GuÃ_a de Seminario y Trabajos PrÃcticos de CE 2023 FyB

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CINÉTICA ENZIMÁTICA 
 
 
CONOCIMIENTOS REQUERIDOS: 
 
Equilibrio químico. Velocidad de reacción. Mecanismo mínimo de una reacción 
catalizada por una enzima; significado de velocidad inicial; ecuaciones de Michaelis-
Menten y de Briggs-Haldane: condiciones de aplicabilidad. Concepto de estado 
estacionario. Significado de velocidad máxima (Vmax) y constante de Michaelis-Menten 
(KM). Inhibición enzimática. 
 
BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA 
1) Nelson DL y Cox MM, “Lehninger, Principios de Bioquímica”; Ed. Omega SA, 7º 
edición (2018). 
2) Berg JM, Tymoczko JL y Stryer L, “Bioquímica”; Ed. Reverté, 6º edición (2008). 
 
 
ÍNDICE 
- GUÍA DE PROBLEMAS Y DISCUSIÓN Pág. 2 
(se discute durante el Seminario) 
- GUÍA DE PROBLEMAS ADICIONALES Pág. 5 
- GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Pág. 13 
2 
 
 
GUÍA DE PROBLEMAS Y DISCUSIÓN 
 
1.- Explique cómo se interpreta, en términos del perfil de energía libre, la acción de las 
enzimas para catalizar las reacciones bioquímicas. 
 
2.- Discuta: 
a.- Cómo se mide la velocidad de una reacción enzimática y el concepto de velocidad 
inicial. 
b.- Ecuaciones de Michaelis-Menten y de Briggs-Haldane. 
c.- Parámetros cinéticos que caracterizan la actividad catalítica de una enzima en 
condiciones de estado estacionario. ¿Cómo se determinan experimentalmente? 
 
3.- ¿Cómo se modifica la curva de concentración de producto en función del tiempo de 
reacción ([P] vs. tiempo) cuando se utilizan diferentes concentraciones de enzima ([S] 
constante) o de sustrato ([E] constante)? 
 
4.- Se realizó un ensayo en el que se determinó la cantidad de producto en función del 
tiempo de dos preparaciones distintas de la misma enzima utilizando una concentración 
de sustrato 15 mM. En el siguiente gráfico se representan los resultados obtenidos. 
 
 
0 40 80 120
0
4
8
12
16
Preparación 1
Preparación 2
tiempo (min)
[P
]
3 
 
Se obtuvo la velocidad inicial de la reacción para cada preparación ajustando la 
ecuación de una recta a la zona lineal inicial de cada curva (zona en la cual se está en 
condiciones de velocidad inicial). El rango de linealidad se mantuvo hasta los 10 
minutos para la preparación 1 y hasta los 3 minutos para la preparación 2. Los valores 
de velocidad inicial fueron: - preparación 1: 0,25 mM/min 
- preparación 2: 0,83 mM/min 
a.- Sabiendo que la concentración de enzima en la preparación 1 fue de 2 µM, 
calcule la concentración de enzima en la preparación 2. ¿Qué consideraciones debe 
tener en cuenta para realizar este cálculo? 
b.- Represente en un mismo par de ejes la curva de Vi en función de [S] que se 
obtendría para cada una de las preparaciones enzimáticas. Para cada curva, indique 
en el gráfico los valores numéricos de Vmax y de KM, sabiendo que la KM es 1,5 
mM. 
 
5.- La enzima lactato deshidrogenasa hepática cataliza la reducción de piruvato a lactato 
según el siguiente esquema de reacción: 
 
 
Se determinaron los valores de velocidad inicial en medios de reacción conteniendo 
distintas concentraciones de piruvato y NADH constante (Tabla): 
 
 
4 
 
Piruvato (mM) Velocidad (mM/min) 
0,3 
0,6 
1,0 
1,5 
2,5 
5,0 
10,0 
0,028 
0,043 
0,057 
0,064 
0,076 
0,087 
0,092 
 
Determine la Vmax de la reacción y la KM del piruvato. 
 
6.- Discuta los tipos de inhibidores enzimáticos: reversibles e irreversible. ¿Qué tipos de 
inhibidores reversibles hay y cómo se diferencian según su comportamiento cinético? 
 
