Diapositivas Clase semana 1 CinÃtica EnzimÃtica FFYB

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Todo lo referente a la organización del Módulo de Cinética Enzimática se encuentra detallado en el
campus y es importante que lean del mismo la Presentación general del módulo y el Desarrollo de cada
semana.
El tema se encuentra desarrollado en detalle en al archivo “Seminario de Cinética Enzimática” disponible
en el campus, donde cada diapositiva está acompañada de notas explicativas. A continuación se presentan
algunas diapositivas que resumen conceptos importantes del seminario, que serán aplicados a las
resolución de los problemas 4 y 5 de la Guía de Problemas y Discusión que se encuentra en la primera
sección de la “Guía de Seminario y Trabajos Prácticos”.
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Para repasar los conceptos de velocidad de reacción y equilibrio, planteamos el caso de una reacción
química sencilla NO catalizada por una enzima en la que el reactivo S se transforma en el producto P en un
solo paso. Denominamos así al reactivo porque luego hablaremos de “sustrato”, que es como se suele
denominar a los reactivos en las reacciones catalizadas por una enzima.
Se puede seguir el avance de la reacción registrando los cambios que ocurren en la concentración de S
([S]) o P ([P]) en el tiempo, como se muestra en el gráfico. Se observa que con el tiempo [P] aumenta y [S]
disminuye.
La pendiente de la tangente a la curva en cada punto es la velocidad de la reacción (v), definida como la
velocidad de aparición de P o de desaparición de S, dada por los cambios en [P] o [S] en función del
tiempo.
Para esta reacción sencilla, se puede definir la velocidad de la reacción directa (de S a P) como la [S] por la
constante de velocidad k1, y la velocidad de la reacción inversa (de P a S) como la [P] por la constante de
velocidad k-1. La velocidad de la reacción global (o neta) es la que se mide y se puede obtener a partir de la
pendiente de las curvas, y está dada por la velocidad de la reacción directa menos la velocidad de reacción
inversa.
Como se observa en las curvas, la velocidad global va disminuyendo con el transcurso de la reacción y se
hace cero en el equilibrio, donde reactivos y productos coexisten en concentraciones definidas. La
reducción de la velocidad a medida que transcurre el tiempo de reacción se evidencia por la disminución
progresiva de la pendiente de la tangente a la curva en cada punto. La velocidad global disminuye en el
tiempo porque:
1- disminuye la concentración del reactivo S a lo largo del tiempo (disminuye la velocidad de la reacción
directa)
2- aumenta la concentración del producto P con el tiempo (aumenta la velocidad de la reacción inversa).
En el equilibrio, la velocidad de generación de P es igual a la velocidad de regeneración de S. Es decir, las
velocidades de las reacciones unidireccionales directa e inversa se igualan, con lo cual la velocidad global
(o velocidad neta, velocidad de la reacción bidireccional) es cero. Es decir, la velocidad de la reacción
directa es igual a la de la reacción inversa: v+= k1. [S]eq = v-= k-1 . [P]eq
La concentración de productos y reactivos en el equilibrio definen la constante de equilibrio y, para esta
reacción sencilla planteada, la Keq se puede expresar como: Keq= [P]eq / [S]eq = k1 / k-1.
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Si bien la velocidad (pendiente en la curva de concentración en función del tiempo) va disminuyendo en el
tiempo, a tiempos cortos, la velocidad se mantiene constante.
A la velocidad que es constante en la primera parte de la reacción se la denomina velocidad inicial (Vi) o
velocidad a tiempo cero, que es la pendiente de la tangente a la curva de [P] = f(tpo) que pasa por el
origen. En la práctica la pendiente se mantiene constante (y es igual entonces a la Vi) durante un cierto
tiempo para después disminuir. Entonces, la velocidad a tiempos cortos se puede calcular como [P]/t
siempre que la aparición de P sea lineal en el tiempo durante la determinación del ensayo.
La velocidad a cada instante depende de la concentración de S remanente en ese tiempo. Como la [S] va
cambiando durante el transcurso de la reacción, y por lo tanto es difícil conocerla, una aproximación
simplificadora de los experimentos cinéticos es trabajar en condiciones de Vi. En estas condiciones, hay
muy poco S transformado en P, y por lo tanto [S]t=x es prácticamente igual a [S]t=0. De esta manera, se
puede relacionar la velocidad con la [S] inicial (que es conocida porque es lo que decidimos agregar al
tubo) si se trabaja en condiciones de Vi.
