuantificación del etanol en la mayoría de las bebidas alcohólicas (vinos y bebidas 
alcohólicas fuertes), ya que la sensibilidad analítica que proporciona esta banda es 
70 ------------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
adecuada para abordar el análisis. Sin embargo, para el caso de las cervezas, se prefirió el 
uso de la banda de 1046 cm-I , ya que su mayor sensibilidad permite abordar el análisis de 
las cervezas, especialmente aquellas con un bajo nivel alcohólico. Es este punto es 
importante resaltar que en esta banda no se observó ninguna diferencia significativa entre el 
espectro correspondiente al patrón y las muestras. 
A 
2,00 
1.8 
1,6 
1,4 
1,2 
1,0 
0.8 
0,6 
0,4 
1046 ctn -1 
8n ctn -1 
-0,1 ..... --_--_--_--_-~_-_~-_-_ 
1200,0 1150 1100 1050 1000 950 900 850 820,0 
cm-l 
Figura 12. Espectros FTIR de diferentes muestras comerciales de bebidas alcohólicas. 
Blanco (-), muestra de cerveza 4,5%(v/v) (-), solución acuosa 5o/o{v/v), (-), muestra 
de vino rojo 12,5o/o{v/v), diluida 50 % (v/v) con DI ( ), muestra de ron blanco 40%(v/v), 
diluida 25 % (v/v) con DI (-) Y muestra de whisky ron blanco 43o/o{v/v) diluida 25 % 
(v/v) con DI (-). Bajo las condiciones experimentales de la tabla 1. 
En la figura 13a, se muestra en forma comparativa el espectro FTIR -ampliación de la 
banda de 1046 cm -1_ obtenido a partir, de soluciones acuosas de etanol al 2,5 y 5 %(v/v), 
una muestra de cerveza de concentración (~5 %(v/v) y una muestra fortificada con etanol. 
En ella se observa un crecimiento centrado de la banda de absorción, sin ningún tipo de 
alteración, lo que muestra, en principio, la viabilidad de la metodología propuesta. 
Comportamiento similar se observó en la figura 13b -ampliación de la banda de 877 cm -1_ 
entre el espectro de una solución patrón, una muestra de whisky diluida al 25 % (v/v) y una 
muestra enriquecida. 
71 ------------------------------------------------------------------
Carlos Ayala 
A 
A 
1,00 
O,!l 
0,8 
0,7 
0,6 
0,5 
0,4 
0,3 
0,2 
-',1 
1046 cm -1 
UOO,O 1158 11110 11158 10lI0 950 
cm-l 
B 
Tesis Doctoral 
1,2 
1,0 877 cm -1 
0,8 
0,6 
A 
0,4 
0,2 
-0,1 
950 900 850 820,0 
cm-l 
Figura 13. Espectros obtenidos en el sistema propuesto FIA-FTIR. a) Ampliación de la banda de 
1046 cm -1 correspondiente a: (-) blanco, (- ... ) soluciones acuosas de etanol al 2,5 y (-) 5 %(v/v), 
(-) muestra de cerveza de concentración (- 5 % (v/v» y (-) una muestra fortificada. b) ampliación 
de la banda de 877 cm -1 correspondiente a: (-) blanco, ( .... ) soluciones acuosas de etanol al (lO 
%(v/v», (-) muestra de ron diluida al (25 % (v/v» y (-) una muestra fortalecida. Las condiciones 
experimentales se indican en la tabla l. 
Criterio de medida. 
El intervalo espectral de trabajo se fijó entre 4500 y 600 cm-); aunque la data espectral 
que se estudia se restringe a la región comprendida entre 1200 y 820 cm-l. Para el presente 
trabajo se seleccionó como criterio de medida la absorbancia en los máximos de absorción 
ubicados en 1046 cm-I y 877 cm-I , corregidas mediante líneas de base establecidas entre 
1174 - 935 cm-) y 935 - 844 cm-] , respectivamente, como se ilustra en la figura 14. 
Parámetros instrumentales-espectroscópicos. 
Como se indicó con anterioridad, el método de análisis en este trabajo implica: i) 
introducción de la muestra al sistema, ii) extracción en línea del etanol en la fase orgánica y 
la separación de las fases orgánica y acuosa por medio de la celda de extracción líquido-
líquido, iii) adquisición del respectivo espectro de absorción FTIR y iv) análisis y 
procesamiento de los espectros adquiridos. 
Inicialmente se evaluó la influencia sobre la señal analítica del etanol de los parámetros 
espectroscópicos: numero de espectros acumulados, resolución nominal, etc. 
72 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
0,80 
0,7 
0,6 
0.5 
0,4 
A O,3 
0,2 
0,1 
,1046 CDl-l 
877 cna-1 -e 
0,0 ~~~::::::~::::~::::;:::~~~~~~::~~ 
-0,05 
1200,0 1150 1100 1050 1000 950 
cm-l 
900 850820 
Figura 14. Criterio de medida. Absorbancia en los máximos de absorción ubicados en 
1046 cm-l y 877 cm-l respectivamente, corregidas mediante las líneas de base 
correspondientes, establecidas entre 1174 y 935 cm-1 y entre 935 y 844 cm-1 El resto de 
las condiciones experimentales se presentan en la tabla 1. 
Número de espedros acumulados. 