7.- Discuta el objetivo y el diseño experimental de los trabajos prácticos I y II del 
módulo de cinética enzimática. 
a.- ¿Por qué se debe realizar una curva de concentración del producto en función del 
tiempo en el primer trabajo práctico? 
b.- ¿Qué concentraciones de enzima y de sustrato se utilizan y por qué? 
c.- ¿Cómo determina el tiempo hasta el cual la velocidad se mantiene constante? 
d.- Identifique las posibles fuentes de contaminación de fosfato. ¿Qué controles se 
realizan y qué información aporta cada uno de ellos? Teniendo en cuenta que en los 
experimentos de los trabajos prácticos se utilizan diferentes tiempos de reacción (TP 
I) o diferentes concentraciones de sustrato (TP II), ¿cómo se procesan los resultados 
en cada caso? 
 
 
5 
 
PROBLEMAS ADICIONALES: 
 
1.- Se determinó la cantidad de producto formado como función del tiempo en medios 
de reacción conteniendo 2 nM de enzima y dos concentraciones de sustrato distintas. 
Suponiendo que la variación de la velocidad respecto de la concentración de sustrato 
puede ser descripta por la ecuación de Michaelis-Menten y sabiendo que la 
concentración de sustrato en el experimento 1 es 100 veces mayor a KM (KM = 3 mM), 
calcule la concentración de sustrato utilizada en el experimento 2. 
 
 
Tiempo de 
reacción 
Producto Exp. 1 
(mM) 
Producto Exp. 2 
(mM) 
(min) 
0 0 0 
1 0,062 0,021 
2 0,121 0,041 
3 0,178 0,061 
4 0,237 0,082 
5 0,301 0,102 
6 0,355 0,122 
7 0,415 0,141 
8 0,474 0,160 
9 0,533 0,179 
10 0,592 0,197 
 
Construya un gráfico de velocidad inicial en función de la concentración de sustrato e 
indique en el mismo los valores de Vmax y KM. 
 
Respuesta: [S] = 1,5 mM. 
 
2.- Se representó gráficamente la velocidad inicial de una reacción enzimática en 
función de la concentración de enzima para una concentración de sustrato de 2 mM (KM 
= 1 mM). 
6 
 
 
 
a.- Calcule e indique en el gráfico la velocidad inicial para la misma concentración 
de sustrato pero concentración de enzima 0,1 µM. 
b.- Suponiendo que la velocidad aumenta hiperbólicamente con la concentración de 
sustrato calcule la velocidad inicial cuando en el medio de reacción hay 0,2 µM de 
enzima pero sustrato 0,5 mM. Represente en el gráfico anterior la variación de la Vi 
en función de la [E] en presencia de 0,5 mM de sustrato. 
 
Respuesta: a.- 100 µM/min; b.- 100 µM/min, otra recta de menor pendiente. 
 
3.- Con el objetivo de conocer el efecto que un compuesto X produce sobre la enzima Y 
se midió la actividad enzimática (Vi) de esta en medios de reacción conteniendo 
distintas concentraciones de sustrato (S), tanto en ausencia como en presencia de X 1 
mM. En ambos casos, las medidas de Vi variaron hiperbólicamente con la 
concentración de S. En la Tabla se muestran los valores de KM y Vmax obtenidos 
mediante regresión no lineal. 
 
Concentración de X (mM) KM (mM) Vmax (µM/min) 
0 2 10 
1 2 4 
 
[E] (µM)
Vi (µM/min)
0,2
200
7 
 
a.- Grafique en un mismo par de ejes la variación de Vi con la concentración de sustrato 
en las condiciones ensayadas teniendo en cuenta los valores que se muestran en la 
Tabla. 
b.- ¿Cuál es el efecto del compuesto X sobre la enzima Y? 
c.- Estime el valor de la constante de disociación del inhibidor (KI). 
 
Respuesta: b.- Inhibición mixta, caso no competitiva; c.- KI = 0,67 mM. 
 
4- Para determinar el tipo de inhibición que una serie de compuestos produce sobre la 
actividad de una enzima, se realizan ensayos en los que se determina la velocidad inicial 
(Vi) para diferentes concentraciones de sustrato ([S]), y se estiman los parámetros KM y 
Vmax por regresión no lineal, ajustando la ecuación de una hipérbola rectangular a los 
valores de Vi y [S]. 
A continuación se detallan los valores de Vi para las [S] ensayadas, para la reacción que 
transcurre en ausencia de inhibidor, o en presencia de cada uno de los compuestos. 
 