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Toda la parte de generalidades de enzimas y termodinámica está bien desarrollada en el archivo
“Seminario de Cinética Enzimática”. Aquí sólo se recuperan algunos conceptos fundamentales que se
necesitan para resolver los problemas.
Las enzimas producen un aumento en la velocidad con la que ocurre una reacción química. Que una
reacción química ocurra en un sentido dado depende de cuestiones termodinámicas (∆G de la reacción,
que dependerá de la concentración de reactantes y de la constante de equilibrio).
Las enzimas NO modifican el equilibrio de una reacción ni la dirección con la que ocurre en determinadas
condiciones, sólo aumentan la velocidad con la que ocurre.
La velocidad de una reacción catalizada por una enzima depende de muchos factores, entre ellos, de la
concentración de enzima ([E]) y de sustrato ([S]).
La velocidad inicial (Vi) aumenta tanto con la [E] como con la [S]. Sin embargo, se puede observar que si
bien Vi aumenta de forma lineal con la [E], la dependencia con la [S] sigue otra función que tiende de
forma asintótica a un valor máximo. En muchos casos, la curva que se obtiene al graficar Vi vs [S] tiene
forma de hipérbola rectangular.
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Vamos a centrarnos en las reacciones catalizadas por una enzima que siguen una cinética del tipo
“Michaeliana” (se denomina así en honor a los primeros que dedujeron una ecuación que describe este
comportamiento). Al representar la variación de Vi en función de la [S] se obtiene una curva que se puede
describir matemáticamente por la ecuación de una hipérbola rectangular: Vi= a [S]/(b + [S]), donde a y b
son constantes. A bajas [S] la velocidad aumenta drásticamente con la [S] y luego el aumento se hace
gradualmente más paulatino, hasta que a [S] muy elevadas tiende asintóticamente hacia un valor
limitante máximo y la velocidad se hace independiente de la [S].
En 1913 Michaelis y Menten propusieron un modelo sencillo que explica las características cinéticas de
muchas enzimas para las que se obtiene una hipérbola rectangular al graficar Vi vs [S], para cuyo
desarrollo se necesita un complejo específico ES intermediario en la catálisis. El modelo que propusieron
(una reacción sencilla que transcurre en dos pasos como se muestra en el esquema de reacción) es el más
sencillo de los que pueden explicar las propiedades cinéticas de muchas enzimas. Consideraron
irreversible el segundo paso y propusieron que el primer paso de la reacción se encuentra en equilibrio
rápido. Obtuvieron la ecuación que se muestra, en la que KS corresponde a la constante de disociación del
complejo ES (a < KS > afinidad). En 1925 otros investigadores (Briggs y Haldane) partiendo de una hipótesis
diferente (el estado estacionario) dedujeron una ecuación similar, que es la que actualmente conocemos
como ecuación de Michaelis y Menten, en donde la contante KM reemplaza a KS.
Al observar las ecuaciones cinéticas, se puede ver que Vi varía de forma lineal con la [E] y de forma
hiperbólica con la [S].
Para poder aplicar la ecuación de Michaelis y Menten (tanto la original como la que dedujeron Briggs y
Haldane, que es la que se acepta actualmente) se deben cumplir las siguientes condiciones:
1) trabajar en condiciones de Vi (producto generado tiende a cero)
2) trabajar con [S] >>>[E] (de modo la concentración de enzima sea despreciable frente a la de sustrato)
Teniendo en cuenta ambas condiciones, y el balance de masa para el sustrato: [S]inicial = [S]libre + [ES] + [P]
Se puede considerar que [S]libre ≈ [S]inicial ([S]o) (porque la concentración del complejo ES es despreciable
con respecto a la [S] libre, y la [P] tiende acero).
Entonces, se puede expresar Vi en función de la [S] inicial, que es un valor conocido. En la ecuación de
Michaelis y Menten no siempre se indica a qué corresponde la [S], pero teniendo en cuenta la discutido
anteriormente sería la [S] inicial. Y la [E] es la total.
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La ecuación de Michaelis-Menten describe entonces cómo se modifica la Vi con la [S] para muchas
reacciones catalizadas por una enzima.
La Vmax corresponde a la Vi que se obtendría para [S] infinita, cuando todas las moléculas de enzima están
unidas a S catalizando la reacción (esto suele denominarse “condiciones de saturación”). Entonces,
aunque se aumente la [S], no aumenta más la velocidad, porque la [E] es limitante.