Está bien documentado en la bibliografia que una de las ventajas que presenta la 
instrumentación FTIR, es la posibilidad deacumular y promediar los espectros para 
mejorar la relación señal/ruido_ El efecto de este parámetro se evaluó sobre la calidad de los 
espectros, tanto del blanco como de estándares y muestras en un intervalo comprendido 
entre 1 y 25 espectros. Es importante destacar que para llevar a cabo esta experiencia, se 
introdujo el estándar y/o muestra en el sistema bajo una modalidad continua. Los resultados 
obtenidos indicaron que para la definición del background, la acumulación de 3 espectros 
era suficiente, ya que bajo esas condiciones se obtiene un fondo limpio, claro y estable. Por 
otro lado, se puede indicar que este parámetro no presentó ninguna mejora sobre la señal 
analítica del etanol; lo cual puede ser atribuido a la transparencia del solvente en esa región 
espectral 
Resolución Nominal. 
Otro parámetro instrumental espectroscópico muy estudiado es la resolución nominal 
(35,36,37,38), debido principalmente a que afecta de manera significativa la forma de la banda 
de absorción y por ende la separación entre bandas cercanas. Por esto, se decidió evaluar la 
influencia del mismo sobre la señal analítica del alcohol etílico en las dos bandas bajo 
evaluación en el intervalo de 2 a 32 cm-l. Como se puede observar en la tabla 2 y en la 
figura 15, para las dos bandas analíticas, se observó un compartamiento similar. Un 
incremento de este parámetro causa un decrecimiento en la señal analítica, así como una 
73 ------------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
disminución del tiempo de adquisición del espectro (ver tabla 2). Por lo tanto para la 
selección del mismo, se debe llegar a un compromiso entre la sensibilidad analítica, la 
reproducibilidad y el tiempo de análisis. No obstante, en esta oportunidad se seleccionó una 
resolución nominal de 2 cm -J, dando prioridad a la sensibilidad analítica sobre los demás 
criterios mencionados. 
Tabla 2. Efecto de la resolución nominal. 
Banda 
877 cm-1 Resolución cm .1 Señal ± S (e) DER (b)(%) Tiempo (e) (s) 
2 0,346 ± 0,003 0,9 11,3 
4 0,270 ± 0,004 1,4 6,6 
8 0,231 ± 0,005 2,2 4,3 
16 0,164 ± 0,005 3,0 3,5 
32 0,083 ± 0,003 4,8 2,8 
1046 cm·1 Resoluc:ión cm -1 Sefial ± S (e) DER (b) (%) Tiempo (e) (s) 
2 0,734 ± 0,005 0,7 11,3 
4 0,572 ± 0,004 0,7 6,6 
8 0,489± 0,005 1,2 4,3 
16 0,346 ± 0,007 2,0 3,5 
32 0,176 ± 0,007 3,9 2,8 
(a) Valor medio ± desviación estándar de 5 medidas independientes de una solución de 5%(v/v). 
(b) Desviación estándar relativa. 
(e) Tiempo requerido para la adquisición de 3 espectros en el intervalo (4500 - 600 cm -1) 
A 
R __ d6ncm -1 
Figura lS. Efecto de la resolución nominal. El resto de las 
condiciones experimentales se presentan en la tabla 1. 
74 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
Estudio del paso óptico. 
El uso del cloroformo como solvente en la región espectral del infrarrojo medio, 
proporciona algunas ventajas importantes como son: la presencia de amplias ventanas de 
transparencias y con ello la posibilidad de trabajar con blancos muy limpios y con poco 
ruido. Todo esto permite trabajar con pasos ópticos mayores, condición que se traduce de 
forma directa en una mayor sensibilidad analítica En este trabajo se caracterizó 
analíticamente el sistema en las dos bandas analíticas seleccionadas, utilizando diferentes 
pasos ópticos entre 0,01 y 1,6 mm. Tras este estudio se seleccionó un paso óptico de 0,5 
mm, ya que las figuras de mérito obtenidas bajo esta condición resultaron óptimas para el 
análisis propuesto. El paso óptico en todos los casos se fijó mediante el uso de espaciadores 
de PTFE (teflón). 
Parámetros del sistema de análisis de inyección en flujo. 
En la configuración utilizada en este trabajo, la interacción entre la fase hidro-
alcohólica y la fase orgánica, así como la extracción del etanol con cloroformo se lleva a 
cabo en el serpentín de reacción (extracción). Por esto es importante fijar los caudales de 
los canales correspondientes a la muestra (CM) y el agente extractante (Celor), así como la 
longitud y el diámetro interno del serpentín. 
Efecto del sementín de extractión. 
El diámetro interno del serpentín de reacción (0,8 mm), el caudal de la muestra (QCM = 
0,25 mUmin) y el del agente extractan te (cloroformo, QCClor = 0,32 mL/min) y en general 
las condiciones de operación de la celda de extracción líquido-líquido (CE) se fijaron sobre 
la base de experiencias previas realizadas en el laboratorio (39,40). 
No obstante, se estudio la eficiencia del proceso de extracción. Para realizar esta 
experiencia se varió la longitud del serpentín (R) en un intervalo comprendido entre 10-250 
cm. Los resultados obtenidos, que se presentan en la figura 16, indican que la señal 
analítica -para las dos bandas de absorción- aumenta con la longitud de R hasta los 75 cm. 