[Sustrato] 
(mM) 
 
Vi experimental (mM/min) 
Sin 
inhibidor 
En presencia del compuesto inhibidor 
A B C D E 
0 0 0 0 0 0 0 
0,3 0,025 0,012 0,018 0,011 0,012 0,008 
0,6 0,037 0,025 0,028 0,02 0,021 0,017 
1 0,051 0,030 0,034 0,024 0,029 0,023 
1,8 0,065 0,048 0,038 0,033 0,034 0,028 
3 0,074 0,061 0,044 0,037 0,041 0,035 
5 0,085 0,070 0,046 0,043 0,043 0,041 
8 0,090 0,081 0,047 0,045 0,044 0,043 
10 0,091 0,084 0,048 0,046 0,046 0,045 
 
Utilizando la planilla de cálculo disponible en el campus,pueden realizar el ajuste no 
lineal para cada set de datos, estimar los parámetros cinéticos correspondientes y, según 
8 
 
cómo se vean afectados por la presencia del compuesto en la reacción, asignar el tipo de 
inhibición que produce el mismo: 
Inhib. Competitiva (=Vmax con >KM) 
Inhib. Acompetitiva (Vmax y KM disminuyen en igual proporción) 
Inhib. Mixta - no competitiva (<Vmax con = KM) 
Inhib. Mixta con KI>KI´ (Vmax y KM disminuyen pero NO en igual proporción) 
Inhib. Mixta con KI<KI´ (<Vmax con > KM) 
 
Si no se cuenta con la posibilidad de obtener los valores de KM y Vmax de una función 
hiperbólica mediante regresión no lineal, estos valores se pueden estimar mediante la 
transformación de Lineweaver-Burk o de las dobles recíprocas (1/Vi = f (1/[S])), 
aunque el método recomendado es el ajuste no lineal. 
 
Respuesta: 
 
 Sin 
inhibidor 
En presencia del compuesto: 
A B C D E 
KM 
(mM) 
1 2 0,5 1 0,8 1,3 
Vmax 
(mM/min) 
0,1 0,1 0,05 0,05 0,05 0,05 
Tipo de 
inhibición 
--- competitiva acompetitiva mixta (no 
competitiva) 
mixta 
con 
KI>KI´ 
mixta 
con 
KI<KI´ 
 
9 
 
5- Con el objetivo de estimar el tiempo hasta el cual se puede determinar la velocidad 
inicial de hidrólisis del fenilfosfato catalizada por la fosfatasa alcalina, se midió la 
concentración de producto en función del tiempo de reacción (a 37ºC) de manera similar 
a lo que se realiza en los trabajos prácticos. En la tabla se indican las cantidades de 
enzima y sustrato en el tubo de reacción (vol. reacción 1 ml): 
 
Tubo fosfato patrón 
(µmoles) 
Sustrato 
(µmoles) 
enzima 
(µg) 
Tiempo de 
reacción 
Absorbancia 
a 710 nm 
 (min) 
1 0 - - - 0,000 
2 0,2 - - - 0,170 
3 0,4 - - - 0,325 
4 0,8 - - - 0,649 
5 1,2 - - - 0,971 
6 - 0 0 0 0,003 
7 - 0 2,5 0 0,002 
8 - 5 0 0 0,038 
9 - 5 0 30 0,085 
10 - 5 2,5 30 0,878 
11 - 5 2,5 20 0,738 
12 - 5 2,5 15 0,608 
13 - 5 2,5 12 0,518 
14 - 5 2,5 10 0,458 
15 - 5 2,5 8 0,398 
16 - 5 2,5 6 0,308 
17 - 5 2,5 4 0,218 
18 - 5 2,5 2 0,128 
19 - 5 2,5 0 0,038 
 
a.- Identifique los tubos correspondientes a: la calibración, los controles y la curva 
de tiempo. 
10 
 
b.- Construya la curva de calibración (gráfico de Abs710 nm en función de µmoles de 
Pi patrón) y obtenga la ecuación de la recta. 
c.- Calcule los µmoles de Pi en los tubos control. ¿Hay fosfatos contaminantes, de 
dónde provienen? 
d.- Calcule la hidrólisis no enzimática (HNE) para el tiempo de 30 min y estime la 
HNE para el resto de los tiempos. 
e.- Calcule la hidrólisis enzimática (HE) y realice las correcciones necesarias para 
estimar los µmoles de producto producidos por la enzima para cada tiempo. 
f.- Estime el tiempo hasta el cual es posible determinar la velocidad inicial. 
g.- Calcule la velocidad inicial. 
 