Si se mira en la ecuación, cuando [S] es infinita, se puede despreciar KM en el denominador, y se puede
simplificar entonces [S], de modo que Vi es igual a k2 [E], que corresponde a Vmax.
KM es la concentración de sustrato a la cual se obtiene una Vi=Vmax/2 (en el gráfico está indicada, se puede
ver en la ecuación si se reemplaza [S] por KM: queda Vi= Vmax KM / (KM+KM) = Vmax KM / 2KM).
Como k2 se refiere a la constante de velocidad del paso ES→E+P según el esquema de reacción sencillo
planteado por Michaelis y Menten, y dado que esta ecuación se utiliza para reacciones en las que la
dependencia de Vi con la [S] sigue una función hiperbólica pero que no necesariamente transcurren por
ese mecanismo sencillo, se suele reemplazar en la ecuación k2 por kcat, que se denomina constante
catalítica. Para el modelo sencillo planteado, kcat es k2. Para reacciones más complejas con más pasos (ver
ejemplo de una reacción de tres pasos en las diapositivas del Seminario), kcat puede estar dada por otras
constantes de velocidad. En cualquier caso, kcat será la constante de velocidad de la reacción enzimática
en condiciones de saturación (cuando la [S] tiende a infinito).
Entonces, Vmax = kcat [E] y kcat=Vmax/[E].
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Los valores de KM y Vmax se pueden estimar a partir del estudio de la variación de Vi con la [S]. Como se
observa en el gráfico de Vi = f([S]), Vmax corresponde a la asíntota a la curva.
Actualmente se realiza una regresión no lineal para estimar Vmax y KM. Antes de que estuvieran disponibles
las computadoras este ajuste era muy dificultoso, por lo que se utilizaban transformaciones matemáticas
para linealizar la función y poder estimar dichos parámetros por regresión lineal.
Se muestra en la diapositiva la transformación de Lineweaver-Burk, también conocida como dobles
inversas o dobles recíprocas. Vmax es teórica y corresponde a [S] infinito (cuando 1/[S] = 0), por lo tanto
experimentalmente inalcanzable. Es necesario extrapolar la curva para obtener la ordenada al origen y
comparar con la asíntota en Vi = f([S]).
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Los parámetros cinéticos característicos para una reacción catalizada por una enzima que obedece la
cinética de Michaelis-Menten son KM y kcat, que son constantes para un mismo par enzima-sustrato.
Estos parámetros se pueden obtener a partir de ensayos en condiciones de estado estacionario,
determinando la Vi para diferentes [S] (se obtienen KM y Vmax por ajuste no lineal de la ecuación de la
hipérbola a los valores experimentales de Vi para cada [S], y se calcula kcat conociendo la [E]).
Aclaración: KM y kcat son parámetros característicos del sistema enzima-sustrato (contantes para una
misma enzima con un sustrato). Por otro lado, KM y Vmax son parámetros que describen la ecuación de la
hipérbola rectangular (curva que se grafica).
En el gráfico se muestran en rosado los puntos experimentales y en azul la curva obtenida al realizar el
ajuste no lineal de la ecuación de Michaelis-Menten a dichos puntos. Se puede ver que
experimentalmente se utiliza un rango de [S] que no siempre permite acercarse al valor de Vmax. Recordar
que Vmax es teórico ([S] infinita).
A los fines de obtener y analizar la curva de tipo “Michaeliana”, la velocidad medida deberá corresponder
a la velocidad inicial.
¿Cómo hacer para estar seguro de que la velocidad determinada es Vi?
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¿Cómo se hace en la práctica para asegurarse de que la velocidad que se determina corresponde a Vi?
- Si se mide la aparición de P a distintos tiempos, según las condiciones experimentales puede verse solo
una recta o una curva con una primera zona lineal. La pendiente de la zona lineal es Vi.
- Si, en lugar de medir la aparición de P a distintos tiempos, se mide el P generado a un solo tiempo de
reacción (para calcular Vi como ∆P/∆t), hay que asegurarse de que el tiempo de reacción utilizado esté
comprendido en el intervalo de tiempo en el cual se cumple la condición de velocidad inicial y se mantiene
la linealidad.