A partir de ese punto, la señal se hace independiente de este parámetro, indicando de esta 
forma que la extracción alcanza su máxima eficiencia. Además, la comparación de los 
espectros obtenidos en batch a partir de soluciones de etanol en cloroformo, con los 
obtenidos a partir de estándares acuosos en el sistema propuesto (ver figura 13a y 13c), 
75 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
indican que la extracción es cuantitativa. Evidentemente, para valores inferiores a los 75 
cm, el tiempo de residencia no es suficiente para que se desarrolle en forma completa la 
extracción. Por otra parte, el uso de valores superiores, aumenta el consumo de muestra y 
cloroformo, e incrementa el tiempo de análisis. Sobre la base de estos resultados se 
seleccionó un valor de 100 cm para el resto del trabajo. 
0, 
1046 cm ~1 
0,6 
A 
0,4 
877 cm -1 
o~···-----'----~----~~--~~----~--~ 
O 50 100 150 200 250 300 
Loag. de serpentin de e:Dl'at. (cm) 
Figura 16. Efecto del serpentín de extracción. El resto de las 
condiciones experimentales se presentan en la tabla 1. 
Efecto del volumen de inyección. 
Otro parámetro de interés en los sistemas de análisis en flujo, es el volumen de 
inyección. Es por ello que se decidió estudiar la influencia del mismo sobre la señal 
analítica del etanol. Se realizó un experiencia para este sistema variando el volumen de 
inyección en un intervalo comprendido entre 0,25 y 5 mI, observando para ambas bandas 
un comportamiento similar, un crecimiento de la señal analítica con el incremento del 
volumen de inyección hasta 0,75m1 aproximadamente; y a partir de ese valor la señal 
alcanza un plateau, (ver figura 17). Evidentemente, el uso de valores mayores, aumenta el 
consumo de muestra y cloroformo, e incrementa el tiempo de análisis. Para el desarrollo de 
estudios posteriores se seleccionó como valor óptimo un volumen de inyección de 1 mI. 
Bajo estas condiciones, las medidas se llevaron a cabo en un forma rápida y sencilla, 
obteniéndose una señal limpia y bien dermida -de tipo transitoria- como se puede observar 
en las figuras 17b y 17c. 
76 ------------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
A B c 
1$ o,s O~ 
l\ 
1,6 0,6 0,6 • • • • 
A 
A •• .. A 
lA 
0.4 • • 0,4 • • 
1( • • D,l • • t,Z O) • • • • 
o '-' '-
\) 'v • • 
O 0,00,25 o.s ~15 IP lP VIot(ni) .JII
t ., 
O 
• 1 1 3 4 5 
VoUdlya:díI (mi) 0,0 5 10 15 20 
Op O~ 1,0 1,5 T (¡liD) 2,0 
I(IIÍJ) 
Figura 17. a) Efecto del volumen de inyección sobre la sefial analítica del etanol, b) Fiagrama del 
efecto del volumen de inyección del sistema AIF-FTIR propuesto para la banda de 1046 cm -l. c) 
Sefial tipica transitoria de stos sisitemas par un volumen de inyección de 1ml para la banda de 1046 
cm -l. El resto de las condiciones exprimentales se indican en la Tabla 1. 
Características analíticas. 
El sistema propuesto se caracterizó analíticamente bajo las condiciones experimentales 
indicadas en la tabla 1. La tabla 3 resume las figuras de mérito más relevantes. 
Tabla 3 Caracteristicas analíticas del sistema FIA-FfIR. 
Banda de Ec. De la recta a l DER c LD dLQe IDI 
absorci6n (%) (%(v/v» (%(vlv» (%(vlv» 
877 cm-I A = 4 x 10 -, + 0,0693 [Etanol ] 0,9998 0,9 0,06 0,20 0,20-15 
1046 cm-I A=3x 10-4+0,1475 Etanol ] 0,9996 0,8 0,025 0,08 0,08-7,5 
a [Etanol] en %(v/v) 
b r Coeficiente de correlación lineal de la recta obtenida 
e Equivale al valor medio ± la desviación estándar relativa de medidas independientes 
d El límite de detección se define como la concentración del analito cuya sefial analítica equivale a 3 veces la 
desviación estándar del blanco. 
e El límite de cuantificación se defme como la concentración del analito cuya señal analítica equivale a diez 
veces la desviación estándar del blanco. 
f Intervalo Dinámico: Comprende desde el limite de cuantificación (LQ) hasta el límite lineal. 
Las bandas de absorción seleccionadas para la cuantificación de etanol en bebidas 
alcohólicas fueron: (la banda analítica de 1046 cm -1 para las muestras de cervezas y la de 
877 cm -1 para las bebidas de mayor graduación). La precisión del sistema se evaluó a 
través de la medida de cinco réplicas de una solución estándar de etanol 5 % (v/v) y una 
muestra de cerveza; así como de una solución estándar de etanol 10 % (v/v) y una muestra 
de de whisky diluida al (25%(v/v». La desviaciones estándar relativas (DER) obtenidas 
77 ------------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
fueron de: 0,8 % (4,91 ± 0,04 % (v/v», 0,7 % (5,12 ± 0,04 % (v/v» y 0,7 % (9,83 ± 0,04 % 
(v/v», 0,8 % (10,21 ± 0,08 % (v/v» respectivamente. Estas medidas representan una 
medida directa de la precisión de todo el montaje instrumental FIA- FTIR. En cuanto a la 
frecuencia de análisis esta resultó del orden de 20 muestras por hora. 