Respuesta: 
b.- Abs710 nm = 0,806 x µmol
-1 + 0,003; R² = 0,999 
c.- 
Control de: Abs 710 nm Pi (µmol) 
Buffer 0,003 0,000 
Enzima 0,002 (-0,001) = 0 
Sustrato sin incubar 0,038 0,043 
Sustrato incubado 30 min a 37°C 0,085 0,102 
El buffer y la solución de enzima no aportan fosfatos contaminantes. La solución de 
sustrato sin incubar presenta fosfatos contaminantes. A estos se les suman los 
fosfatos provenientes de la hidrólisis no enzimática producidos al incubar el sustrato 
durante 30 minutos a 37°C. 
d.- HNE 30 min: Pi (Sustrato incubado 30 min) – Pi (Sustrato sin incubar) 
Para los demás tiempos se calcula por regla de tres simple, ya que en las condiciones 
de trabajo la HNE del sustrato sigue una función lineal. 
e.- (según la cantidad de decimales considerados, pueden variar los valores, se 
sugiere utilizar una planilla de cálculos tipo Excel) 
 
 
11 
 
 
 A B C D 
Tiempo 
Abs 
710 nm Pi HNE HE + tpo 0 Producto 
 (min) (µmol) (µmol) (µmol) (µmol) 
30 0,878 1,086 0,058 1,028 0,985 
20 0,738 0,912 0,039 0,873 0,83 
15 0,608 0,751 0,029 0,722 0,679 
12 0,518 0,639 0,023 0,616 0,573 
10 0,458 0,565 0,019 0,546 0,503 
8 0,398 0,490 0,016 0,474 0,431 
6 0,308 0,378 0,012 0,366 0,323 
4 0,218 0,267 0,008 0,259 0,216 
2 0,128 0,155 0,004 0,151 0,108 
0 0,038 0,043 0,000 0,043 0 
A= Pi totales (Pi contaminantes a tiempo 0 + HE + HNE) 
B= hidrólisis no enzimática calculada para cada tiempo de reacción 
C= hidrólisis enzimática + Pi contaminantes a tiempo 0 (calculada como col. A – 
col. B) 
D= Pi correspondientes a producto de la reacción enzimática (calculada como col. C 
– Pi contaminante a tiempo 0) 
 
f.- Debe calcular el tiempo hasta el cual se puede trabajar en condiciones de 
velocidad inicial, es decir, el tiempo hasta el cual la velocidad se mantiene 
constante. Para ello, grafique la concentración de producto en función del tiempo y 
determine el tiempo hasta el que se verifica linealidad en la aparición de producto. 
 
12 
 
En el gráfico se puede observar que hasta aproximadamente 8 minutos los valores 
experimentales siguen una función lineal. 
Se puede estimar mejor el tiempo hasta el cual la velocidad se mantiene constante a 
partir de un gráfico en el que se representa la pendiente en función del tiempo. 
Calcule la pendiente teniendo en cuenta las medidas de producto en los intervalos de 
tiempo comprendidos desde el inicio (tiempo 0) hasta cada uno de los tiempos de 
reacción utilizados (incluyendo todos los puntos intermedios), y grafique. 
 
tiempo (min) 
Pendiente 
(mol/min) 
30 0,0355 
20 0,0438 
15 0,0477 
12 0,0505 
10 0,0532 
8 0,0558 
6 0,0558 
4 0,0558 
2 0,0558 
 
A partir de la tabla y del gráfico, se puede observar que la velocidad (pendiente de la 
curva de producto en función del tiempo) se mantiene constante hasta 
aproximadamente los 8 minutos. 
 