En el gráfico de pendiente (velocidad instantánea en este caso) en función del tiempo, se puede ver que la
velocidad permanece prácticamente constante por un tiempo (corresponde a Vi), y luego va
disminuyendo hasta hacerse cero en el equilibrio. En la práctica, según las condiciones experimentales
será la duración del intervalo de tiempo en el que se puede medir Vi y, dependiendo de los tiempos
ensayados, se podrá ver bien o no en el gráfico esta zona de pendiente constante.
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Analizaremos cómo se modifica la curva de aparición de producto en el tiempo con la concentración de
enzima (manteniendo constante la concentración de sustrato).
Primero mostramos una curva rosa, obtenida para una [E] 8 nM. En azul se indica la información que nos
interesa marcar en este tipo de gráficos.
¿Cómo cree que serían las curvas obtenidas para una concentración de enzima de 4 y 2 nM? Primero hay
que pensar en cómo se modificaría cada una de las partes que se indican:
- ¿Llegaría a la misma concentración de producto en el equilibrio? (¿de qué depende la [P]eq?)
- ¿La pendiente sería mayor o menor? (¿qué significado tiene la pendiente y cómo se modifica con la
[E]?
- ¿La duración del intervalo de linealidad sería mayor o menor?
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En el gráfico de [P] = f(tpo) se muestran las curvas simuladas para las tres [E]. Se puede ver claramente
que:
- los cambios en la [E] afectan la velocidad de la reacción
- la velocidad inicial (Vi), dada por la pendiente de la tangente que pasa por tiempo cero, aumenta
proporcionalmente con la [E] (gráfico de Vi en función de la [E] es lineal)
- la [P] en el equilibrio no se ve afectada por la [E] (depende de la Keq y de la concentración de sustrato, no
de la presencia de E ni de su concentración, recordar que las enzimas no modifican el equilibrio, sólo
aumentan la velocidad de reacción)
- a > [E] se alcanza antes el equilibrio y el intervalo de linealidad en la curva de [P] vs tiempo es menor.
Durante ese intervalo de tiempo, la velocidad se mantiene constante y corresponde a la velocidad inicial.
Recordemos que la curva de tiempo dejar de ser lineal porque disminuye la velocidad global a medida que
se consume sustrato (menor velocidad de la reacción directa) y se genera producto (mayor velocidad de la
reacción inversa). Esto al principio es despreciable y no se detectan cambios en la velocidad medida, pero
a partir de cierto momento se puede evidenciar la disminución de la velocidad y, entonces, se pierde la
linealidad en la curva de producto en función del tiempo. Entonces, para una [S] dada, el intervalo de
linealidad en la curva de producto vs tiempo aumenta al disminuir la [E] porque disminuye la velocidad y,
por lo tanto, se consume sustrato y genera producto más lentamente.
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En los gráficos de Vi vs [S] la información importante que nos interesa marcar es Vmax y KM (KM debe
coincidir con [S] para Vi=Vmax/2).
La curva rosada corresponde a un ensayo realizado con una [E] 8 nM. ¿Cómo sería la curva para una [E] de
4 y 2 nM? Se debe pensar cómo se modificarían los valores de KM y Vmax:
- ¿Se modificaría la KM por un cambio en la [E]? ¿De qué depende KM?
- ¿Se modificaría Vmax al cambiar la [E]? ¿De qué depende Vmax?
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Aquí se muestran las curvas de sustrato simuladas para tres concentraciones de enzima diferentes.
Se puede ver que al variar la [E]=
- KM no se modifica porque dependedel par enzima-sustrato, es un parámetro cinético característico de
esa reacción en particular catalizada por la enzima en cuestión, es constante para una misma enzima y
sustrato bajo determinadas condiciones experimentales.
- Como la Vmax depende directamente de la concentración de enzima (Vmax = kcat [E]t) si la concentración
de enzima disminuye a la mitad, Vmax también lo hace.
Entonces, es fundamental que en este tipo de gráficos esté bien indicada la posición de KM (que coincida
con [S] para mitad de la Vmax), y recordar que KM no varía con la [E], como sí lo hace Vmax de forma
directamente proporcional.
Por ejemplo, si para algún ejercicio o examen tuvieran que graficar a mano curvas de Vi en función de
sustrato para distintas concentraciones de enzima, conviene primero marcar en el eje Y el valor de Vmax,
luego el valor de Vmax/2, y luego el punto por el que debe pasar la curva para indicar correctamente el
valor de KM (concentración de sustrato a la cual Vi= Vmax/2).