Validación del método propuesto. 
Para establecer la veracidad y confiabilidad de la propuesta metodológica, se procedió a 
validar el método en base a experiencias dirigidas a estudiar posibles efectos interferentes 
por parte de la matriz y a evaluar la exactitud del método. 
Estudios de interferencias. 
Con el fm de estudiar los posibles efectos de matriz sobre la determinación de etanol, se 
realizaron estudios de adición de estándar en la modalidad de volumen de muestra 
constante, volumen de estándar variable y volumen fmal constante. Para llevar a cabo esta 
experiencia se diseñaron y prepararon un conjunto de curvas de adición estándar, las cuales 
se describen a continuación: 
• Muestra de cerveza: Se agregaron concentraciones conocidas de etanol en el 
intervalo comprendido entre ° y 7,5 % (v/v) a 0,5 mL de muestras de cervezas 
respectivamente. Las soluciones se diluyeron a un volumen final de 10 mL con 
agua des-ionizada. 
• Muestras de mayor grado alcohólico (vinos rojo y blanco, ron, whisky, vodka, 
etc.): Se adicionaron concentraciones conocidas de etanol en el intervalo 
comprendido entre ° y 15 % (v/v) a 0,5 y 2,5 mL de muestras de licores 
respectivamente; diluyendo en todos los casos a un volumen fmal de 1 ° mL con 
agua des-ionizada. 
Para evaluar el efecto de matriz en el análisis, se llevó a cabo un estudio estadístico con 
el fm de comparar la pendiente de la recta de calibrado simple obtenida a partir de patrones 
acuosos de etanol (CCS) con las diversas pendientes de las curvas de adición estándar 
diseñadas. Éste estudio corresponde al estadístico t de student (4\), el cual consiste en la 
asociación de dos variables comparando dos coeficientes de regresión o pendientes, para 
estimar con un 95 % de confianza que no existe diferencia significativa entre las pendientes 
correspondientes a las curvas: CCS y CAE. Los resultados obtenidos indican de forma 
78 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
concluyente que no existe diferencia significativa entre las pendientes bajo evaluación. Los 
fundamentos de este test estadístico y su aplicación a la población bajo estudio se presentan 
en el Anexo 1. 
Tabla 4. Estudios de inteñerencias. 
Muestras Ecuación r 8 (Et)D,g 
Cerveza A e = 0,0365 + 0,1399 [Et] 0,9998 5,11 ±0,04 
Vino rojo A d = 0,0369 + 0,0685 [Et] 0,9999 10,21 ± 0,07 
Vino blanco A d = 0,0268 + 0,0699 [Et] 0,9998 8,02 ±0,07 
Vodka A d = 0,1361 + 0,0672[Et] 0,9998 39,9 ± 0,4 
Ron A d = 0,1402 + 0,0688 [Et] 0,9999 40,3 ±0,3 
Whisky A d = 0,1445 + 0,0682 [Et] 0,9997 41,9 ± 0,3 
e ee A= 877 cm -í A = 4 X 10 -5 + 0,0693 [Et] 0,9998 
fee A= 1046 cm -1 A = 3 X 10 -4 + 0,1475 [Et] 0,9996 
(a) corresponde al coeficiente de correlación. 
(b [Et]. Representa la concentración de etanol expresada en (% (v/v» 
lEt) D,D (Et) 11,1 
4,97 ±0,04 5,01 ± 0,05 
10,77 ±O,05 11,25 ± 0,06 
7,66 ± 0,08 8,05 ±0,05 
40,5 ± 0,3 40,2 ± 0,2 
40,8±0,4 41,0 ± 0,5 
42,1 ± 0,3 41,7 ± 0,5 
(e) Curva de adición estándar 1: 0,5 mL de la muestra comercial fortalecida con cantidades conocidas de 
etanol (0-7,5 %(v/v» y llevadas a un volumen final de 10 rnL. 
(d) Curva de adición estándar 1: 0,5 rnL de la muestra comercial fortalecida con cantidades conocidas de 
etanol (0-15 %(v/v» y llevadas a un volumen final de 10 rnL. 
(e) Curva de calibrado simple entre (0-15 %(v/v». Señal analítica: Al máximo de absorbancia de la ban. 
espectro de absorción ubicada en 877 cm -l. 
(t) Curva de calibrado simple entre (0-7,55 %(v/v). Señal analítica: Al máximo de absorbancia de la ban 
espectro de absorción ubicada en 877 cm -l. 
(g) Concentración de etanol en la muestras comerciales obtenida por interpolación en la curva de calibrado 
simple. 
(h, i) Concentración de etanol en la muestras comerciales a partir de las curvas de adición de estándar 1 y 11 
respectivamente. 