g.- Velocidad inicial: 0,0558 µmol/min 
P
e
n
d
ie
n
te
 (

m
o
l/
m
in
)
13 
 
TRABAJOS PRÁCTICOS 
 
ESTUDIO DE LA FOSFATASA ALCALINA EN CONDICIONES DE 
ESTADO ESTACIONARIO 
En los trabajos prácticos correspondientes al módulo de cinética enzimática se 
utilizará la enzima fosfatasa alcalina. Esta enzima es un dímero de PM 160.000 que, a 
pH alcalino y en presencia de iones Mg2+, cataliza la hidrólisis de ésteres fosfóricos. Su 
actividad enzimática puede determinarse utilizando fenilfosfato como sustrato, y 
cuantificando la aparición de fosfato inorgánico, uno de los productos de la reacción, 
por el método de Fiske-Subbarow. Además de utilizarse como reactivo colorimétrico 
para determinar fosfatos libres, el reactivo de Fiske-Subbarow permite detener la 
reacción enzimática, ya que por su pH ácido la enzima pierde actividad. 
 
 
 
 
Objetivo general del módulo de trabajos prácticos de Cinética Enzimática: 
Determinar la dependencia de la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina 
con la concentración del sustrato fenilfosfato en condiciones de estado estacionario. 
Alcanzar este objetivo requiere determinar la velocidad de reacción en estado 
estacionario en presencia de distintas concentraciones de fenilfosfato en el medio de 
reacción. Dado que estas determinaciones pueden ser descriptas por una función 
hiperbólica, se podrán obtener los valores de velocidad máxima (Vmax), constante 
catalítica (kcat) y constante de Michaelis-Menten (KM) ajustando a los resultados 
experimentales la ecuación de Michaelis-Menten. Para una correcta estimación de la 
velocidad de reacción es necesario asegurarse de que las determinaciones se realicen en 
condiciones de velocidad inicial. Por lo tanto, previamente, se estimará el intervalo de 
tiempo en el cual la aparición del producto aumente linealmente con el tiempo de 
14 
 
reacción (condiciones de velocidad inicial) y la cantidad de enzima a utilizar en el 
ensayo. 
 
Determinación de anión ortofosfato por el método de Fiske-Subbarow 
Consiste en determinar la intensidad del color azul desarrollado por acción de un 
reductor sobre el complejo fosfomolíbdico formado a partir de molibdato de amonio y 
el anión ortofosfato librepresente en el medio de reacción. 
En primer lugar, se produce fosfomolibdato de amonio por agregado de una 
solución nítrica o sulfúrica de molibdato de amonio a la solución que contiene anión 
ortofosfato. 
 MoO H H MoO MoO H O4
2 - +
4 3 2+  →⎯  →⎯ +2 2 
 PO + 3 NH +12 H MoO (NH ) (MoO PO H O4
3-
4
+
4 4 3 3 4 22 12 12 →⎯ +) 
Posteriormente, el complejo fosfomolíbdico es reducido por el ácido 1,2,4-
aminonaftol sulfónico, generando una mezcla de óxidos de molibdeno de color azul. La 
intensidad de dicho color es proporcional a la concentración de fosfato. La absorbancia 
del compuesto de color azul se mide en 710 nm. 
Condiciones experimentales para la reacción: La acidez óptima para esta reacción 
está comprendida entre 0,9 y 1,05 N. Si la acidez es menor, el molibdato no combinado 
se reduce y, si es mayor, se demora mucho el desarrollo de color. A temperatura 
ambiente, se alcanza el máximo de color en 5 minutos; cuando la concentración de 
fosfato es muy baja la reacción demora entre 8 y 10 minutos. 
Interferencias: 
1) Sustancias que modifiquen el pH del medio. Esta interferencia se anula 
utilizando una concentración adecuada de ácido o base. 
2) Sustancias oxidantes que interfieran con el agente reductor. El agregado de 
SO
3
Na
2
 al reductor lo hace menos sensible a los oxidantes. 
3) Sustancias que formen complejos con el ácido molíbdico. Los aniones 
oxalato, citrato, fluoruro, lactato, pirofosfato y glicerofosfato se combinan con el ácido 
15 
 
molíbdico originando compuestos estables que disminuyen la concentración efectiva de 
dicho ácido; esta interferencia puede contrarrestarse aumentando la concentración de 
molibdato. 
 