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Ahora discutiremos cómo se modifica la curva de aparición de producto en el tiempo con la [S], dejando 
fija la [E]. Arriba a la derecha pueden ver una curva de Vi = fn([S]) en la que se indica con un punto del 
mismo color de la curva de tiempo la concentración de sustrato utilizada.
Se muestra en azul la curva correspondiente a una [S]= 15 mM
¿Cómo sería la curva para [S] 5 y 30 mM?
Se deben volver a plantear las siguientes preguntas: 
- ¿Llegaría a la misma concentración de producto en el equilibrio? (¿de qué depende la [P]eq?)
- ¿La pendiente sería mayor o menor? (¿qué significado tiene la pendiente y cómo se modifica con la 
[S]?) Mirar el gráfico de Vi vs [S] y recordar la función que lo describe, ¿cómo es la dependencia de Vi 
con la [S] para una reacción catalizada por una enzima? ¿es lineal?) 
- ¿La duración del intervalo de linealidad sería mayor o menor?
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La velocidad de una reacción depende de la [S]. Al disminuir [S], disminuye la Vi.
En este caso, si la [S] disminuye 3 veces, ¿la Vi disminuye también 3 veces? Verán en el gráfico de arriba a
la derecha que no, sino que disminuye menos de tres veces (no es lineal la dependencia de Vi con la [S]
para reacciones catalizadas por enzimas).
Dado que Keq = [P]eq / [S]eq  si disminuye la [S], disminuye la [P]eq, y lo hace de forma directamente
proporcional a la [S].
En el gráfico se ve que a > [S], > [P]eq, >Vi (pendiente) y >duración del intervalo de linealidad.
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En el gráfico de [P]= fn (tpo) se muestran las curvas para las tres concentraciones de sustrato.
En el gráfico de arriba a la derecha traten de identificar cuál sería el valor aproximado de KM (para ello,
recuerde la definición de KM).
Si se trabaja con [S] mucho mayores que KM, la Vi se va acercando a Vmax. Entonces, al aumentar la [S], la
pendiente se incrementa muy poco o casi nada, pero el intervalo de linealidad y la [P] en equilibrio siguen
aumentando.
En la curva de la hipérbola (Vi vs [S]) se marcan en colores los puntos que corresponden a las [S]
empleadas para las curvas de tiempo que se muestran abajo. La [S] de 30 mM (rosa) ya se encuentra en la
zona donde la Vi aumenta muy poco con la [S], de modo que si se aumentara aún más la [S] la pendiente
aumentaría sólo levemente.
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En esta diapositiva se ve un resumen de lo que estuvimos discutiendo.
La Vi aumenta con la concentración de sustrato ([S]), pero no lo hace de forma lineal y, para el caso de
muchas enzimas, se obtienen curvas que pueden ser descritas por la ecuación de una hipérbola
rectangular.
En el gráfico de [P] vs tiempo se muestran las tres curvas simuladas, en las que se marca el intervalo de
linealidad.
Se puede ver que la pendiente de la tangente que pasa por el origen (Vi) va aumentando con la [S], pero
este aumento no es proporcional (cada vez aumenta menos con la [S]). Esto se ve claramente en el gráfico
de Vi vs [S], donde a mayores [S] la Vi va aumentando cada vez menos hasta que cuando [S] tiende a
infinito Vi tiende a Vmax y se hace independiente de la [S].
Se puede ver que a > [S] se alcanzan niveles de [P] en el equilibrio mayores (proporcionales a la [S]).
El intervalo de linealidad aumenta con la [S] porque, para la misma cantidad de enzima, hay mayor [S]
para transformar y entonces se tarda más en llegar al equilibrio. Si bien al aumentar la [S] la velocidad de
reacción aumenta, al no ser lineal la relación entre Vi y [S], un aumento de por ejemplo el doble en la [S]
produce un aumento menor del doble en la Vi, y entonces a la enzima le lleva más tiempo catalizar la
conversión de una determinada proporción de S en P.
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Es muy importante que no confundan los gráficos de las curvas de [P] vs tiempo y Vi vs [S].
Si bien parecen tener la misma forma, para el esquema sencillo de reacción como el planteado,
la curva de [P] en función del tiempo puede ser descrita por funciones exponenciales complejas,
mientras que la curva de Vi vs [S] es una hipérbola rectangular.
Presten atención a qué información se representa en cada uno.