Estudios de recuperación 
Para obtener una estimación preliminar sobre la exactitud del método propuesto, todas 
las experiencias previamente descritas fueron analizadas bajo la óptica de estudios de 
recuperación. En la tabla 5 se muestran los resultados correspondientes a dos muestras, una 
cerveza y un whisky. Sin embargo, este estudio se realizó para las diferentes muestras 
analizadas, obteniéndose para todos los casos porcentajes de recuperaciones cuantitativos 
(96,0 - 104,0 %). Esto indica una correcta aplicación del método y la ausencia de errores 
sistemáticos en el procedimiento utilizado; lo que demuestra la confiabilidad del método 
propuesto. 
El porcentaje de recuperación se obtuvo mediante la siguiente ecuación: 
79 ------------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
010 Recuperación = ([Analito] Encontrado - [Analito] Endógeno) X 100 
[ Analito] AJ'ladido 
Donde: 
- [Analito ] Encontrado = Contenido de analito endógeno + analito añadido. 
- [Analito] AJ'ladido = Contenido de analito conocido que se le añade a la muestra. 
- [Analito] Endógeno = Contenido de analito presente en la solución de la muestra. 
T bl SE dO d a a stu lOS e reeuperaclOn 
Muestras (EtanolJAñadido (%(v/v» (Etanol) Eneolltrldo (%(vlv)) 6: Recuperación (%) 
Cerveza Banda de 1046 cm -1 
1 a O 0,24 
2 a 0,125 0,36 96,0 
3 a 0,25 0,49 100,0 
4 a 0,5 0,76 104,0 
Sa 1,0 1,24 100,0 
6 a 2,5 2,80 102,4 
7 a 5,0 5,23 99,8 
8 a 7,0 7,20 99,4 
Whisky Banda de 877 cm -1 
lb O 1,99 
lb 1 2,98 99,0 
3 b 2 4,00 100,5 
4 b 2,5 4,49 100,0 
Sb 5 6,98 99,8 
6 b 7,5 9,48 98,6 
7 b 10 11,7 97,1 
8 b 12,5 14,6 100,9 
(a) - o 0,5 mL de la muestra comerCIal (cerveza) fortalecIda con cantidades conOCIdas de etanol (O 7 Yo(v/v» y 
llevadas a un volUDlen final de 10ml. {[Etanol1 Endógeno= 0,24 %(v/v) evaluado mediante la curva de calibración 
simple. 
(b) 0,5 mL de la muestra comercial (whisky) fortalecida con cantidades conocidas de etanol (0-15 %(v/v» y 
llevadas a un volUDlen final de IOmI. {[Etanol] Endógeno= 1,99 %(v/v) evaluado mediante la curva de calibración 
simple. 
(e) Valor medio de 5 réplicas %(v/v). 
Análisis de muestras reales. 
Las muestras descritas en las secciones anteriores, fueron analizadas por el método 
propuesto, y la concentración de etanol fue evaluada en todos los casos mediante una curva 
de calibración simple. Algunas muestras fueron evaluadas directamente(cervezas y vinos); 
en cambio las muestras de mayor graduación alcohólica fueron diluidas en un 25%(v/v) 
respectivamente, antes del análisis. En la tabla 6, se presentan los resultados obtenidos, y en 
80 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
ella se observa que no existe diferencia significativa entre estos y los valores de referencia 
reportados por los productores de las diferentes muestras analizadas. Estos resultados 
indican que la metodología desarrollada FIA- FTIR para la detenninación directa de etanol, 
puede ser utilizada como un método de rutina para el control de calidad de este tipo de 
productos. 
Tabla 6 Análisis de muestra reales. 
Muestras a Valores de referencia [Etanol) (%(v/v» G 
Cerveza sin alcohol 1 <0,25 0,25 ± 0,01 
Cerveza sin alcohol 13 <0,25 0,23 ± 0,01 
Cerveza sin alcohol 2 0,50 0,51 ± 0,01 
Cerveza sin alcohol 23 0,5 ° 0,48 ± 0,01 
Cerveza tipo pilsenl 3 4,00 4,05± 0,05 
Cerveza tipo pilsen 1 4 4,50 4,45 ± 0,05 
Cerveza tipo pilsen 1 5 5,00 5,00± 0,05 
Cerveza tipo pilsen 1 53 5,00 4,95 ± 0,05 
Cerveza tipo pilsen 1 6 6,00 6,00 ± 0,05 
Cerveza tipo pilsen 1 63 6,00 5.95 ± 0,05 
Vino rojo 1 11,00 11,2 ± 0,08 
Vino rojo 2 11,00 10,8 ± 0,08 
Vino blanco 1 8,00 8,30 ± 0,05 
Vino blanco 2 8,00 7,99 ± 0,05 
Vodka 1 40,0 40,5 ± 0,3 
Vodka 2 40,0 40,9 ±0,2 
Ron 1 40,0 40,1 ± 0,3 
Ron 2 40,0 40,1 ± 0,2 
Whisky 1 40,0 42,2 ±0,4 
Whisky 2 40,0 41,5 ± 0,5 
Brandy 1 40,0 39,9 ±0,4 
Brandy2 40,0 40,1 ± 0,2 
Aguardiente 1 40,0 41,2 ± 0,3 
Aguardiente 2 40,0 41,2 ± 0,4 
a Muestras comerciales en el pais. 
b Valor medio ± la desviación estándar de 5 medidas independientes ... 
81 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
Conclusiones. 