Reactivos 
Los siguientes reactivos se utilizarán para los trabajos prácticos I y II de 
Cinética Enzimática: 
a) Solución buffer: Na2CO3/ NaHCO3 0,2 M, MgCl2 30 M, pH 9,5 
b) Solución de sustrato: fenilfosfato (sal sódica) en buffer a), en concentración 2 mM 
para el TP I y en concentraciones 2; 2,8; 4; 5,6; 8; 12, 16 y 20 mM para el TP II. 
c) Solución de enzima: fosfatasa alcalina disuelta en buffer a). En el TP I se utilizarán 
por comisión tres soluciones de enzima de diferente concentración: 5; 20 y 40 µg/ml. 
Cada alumno realizará el ensayo con una solución, luego se analizarán los resultados 
obtenidos por el resto de los compañeros para las otras concentraciones de fosfatasa 
alcalina. La concentración de solución de enzima a utilizar en el TP II se obtendrá a 
partir del análisis de los resultados del TP I. 
d) Solución de fosfato patrón: K2HPO4 1 mM. 
NOTA: Las soluciones de enzima y sustrato deben mantenerse en baño de hielo hasta el 
momento de utilizarlas. 
e) Reactivo de Fiske-Subbarow 
 Molibdato de amonio 1,75% en H2SO4 3,5 N 181,4 ml 
 Reactivo reductor (*) 18,6 ml 
 Agua destilada c.s.p. 1000 ml 
 
(*) Preparación del reactivo reductor: 
 Ac. aminonaftolsulfónico 0,04 g 
 Sulfito de sodio 0,24 g 
 Bisulfito de sodio 0,24 g 
 Agua destilada 20 ml 
16 
 
TRABAJO PRÁCTICO I 
 
Objetivo: 
Determinar el intervalo de tiempo en el cual se cumple la condición de 
velocidad inicial. 
Se medirá la concentración de producto obtenido en función del tiempo en medios 
de reacción conteniendo distintas concentraciones de fosfatasa alcalina y 1 mM de 
fenilfosfato (esta última es la menor concentración de sustrato que se utilizará para 
realizar el TP II ¿por qué?). 
Siga el protocolo experimental que se muestra en la Tabla I. Las soluciones 
concentradas de sustrato y enzima deben mantenerse en hielo, el agregado de las 
soluciones a los tubos se realizará a temperatura ambiente. Es importante que todo el 
material a emplear (tubos, pipetas, vasos de precipitado, etc.) esté limpio y enjuagado 
con agua destilada. Agregar los reactivos en los tubos siguiendo el orden de las 
columnas de la tabla: primero el agua y la solución de fosfato de concentración 
conocida a todos los tubos de la curva de calibración, luego el buffer y la enzima a los 
tubos control y de reacción. La solución de sustrato se agrega a cada uno de los tubos 
justo antes de transferirlo al baño a 37 °C, siguiendo el orden y los tiempos indicados en 
la hoja de ruta. En el momento en el que el sustrato entra en contacto con la enzima y el 
tubo se pone a incubar a 37 °C comienza el tiempo de reacción para ese tubo. Para 
detener la reacción y cuantificar el fosfato liberado, añada en los tiempos indicados 3 ml 
de reactivo de Fiske-Subbarow a los tubos en el baño a 37 °C. Inmediatamente 
después, continúe agregando el reactivo de Fiske-Subbarow a los tubos que no fueron 
incubados. El tubo 20 corresponde al tiempo 0 de reacción. Mediante el agregado en 
primer lugar del reactivo de Fiske-Subbarow y luego el sustrato, se garantiza que la 
enzima no sea capaz de catalizar la hidrólisis del sustrato y, entonces, es posible 
cuantificar los fosfatos presentes en el tubo en ausencia de reacción. Retire los tubos del 
baño, deje transcurrir la reacción a temperatura ambiente durante 10 minutos y 
17 
 
determine la absorbancia en 710 nm. Mida la absorbancia de los tubos en el mismo 
orden en que se puso el reactivo de Fiske-Subbarow. 
 
Tabla I 
 
Estimación del intervalo de tiempo para la medida de velocidad inicial 
 
Tubo Agua 
(ml) 
Solución de 
fosfato patrón 
(1 mM) 
(ml) 
Buffer 
(ml) 
Solución 
de enzima 
(5, 20 ó 40 
g/ml) 
(ml) 
Solución de 
sustrato 
(2 mM) 
Tiempo de 
incubación 
a 37 ºC 
(min) (ml) 
1 1,0 - - - - - 
2 0,8 0,2 - - - - 
3 0,6 0,4 - - - - 
4 0,4 0,6 - - - - 
5 0,2 0,8 - - - - 
6 - 1,0 - - - - 
7 - - 1,0 - - 0 
8 - - 0,5 0,5 - 0 
9 - - 0,5 - 0,5 0 
10 - - 0,5 - 0,5 41 
11 - - - 0,5 0,5 40 
12 - - - 0,5 0,5 25 
13 - - - 0,5 0,5 15 
14 - - - 0,5 0,5 12 
15 - - - 0,5 0,5 10 
16 - - - 0,5 0,5 8 
17 - - - 0,5 0,5 6 
18 - - - 0,5 0,5 4 
19 - - - 0,5 0,5 2 
20 - - - 0,5 0,5 0 
 