Si tuvieran que hacer curvas de producto en función del tiempo a mano para un ejercicio o
examen, al momento de trazar la curva deben prestar atención a la concentración de producto
en el equilibro, la pendiente de la zona lineal (Vi) y el intervalo de tiempo en el cual se mantiene
la linealidad.
En el caso en que tengan que trazar a mano curvas de Vi en función de la concentración de
sustrato, deben indicar claramente la asíntota (Vmax) y KM (que debe coincidir con la
concentración de sustrato a la cual Vi= Vmax/2).
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Pregunta 4.
Enunciado completo en de la Guía de Problemas y Discusión al principio de la Guía de Trabajos Prácticos:
Se realizó un ensayo en el que se determinó la cantidad de producto en función del tiempo de dos
preparaciones distintas de la misma enzima utilizando una concentración de sustrato 15 mM. En el
siguientegráfico se representan los resultados obtenidos.
Se obtuvo la velocidad inicial de la reacción para cada preparación ajustando la ecuación de una recta a la
zona lineal inicial de cada curva (zona en la cual se está en condiciones de velocidad inicial). El rango de
linealidad se mantuvo hasta los 10 minutos para la preparación 1 y hasta los 3 minutos para la
preparación 2. Los valores de velocidad inicial fueron:
- preparación 1: 0,25 mM/min
- preparación 2: 0,83 mM/min
a.- Sabiendo que la concentración de enzima en la preparación 1 fue de 2 μM, calcule la concentración de
enzima en la preparación2. ¿Qué consideracionesdebe tener en cuenta para realizar este cálculo?
b.- Represente en un mismo par de ejes la curva de Vi en función de [S] que se obtendría para cada una de
las preparaciones enzimáticas. Para cada curva, indique en el gráfico los valores numéricos de Vmax y de KM,
sabiendoque la KM es 1,5 mM.
El problema plantea comparar 2 preparaciones de una misma enzima (con diferente concentración de
enzima).
Observando el gráfico y los valores de pendiente, a priori puede deducirse que la [E] en la situación 2 es
mayor a 2 µM.
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Esta pregunta se puede resolver de forma muy sencilla si se recuerda que la Vi se modifica de forma lineal
con la [E] (esa sería justamente la consideración que hay que tener, que se trabajó en condiciones
experimentales en las que se cumple esto).
Se tiene el dato de la Vi obtenida para una preparación con una [E] conocida, y el dato de Vi de otra
preparación cuya [E] se quiere determinar, de modo que fácilmente se calcula la [E] en la preparación 2.
Otra forma de resolverlo es a partir de la ecuación de Michelis y Menten, ya que al tener los datos de [S] y
KM, se pueden utilizar los valores de Vi y [E] de la preparación 1 para despejar kcat y luego se puede
entonces utilizar la misma ecuación con el valor de Vi2 para calcular [E]2.
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Se pide confeccionar un gráfico con las curvas que se obtendrían al medir la Vi para distintas [S] utilizando
cada preparación de enzima.
Para ello, es necesario conocer los valores de Vmax y KM (en este problema no se cuenta con valores de Vi
para varias [S], peroKM es dato y Vmax se puede calcular).
Como se trata de un mismo par enzima-sustrato, los parámetros cinéticos característicos (KM y kcat) son los
mismos para ambas preparaciones enzimáticas, ya que son constantes para una enzima con un sustrato.
En cambio, Vmax no va a ser igual para ambas preparaciones, ya que depende de la [E].
El valor de KM es 1,5 mM, como dice en el enunciado, resta calcular Vmax. Para ello, se puede despejar
directamente a partir de la ecuación cinética que se muestra a la izquierda. También se puede calcular a
partir del dato de kcat y [E].
Si tuvieran que trazar el gráfico “a mano” para entregar un ejercicio, es importante indicar bien en el
mismo los valores de Vmax y de KM.
En este caso, para cada curva deben primero marcar en el eje Y el valor de Vmax y de Vmax/2. Luego deben
ubicar en el eje X el valor de KM, que será el mismo para ambas curvas. Por último trazan una curva que
pase por el punto de KM y Vmax/2, y que tienda asintóticamente a la Vmax correspondiente.
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Pregunta 5
Para estimar los parámetros cinéticos lo recomendado es realizar una regresión no lineal (en el campus
está disponible una planilla de cálculo con indicaciones para realizar el ajuste utilizando el complemento
solver del Excel, y un video explicativo).