• En este trabajo se desarrolló un nuevo procedimiento para la determinación directa 
de etanol en bebidas alcohólicas, el cual consistió en un sistema de análisis por 
inyección en flujo utilizando la espectrometría infrarroja de transformada de Fourier 
como forma de detección. El método involucra una etapa de extracción líquido-
líquido que se realiza totalmente en línea; y en general ofrece ventajas importantes 
para el análisis químico del producto en estudio en términos de: simplicidad, 
versatilidad, rapidez, precisión y exactitud. 
• En comparación con otros métodos reportados que proponen la determinación directa 
de etanol en este tipo de muestras, utilizando espectrofotometría infrarroja, el 
procedimiento descrito permite la cuantificación del analito sin ningún tratamiento 
engorroso previo de la muestra (tan solo se requiere la previa des-gasificación de la 
cerveza o dilución de muestra de mayor grado alcohólico) y sin la necesidad de 
realizar complejos tratamientos matemáticos, corrección de los datos obtenidos o el 
requerimiento de soltwares quimiométricos. 
• 
• 
• 
• 
La metodología desarrollada involucra el uso de celdas IR de transmisión 
convencionales, evitando el requerimiento de celdas para gases, que son costosas y 
difícilmente accesibles a muchos laboratorios. 
El método puede ser adecuado para el control de calidad de este tipo de bebidas. 
La metodología propuesta es fácilmente adaptable con cualquier espectrofotómetro 
FTIR que este equipado con una celda de transmisión estándar y convencional. 
En la actualidad se están desarrollando nuevos estudios con el fin de aplicar la 
metodología desarrollada al análisis de muestras reales, así como al estudio de nuevos 
analitos. 
______________________________________________________ 82 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
Bibliografía. 
1.- Avaria P.; "Manual de bebidas alcohólicas y vinagres", España (2005). Disponible en: 
http://www.sag.gob.cl/pls/portal/docs/PAGEIPG_SAG_BIBLIOTECAlBIBL_INSYPROD/ 
BIBLIO _ INS _ VINOSIBIBLIO _ INS _ VINOS _ MANUALESIMANUAL _BEBIDAS _ ALC 
OHOLICAS.PDF. [Consulta: 2006, febrero 06]. 
2.- "Etanol". (2003) Disponible en: http://www.wikipedia.com [Consulta: 2006, marzo 06]. 
3.- Pontes M.J.C., Santos S.KB., Araújo M.C.U., Almeida L.F., Lima KA.C., Gaíao E.N., 
Souto T.C.P.; "Classification of distilled alcoholic beverages and verification of 
adulteration by near infrared spectrometry", Food Research Intemational, 39,2, 182-189. 
2006. 
4.- Nordon A., Mills A., Bum K, Cusick F., Littlejohn D.; "Comparison of non-invasive 
NIR and Raman spectrometries for determination of alcohol content of spirits", Analytica. 
Chimica Acta, 548, (1-2),148-158, 2005. 
5.- K H. Dyer K H.; "Oficicial Methods of AnaIysis" 16th ed. AOAC, MD. 1995. 
6.- Standard for Alcoholic Beverages, TISI Ministry of Industry, Bangkok, 1996. 
7.- Pilone G. J.; "Determination of ethanol in wine by titrimetric and spectrophotometric 
dichromate methods: collaborative study", Joumal Association Official Analytical 
Chemists, 68, (2), 188 - 190, 1985. 
8.- Iwachido T., Ishimaru K., Toei K.; "High performance liquid chromatographic 
determination of alcohol in alcoholic drinks with a conductometric detector", Analytical 
Science, 2, (5), 495, 1986. 
9.- Caputi A., Mooney D.; "Gas chromatography determination of ethanol in wine: 
collaborative study", Joumal of the Association of Official Analytical Chemists, 66, 1152-
1157,1983. 
10.- Kakabadse G. J., Al-Aziz M. S., Karim M. K O., Perry K, Tipping A. E.; "Direct 
potentiometry of ethanol in alcoholic beverages using ion-selective electrodes", Laboratory 
Practical, 39, 51, 1990. 
11.- Chan W.H., Lee A. W. M., Caí P. X. ; "Differential-pulse polarographic micro 
determination of ethanol and its application to beer analysis", Analyst, 117, 1509, 1992. 
83 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
12.- Guillou M., Belanche M. ; "Application of proton magnetic nuclear resonance to 
quantification of ethanol in alcoholic beverages", Connnaisance de la vigne et du vin., 23, 
215, 1989. 
13.- Guillou M., Tellier C.; "Determination of ethanol in alcoholic beverages by low-
resolution pul sed nuclear magnetic resonance", Analytical Chemistry, 60, 2182, 1988. 
14.- Lazaro F., Luque de Castro M. D., Varcarcél M.; "Individual and simultaneous 
enzimatic determination of ethanol and acetaldehyde en wines by flow injection analysis", 
Analytica Chimica Acta, 185, 57-64, 1986. 
15.- Lazaro F., Luque de Castro M. D., Varcarcél M.; "Individual and sÍmultaneous 
determination of ethanol and acetaldehyde en wines by flow injection analysis and 
immobilized enzymes", Analytical Chemistry, 59, 1859-1863, 1987. 
16.- Gallignani M., Garrigues S., De la Guardia M.; "Direct determination of ethanol in all 
types of alcoholic beverages by near-infrared derivative spectrometry", Analyst, 118, 1167-
1173, 1993. 