18 
 
Hoja de ruta 
 
Tubo n° Tiempo de 
reacción (min) 
Tiempo de 
agregado de S 
(inicio de 
reacción) 
(min:seg) 
Incubación a 
37°C 
 
Tiempo de 
agregado de 
Fiske (corte de 
reacción) 
(min:seg) 
10 (S inc) 41 00:00 sí 41:00 
11 40 00:30 sí 40:30 
12 25 15:00 sí 40:00 
13 15 24:30 sí 39:30 
14 12 27:00 sí 39:00 
15 10 28:30 sí 38:30 
16 8 30:00 sí 38:00 
17 6 31:30 sí 37:30 
18 4 33:00 sí 37:00 
19 2 34:30 sí 36:30 
 
20 0 42:30 (1° Fiske) no 42:00 
 
7 (B) - - no 43:00 
8 (E) - - no 43:30 
9 (S) - 0 no 44:00 
1 - - no 44:30 
2 - - no 45:00 
3 - - no 45:30 
4 - - no 46:00 
5 - - no 46:30 
6 - - no 47:00 
 
Esta hoja de ruta indica el tiempo en que se agregará el sustrato a cada tubo (inicio de la reacción 
enzimática) y el tiempo en que se agregará el reactivo de Fiske-Subbarow (detención de la reacción 
enzimática y generación de color que permite detectar fosfatos libres). 
Se trabajará con un cronómetro que se iniciará una única vez; los tiempos indicados en la tercera y quinta 
columna de la tabla (aquellos en los que ustedes deberán agregar sustrato o Fiske a sus tubos) son los 
minutos que marcará el cronómetro. Antes de comenzar analicen detenidamente la tabla para identificar 
cómo se distribuyen los tiempos de trabajo (no corresponden a celdas consecutivas a lo largo de todo el 
experimento). Se debe iniciar el cronómetro (tiempo cero) al momento de iniciar la reacción para el tubo 
que estará más tiempo incubándose (en este caso, el tubo 10). 
Primero, los tubos deben cargarse con agua y fosfato, enzima o buffer según se indica en la Tabla I. La 
reacción en cada tubo se inicia por el agregado de 0,5 ml de sustrato (inmediatamente después se 
transfiere el tubo al baño de 37°C) y se detiene con 3 ml del reactivo deFiske-Subbarow. La lectura de 
absorbancia a 710 nm se realiza en el mismo orden de agregado del reactivo de Fiske-Subbarow.
19 
 
Análisis de los resultados: 
 
a) Construya la curva de calibración (gráfico de Abs710 nm en función de µmoles de Pi 
patrón) y obtenga la ecuación de la recta por regresión lineal. 
b) Calcule los µmoles de Pi hidrolizado por la enzima. Recuerde que los µmoles de Pi 
de los tubos de reacción deben corregirse con los obtenidos para los tubos “control”. 
Tenga en cuenta la variabilidad de los componentes de cada tubo y los diferentes 
tiempos de reacción utilizados. 
c) Grafique la concentración de fosfato en función del tiempo. 
d) Determine el tiempo hasta el cual es posible medir la velocidad inicial de la reacción 
en la condición experimental utilizada. 
e) Calcule la velocidad inicial de la reacción. 
f) Para el informe, compare y analice los resultados obtenidos para distintas 
concentraciones de enzima (ver indicaciones en el campus). 
20 
 
TRABAJO PRÁCTICO II 
 
Objetivo: 
Determinar la velocidad de hidrólisis de fenilfosfato por la fosfatasa alcalina 
en función de la concentración de sustrato y estimar los valores de velocidad 
máxima (Vmax), constante catalítica (kcat) y constante de Michaelis-Menten (KM) de 
la fosfatasa alcalina con el fenilfosfato. 
 