En la planilla de cálculo también hay confeccionada una pestaña para realizar la transformación de las
dobles inversas (también denominadas dobles recíprocas o transformación de Lineweaver-Burk). Si no
pudieran realizar el ajuste no lineal, podrían estimar los parámetros cinéticos a partir de la linealización de
la hipérbola. Aparte, al realizar esta transformación podrán verificar que 1/Vi vs 1/[S] sigue una tendencia
lineal, lo que implica que los valores de Vi en función de las [S] indicados en la tabla pueden ser descritos
por una función de hipérbola rectangular.
Respuesta: Vmax 0,1 mM/min; KM 0,8 mM
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Se muestra una captura de pantalla de la planilla de cálculo que está disponible en el campus para
resolver la pregunta 5. En esta diapositiva en particular se muestra la pestaña diseñada para realizar el
ajuste no lineal.
En la parte de abajo se encuentran las instrucciones para realizar el ajuste utilizando el Solver.
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En esta diapositiva se muestra la pestaña diseñada para realizar la transformación de las dobles inversas.
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Leer de la Guía de Trabajos Prácticos los objetivos, introducción, descripción de la
metodología y análisis de resultados.
Para realizar un estudio de la reacción enzimática de interés en condiciones de estado estacionario y
estimar los parámetros cinéticos KM y kcat, es necesario realizar un ensayo en el que se evalúe cómo se
modifica la velocidad inicial con la concentración de sustrato (Curva Vi vs [S]). Para ello, se incubarán
distintos tubos con una [E] fija constante y [S] variable.
La velocidad inicial se calculará a partir de la determinación de cuánto producto (fosfato libre) se forma en
un tiempo dado (∆[P]/∆t). El reactivo colorimétrico Fiske-Subbarrow detiene la reacción enzimática y
permite cuantificar la concentración de fosfato libre. El tiempo de reacción será el mismo para todos los
tubos y deberá estar comprendido dentro del intervalo de linealidad de aparición de producto en el
tiempo para cada [S], de manera que la velocidad determinada corresponda a la inicial.
Para definir el tiempo de incubación, se deberá determinar la aparición de producto en el tiempo y
estimar la duración del intervalo de linealidad. Teniendo en cuenta que el intervalo de linealidad aumenta
con la [S], la curva de [P] vs tiempo se realizará con la menor [S], que sería la condición en la cual el
intervalo de linealidad es menor. Entonces, si se elige un tiempo de reacción que está comprendido
dentro del intervalo de linealidad para la menor [S], ese mismo tiempo estará también comprendido
dentro del intervalo de linealidad para las [S] mayores.
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En el primer trabajo práctico se estima el intervalo de tiempo en el cual la aparición de producto es lineal
en el tiempo, durante el cual se puede entonces determinar la velocidad inicial. Brevemente, se mide la
aparición de producto en el tiempo en medios de reacción conteniendo E y S en concentración fija. Como
la medición es discontinua (el reactivo que se usa para detectar el fosfato libre detiene la reacción), se
preparan varios tubos de reacción iguales pero con distinto tiempo de incubación.
Se ensayarán 3 concentraciones de E distintas y, para cada una, se determinará la Vi y la duración del
intervalo de linealidad. En base a los resultados, se elige con cuál concentración de E trabajar, teniendo en
cuenta cómo es el protocolo a seguir para realizar el ensayo de Vi vs [S] durante el segundo TP.
El gráfico de Vi vs [E] debe dar una recta, es el comportamiento esperado para [E] diluidas. De no ocurrir
esto, habría que revisar las condiciones experimentales, diversos factores pueden producir desviaciones.
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En el segundo trabajo práctico se determina la Vi para diferentes [S], trabajando a una concentración de
enzima fija.
A partir del ajuste de la ecuación de una hipérbola rectangular a los valores experimentales de Vi para las
[S] ensayadas se pueden obtener los parámetros Vmax y KM, y se puede calcular kcat conociendo la [E]
utilizada.
Para poder realizar dicho ajuste, hay que primero verificar que el comportamiento de los puntos
experimentales de Vi para las [S] ensayadas pueda ser descrito por la ecuación de una hipérbola
rectangular. La transformación de las dobles recíprocas (dobles inversas) puede resultar útil en este
sentido, ya que si al graficar los valores de 1/Vi vs 1/[S] los puntos ajustan a una recta, entonces los puntos
de Vi vs [S] pueden ser descritos por la ecuación de una hipérbola rectangular y, entonces, es correcto
realizar el ajuste no lineal de la ecuación de Briggs y Haldane a los valores de Vi para cada [S]. Aparte, en el
caso de que no se disponga de los medios para realizar un ajuste no lineal, la transformación de las dobles
inversas puede utilizarse para estimar los valores de Vmax y KM.