17.- Disponible en: http://www.deanet.itlvetrina_editori/Willey 20SiteIEAC/pdf/A0832-
W.PDF) [Consulta: 2006, febrero 06]. 
18.- Gallignani M. and Brunetto M.R.; " Infrared detection in flow analysis-developments 
and trends(review)" Talanta, 64, (5), 1127-1146,2004. 
19.- Gallignani M., Garrigues S., De la Guardia M.; " Stopped-flow near infrared 
spectrometric determination of ethanol and maltose in beers" Analytica Chimica Acta, 296, 
155-161, 1994. 
20.- Gallignani M., Garrigues S., De la Guardia M; "Derivative Fourier transform infrared 
spectrometric determination of ethanol in alcoholic beverages". Analytica Chimica Acta, 
287,275-283, 1994. 
21.- Gallignani M., Garrigues S., De la Guardia M.; "Derivative Fourier transform infrared 
spectrometric determination of ethanol in beers". Analyst, 119 (1994) 1773-1778. 
22.- Cuadrado M. U., Luque de Castro M.D., Pérez Juan P. M., Goméz-Nieto M.A.; 
"Comparison and joint use of near infrared spectroscopy and Fourier transform mid 
infrared spectrocopy for the determination of wine parameters", Talanta 66, 218-214, 2005. 
84 --------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
23.- Pérez-Ponce A., Garrigues S., De la Guardia M.; "Vapour generation-Fourier 
transform infrared direct determination of ethanol in alcoholic beverages", Analyst 121, 
923-928, 1996. 
24.-Tipparat P., Lapanantnoppakuhun S., Jakmunee J., Grudpan K.; "Determination of 
ethanol by near inftared spectrometry with flow injection", Talanta 53, 1199-1204, 2001. 
25.- Bouhsain, Z.; Garrigues, J. M.; Garrigues, S., De la Guardia M; "Flow injection 
Fourier transform inftared determination of caffeine in coffee, Vibrational Spectroscopy, 
21, 143-150, 1999. 
26.- Bouhsain, Z.; Garrigues, S.; De la Guardia, M.; "Clean method for the simultaneous 
determination of propyphenazone and caffeine in pharmaceuticals by flow injection Fourier 
transform inftared spectrometry", Analyst, 122,441-445, 1997. 
27.- Burakham R., Duangthong S., Patimapornlert L., Lenghor N., Kasiwad S., Srivichai 
L., Lapanantnoppakhun S., Jakmunne J., Grudpan K.; "Flow-injection and sequential-
injection determinations of paracetamol in pharmaceutical preparations using nitrosation 
reaction", Analytical Sciences, 20, 837-840,2004. 
28.- Schindler R., Lendl, B.; "FTIR spectroscopy as detection principIe in aqueous flow 
analysis", Analytical Communications, 36, 123-126, 1999. 
29.- Schindler R., Lendl B., Kellner, R.; "Determination of amyloglucosidase activity using 
flow injection analysis with fourier transform inftared spectrometric detection", Analyst, 
122,531-534,1997. 
30.- De la Guardia M., Garrigues S., Gallignani M.; "FA-FT-IR, A synergistic 
combination", Federation of AnaIytical Chemistry and Spectroscopy Societies (F ACSS), 
Book of Abstracts: P-0755, Manhattan, USA, May 1993. 
31.- Kubáií V.; "Liquid-Liquid Extraction Flow Injection Analysis", Analytical Chemistry, 
22, (6), 477-557, 1991. 
32.- Nakanishi K., Solomon P.; "Inftared absorption spectroscopy", 23 edition, Holden-Day, 
INC. San Francisco, 1977. 
33.- Lopéz-Mahia J., Simal Gándara J., Paseiro Posada P.; "Validation of ethanol 
determination in alcoholic beverages by infrared spectrophotometry using orthogonal and 
derivative functions to correct for water absorption", Vibrational, Spectroscopy, 3, 133, 
1992. 
85 --------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
34.- Paseiro Posada P., Simal Lozano J.; Analytical Bromatology, 36, 97, 1984. 
35.- Garrigues J.M., Pérez-Ponce A., Garrigues S., de la Guardia M., "Direct determination 
of ethano1 y methano1 in liquid samples by means of vapor phase-Fourier transform 
infrared spectrometry", Vibrational, Spectroscopy, 15,219-228,1997. 
36.- Pérez-Ponce A., Garrigues S., De la Guardia M.; "Partialleast-squares-Fourier direct 
vapor generation Fourier transform infrared spectrometric determination of ethanol in 
blood", Analytica Chimica Acta, 336, 123-129,1996. 
37.- López-Anreus E., Garrigues S., De la Guardia M.; "Vapour generation-Fourier 
transform infrared spectrometric determination of benzene, toluene and methyl tert.-butyl 
ether in gasolines", Analytica Chimica Acta, 333, 157-165, 1996. 
38.- Gallignani M., Valero M., Ayala C., Brunetto M.R., Sanchez A, Burguera J.L., 
Burguera M.; "Flow analysis-vapor generation-FTIR spectrometric determination of 
nitrite", Talanta, 64, 1290-1298,2004. 