Procedimiento: 
Siga el protocolo experimental que se muestra en la Tabla II. Las soluciones 
concentradas de buffer, sustrato y enzima deben mantenerse en hielo. El agregado de las 
soluciones a los tubos se realizará a temperatura ambiente. Brevemente, agregar las 
soluciones a los tubos siguiendo el orden de las columnas de la tabla: primero agua y la 
solución de fosfato de concentración conocida a todos los tubos de la curva de 
calibración, luego buffer y sustrato a los tubos control y de reacción. La solución de 
enzima se agrega a cada uno de los tubos justo antes de transferirlo al baño a 37 °C, 
momento en el cual comienza el tiempo de reacción para ese tubo. Se incubarán en el 
baño un intervalo de tiempo ligeramente menor al tiempo hasta el que la velocidad se 
mantiene constante, según los resultados del TP I. Se recomienda dar comienzo a la 
reacción de los tubos aproximadamente cada 30 segundos para trabajar con mayor 
tranquilidad. De esta manera, cuando se cumple el tiempo de incubación para el primer 
tubo que se incubó (Ej: tubo 10), se detiene la reacción de ese tubo, a los 30 segundos se 
detiene la reacción del tubo 11, y así sucesivamente (en el mismo orden en el que se 
pusieron en el baño y cuando se cumple el tiempo de incubación para cada uno). 
Detenga la reacción con el agregado de 3 ml de reactivo de Fiske-Subbarow a los 
tubos en el baño a 37 °C y luego agregue el mismo volumen del reactivo a los tubos que 
no fueron incubados a 37º C. Retire los tubos del baño y deje progresar la reacción de 
color a temperatura ambiente durante 10 minutos. Determine la absorbancia en 710 nm 
de los tubos en el mismo orden en que se puso el reactivo de Fiske-Subbarow. 
21 
 
Tabla II 
 
Determinación de la velocidad inicial de una reacción enzimática 
en función de la concentración de sustrato 
 
Tubo Agua Solución Buffer Solución Solución Incubación 
 de fosfato patrón 
(1 mM) 
 de sustrato 
(X mM) 
de enzima 
(__ g/ml) 
a 37 ºC 
 (ml) (ml) (ml) (ml) (ml) 
1 1,0 - - - - no 
2 0,8 0,2 - - - no 
3 0,6 0,4 - - - no 
4 0,4 0,6 - - - no 
5 0,2 0,8 - - - no 
6 - 1,0 - - - no 
7 - - 1,0 - - no 
8 - - 0,5 - 0,5 no 
9 - - 0,5 0,5 (20 mM) - no 
10 - - - 0,5 (2 mM) 0,5 sí 
11 - - - 0,5 (2,8 mM) 0,5 sí 
12 - - - 0,5 (4 mM) 0,5 sí 
13 - - - 0,5 (5,6 mM) 0,5 sí 
14 - - - 0,5 (8 mM) 0,5 sí 
15 - - - 0,5 (12 mM) 0,5 sí 
16 - - - 0,5 (16 mM) 0,5 sí 
17 - - - 0,5 (20 mM) 0,5 sí 
 
22 
 
Análisis de los resultados: 
 
a) Construya la curva de calibración (gráfico de Abs710 nm en función de moles de Pi 
patrón) y obtenga la ecuación de la recta por regresión lineal. 
b) ¿Detecta contaminación con fosfato inorgánico del buffer, sustrato o enzima? 
c) Calcule la velocidad de hidrólisis enzimática (en µmoles/min) en cada condición 
experimental. Recuerde que los µmoles de Pi de los tubos de reacción deben 
corregirse con los obtenidos para los tubos “control”. Tenga en cuenta la variabilidad 
de los componentes de cada tubo y las diferentes concentraciones utilizadas. 
d) Si los valores de velocidad inicial varían hiperbólicamente con la concentración de 
sustrato, se verifica una relación lineal de la inversa de la Vi en función de la inversa 
de la concentración de sustrato (transformación de las dobles recíprocas). Analice sus 
resultados realizando un gráfico de dobles recíprocas. 
e) Represente la velocidad inicial de la reacción enzimática en función de la 
concentración inicial de sustrato. Obtenga la constante de Michaelis-Menten y la 
velocidad máxima por regresión no lineal y calcule la constante catalítica.