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Aquí repasaremos brevemente algunos conceptos del tema inhibición, que se encuentra desarrollado en
detalle en el archivo completo del Seminario.
Se muestra el esquema de reacción mínimo que permite plantear los mecanismos más sencillos para
explicar la inhibición reversible. El inhibidor (I) se puede unir a la enzima libre solamente, al complejo
enzima-sustrato solamente, o a ambos, como se verá en más detalle en la próxima diapositiva.
KI es la constante de disociación del complejo EI y KI´ es la constante de disociación del complejo EIS (a <
constante de disociación, > afinidad).
La inhibición reversible se clasifica según cómo se modifican en presencia del inhibidor los valores de Vmax
y KM.
Denominaremos Vmax aparente a la Vmax a la que se llega en presencia del inhibidor y KM aparente a la [S]
necesaria para obtener la mitad de la Vmax en presencia del inhibidor.
En esta diapositiva se muestra un resumen de los cambios correspondientes a cada tipo de inhibición.
Cómo se modifica cada parámetro está dado matemáticamente por el factor al que denominamos alfa
(siguiendo la nomenclatura del libro de texto Lehninger). En el cuadro se muestra la expresión de los
parámetros en presencia del inhibidor (Vmax ap y KM ap) a partir de los parámetros para la reacción sin
inhibición (Vmax y KM), y el factor alfa.
Este factor depende de la concentración del inhibidor y de la afinidad de la enzima por el inhibidor, según
la expresión que se muestra en la diapositiva.
Podemos definir un factor alfa y un alfa´, según el inhibidor se una a la enzima libre o al complejo enzima-
sustrato.
Como a <constante de disociación > afinidad, mirando la ecuación del factor se puede ver que a mayor
afinidad de la enzima por el inhibidor, mayor será el factor (alfa o alfa´).
Los efectos de cada tipo de inhibición se pueden explicar a partir de distintos modelos de reacción;
nosotros describiremos los más sencillos que pueden dar cuenta de lasalteraciones descritas en los
parámetros cinéticos.
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Las variaciones en los parámetros cinéticos dan información acerca del posible mecanismo de inhibición
en cuestión.
Se muestran a modo de resumen los modelos más sencillos que pueden explicar los efectos descritos en
Vmax y KM.
Es importante entender para cada modelo por qué se observa el efecto particular, es decir, por qué se
modifican de esa manera los parámetros.
Si el I se une reversiblemente solo a la E libre, puede ser desplazado al aumentar la [S]. De esta manera,
no se modifica la Vmax (a [S] que tiende a infinito el inhibidor no se unirá a la enzima), pero se necesita más
[S] para llegar a la mitad de Vmax (KM ap mayor que KM).
Si el I se une al complejo ES, nunca puede ser desplazado por S, entonces disminuye Vmax.
Según cómo la unión del I modifique la formación del complejo ES a partir de E y S por desplazamiento, KM
aparente puede ser mayor o menor que KM (o igual si no la modifica).
En presencia de inhibidores, en la ecuación cinética se puede directamente reemplazar Vmax por Vmax ap y
KM por KM ap.
En el archivo completo del Seminario tienen en detalle cómo se modifican los gráficos de Vi = fn ([S]) y de
las dobles inversas para cada tipo de inhibición, es importante que lo tengan claro.
Es muy importante indicar siempre las unidades. A modo de resumen se muestran en esta diapositiva las
unidades que se suelen utilizar para cada magnitud. Como ejemplo, se eligió expresar la concentración en
mM y el tiempo en minutos, pero obviamente se pueden encontrar con valores expresados en nM o en
segundos, por mencionar otras posibilidades.
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Si se grafica 1/Vi vs 1/[S], las unidades del eje Y serán, por ejemplo, min/mM o min/µmol, según cómo se
haya expresado la velocidad, y las del eje X la inversa de la concentración (por ejemplo mM-1).
La ordenada al origen tendrá las mismas unidades que el eje Y.
Las unidades de la pendiente dependerán de cómo están expresadas las unidades de los ejes X e Y.
- (min/mM)/(1/mM) = min
- (min/µmol)/(1/mM) = min mM / µmol
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