39.- Gallignani M*, Sánchez A., Rivas R., Brunetto M.R. "Determinación 
espectrofotométrica de Plomo mediante la formación del Ditizonato de Plomo en un 
sistema de flujo". Revista de la Sociedad Mexicana de Química, Libro de Resúmenes: 
Trabajo C/377, 226. 
40.- Gallignani M*, Sánchez A., Brunetto M.R., Burguera J.L., Burguera M. "A new 
approaeh for a classical spectrophotometric mehod. F10w analysis derivative 
spectrophotometric determination o lead in gasoline with on-line liquid-liquid extraction". 
Poster 2-3. Book of Abstraet: 101. 
41.- Millar J.C. and Millar J.N.; "Estadística para química analítica". Segunda edición, 
Adison Wes1ey Interamericana, Estados Unidos, 1993. 
86 --------------------------------------------------------------
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
Anexo-l. 
Prueba estadísticas: Comparación de pendientes 
A continuación se expone la siguiente prueba de hipótesis. 
a) Hipótesis nula: llo= J.11 = J.1n 
b) Hipótesis alternativa: H1 J.1I:;t J.1n 
Donde: J.1i representa las pendientes de las diferentes curvas. 
La hipótesis nula (llo) presume que las pendientes son iguales. 
c ).- Nivel de aceptación de llo= l-a = 0,95 
d).- Estadístico de prueba: t = b1-b2/ (S1
2 / ¿ Xl + sl / ¿ X 2)% 
Donde: 
bl: representa la pendiente de la curva de calibración. 
b2: representa la pendiente de la curva de calibración. 
SI: representa la desviación estándar ponderada de la curva de calibración simple. 
S2: representa la desviación estándar ponderada de la curva de adición estándar. 
¿ XI: representa la sumatoria de los valores de concentración de la curva de calibración 
simple. 
¿ X 2 : representa la sumatoria de los valores concentración de la curva de adición estándar. 
e).- Procesamiento de datos para calcular el estadístico t, se encuentran en la tabla 7. 
f).- Zona de aceptación (ZA) para la hipótesis de igualdad de las pendientes: 
ZA: {T/-t [0,95; 8] < T < /t [0,95; 8]} 
ZA:{T/2,38 < T < /2,38} 
Los resultados de esta prueba estadística se resumen en la tabla 7. 
Tabla 7. Resultados del estadístico t- student. 
Muestras CAE- tcalculado 
Cerveza 1 0,6 
Vino rojo 1 0,4 
Vino Blanco 1 0,3 
Vodka 1 0,5 
Ron 1 0,5 
Whisky 1 0,4 
(a) Curva de adición estándar. 
---------------------------------------------------------------- 87 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
g).- Decisión: Debido a que el valor del estadístico t de student calculado, para todas las 
pruebas realizadas se encuentran dentro de la zona de aceptación (ver tabla 7), no existen 
argumentos suficientes para rechazar la hipótesis nula. 
h).- Conclusión: la prueba estadística t - student demostró que no hubo diferencias 
significativas, entre las pendientes de las diferentes curvas de adición estándar y la curva de 
calibración (p< 0,05). De esta manera, se acepta con un 95% de confianza que no existen 
interferencias tipo físico y químico por parte de la matriz. Por otro lado, tampoco se 
encontraron diferencias significativas en los valores de concentración obtenidos para la 
muestras, mediante la curva calibración simple y las diferencias curvas de adición estándar 
(ver tabla 4), lo que indica la ausencia de interferencias espectrales. 
Que no exista diferencia significativa entre las pendientes de la curva de calibración y 
las curvas de adiciones estándar, así como entre las concentraciones de etanol obtenidas a 
partir de las diferentes curvas, permite la determinación directa de este analito en bebidas 
alcohólicas utilizando la curva de calibración simple. 
________________________________________________________ 88 
Carlos Ayala Tesis Doctoral 
Anexo-2. 
Este trabajo fue presentado en: 
1.- Evento: "XIII Intemational Conference on Flow Injection Analysis (lCFIA-2005)". 24 
al 29 de abril del año (2005). Las Vegas, Nevada, USA. 
Gallignani M., Ayala c., Brunetto M.R., Burguera IL., Burguera M. "Flow Analysis-
Fourier Transform Infrared Spectrometric determination of ethanol in alcoholic 
beverages, with on-line extraction of ethanol with chloroform". 
- Modalidad de presentación: Poster 
- Book of Abstract: Poster P-IO, pp. 71. 
2.- Evento: "VII Congreso Venezolano de Química - XI Encuentro Nacional de Química 
Analítica". Universidad de Los Andes (ULA), Mérida, Venezuela. 06 al 10 de Noviembre 
del 2007. 
1 - Ayala C., Gallignani M., Brunetto M.R. "Determinación del grado alcohólico en todo 
tipo de cervezas mediante un sistema acoplado de análisis por inyección en flujo con 
detección por espectrometria infrarroja de transformada de Fourier (FIA-FTIR) que 
incluye la extracción en línea del etanol en cloroformo". 
- Modalidad de presentación: Poster. 
- Libro de Resúmenes: Trabajo AN087P. 
- Asistencia al evento. 
2 - Gallignani M., Brunetlo M.R., Ayala e "La espectrometría infrarroja como detector 
selectivo y sensitivo para la determinación de etanol en bebidas alcohólicas".