controles de calidad ( PDFDrive )

Vista previa del material en texto

CONTROLES DE CALIDAD 
Taller 3
Coordina: Andres C. García ‐ Rosa Pinto (Banco Nacional de ADN, Salamanca)
María Almeida Parra (Banco Nacional de ADN, Salamanca)
María Pérez Caro (Banco Nacional de ADN, Salamanca)
Raquel Paternain (Fundación para la Investigación Médica Aplicada, Navarra)
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Dr. Andrés C. García Montero.
Banco Nacional de ADN Carlos III- Universidad de Salamanca
12 de Noviembre de 2014
“Cuantificación del ADN. Diferencias entre 
espectrofotometría UV y fluorimetría”
ABSORBANCIA UV
www.bancoadn.org
FLUORESCENCIA
VS
Ac. nucleico Concentración (μg/ml)
dsDNA 50
ssDNA 37
ssRNA 40
A = Absorbancia
 = Coeficiente de extinción
l = Distancia en cm
c = Concentración
C = A / l
En cubeta 1 cm, 1 unidad OD (“optical density”) a  260nm
La Ley Lambert Beer describe cómo disminuye la cantidad de luz que atraviesa una solución (absorbancia) en función de:
1.- La concentración de la muestra (cantidad de material de absorción)
2.- La distancia de la trayectoria óptica
3.- El coeficiente de extinción (probabilidad de que el fotón a esa  sea absorbido por el material)
A = lc
A 260 nm de , la media del Coeficiente de extinción () :
dsDNA 0.020 (μg/ml)-1 cm-1,
ssDNA 0.027 (μg/ml)-1 cm-1,
ssRNA 0.025 (μg/ml)-1 cm-1
Primers 0.030 (μg/ml)-1 cm-1.
ESPECTROFOTOMETRÍA
www.bancoadn.org
Espectrofotómetros de micromuestras
Espectrofotómetros en placa
Espectrofotómetros de cubeta
VENTAJAS
.- barato
.- rápido
.- (poco volumen)
.- “independiente” de estándares de [DNA] conocidos
.- detecta contaminación (proteínas, c.aromáticos, sales,…)
ABSORBANCIA A260
Espectro típico de un ácido nucleótido Espectro típico de fenol
PUREZA DEL ADN
CONTROL DE CALIDAD DEL ADN
POSIBLES CONTAMINANTES:
- ADN degradado, nucleótidos, cebadores,…
- proteínas
- compuestos aromáticos (fenol,…)
- alcoholes, 
- sales (Buffer TE),…
www.bancoadn.org
LIMITACIONES
.- detecta tanto DNA íntegro como nucleótidos libres
.- límite inferior de detección >3-4 ng/ul
.- cuantificación afectada por los contaminantes
ABSORBANCIA A260
Relación de absorbancia 260/280
Se usa para establecer la pureza de una solución de ácidos nucleicos. 
El ratio 260/280 de cada nucleótido puro, si se mide independientemente, es:**
Guanina: 1.15
Adenina: 4.50
Citosina: 1.51
Uracilo: 4.00
Timina: 1.47
(**Leninger, A. L. Biochemistry, 2nd ed., Worth Publishers, New York, 1975)
Se acepta que un ratio de ~1.8 se correspondería a un ADN puro; mientras que 
para el ARN debería ser de ~2.0.
Si el ratio es sensiblemente inferior indicaría la presencia de proteínas, fenoles u 
otros contaminantes que absorben próximos a 280 nm.
www.bancoadn.org
DETECCIÓN DE CONTAMINANTES
CRITERIOS DE PUREZA DEL ADN
A260/A280
Contaminación c. aromáticos 
(proteínas, fenoles)< 1,6
1,7 – 1,9 PUREZA ÓPTIMA
> 2,1 Contaminación ARN
RELACIÓN DE ABSORBANCIAS
Espectro típico de un ácido nucleótido Espectro típico de fenol
www.bancoadn.org
DETECCIÓN DE CONTAMINANTES
CRITERIOS DE PUREZA DEL ADN
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA (0,7%):
ADN íntegro
ADN degradado
www.bancoadn.org
CRITERIO DE INTEGRIDAD DEL ADN
Picogreen ®
www.bancoadn.org
Emisión de 
FLUORESCENCIA
FLUORIMETRÍA
www.bancoadn.org
FLUORESCENCIA
VENTAJAS
.- únicamente ADN íntegro (doble cadena)
.- necesita cantidades mínimas de ADN (pg)
Picogreen ®
Curvas de calibrado: 
¡patrones de concentración conocida!
¡Cuantificación relativa!
www.bancoadn.org
FLUORESCENCIA
DESVENTAJAS
.- técnica compleja (diluciones, volúmenes pequeños,…)
.- necesita datos previos de rango de concentración
.- cuantificación relativa 
.- dependiente de estándares de [ADN] conocidos
Estudio multicéntrico: BBMRI
64 centros Absorbancia 260nm
37 centros Fluorescencia (Picogreen)
8 muestras (x3) 
concentraciones conocidas
#1 270 ng/ul
#2 220 ng/ul
#3 140 ng/ul
#4 180 ng/ul
#5 60 ng/ul
#6 40 ng/ul
#7 10 ng/ul
#8 100 ng/ul
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
1
www.bancoadn.org
EVALUACIÓN CUANTIFICACIÓN ADN
Absorbance concentrations
0.00
100.00
200.00
300.00
400.00
500.00
600.00
Q2
C_
001
a
Q2
C_
002
Q2
C_
004
Q2
C_
005
Q2
C_
008
Q2
C_
011
a
Q2
C_
015
Q2
C_
018
Q2
C_
020
Q2
C_
021
Q2
C_
023
b
Q2
C_
023
c
Q2
C_
033
a
Q2
C_
033
b
Q2
C_
033
c
Q2
C_
034
Q2
C_
038
Q2
C_
041
Q2
C_
043
Q2
C_
044
Q2
C_
045
Q2
C_
046
Q2
C_
050
Q2
C_
051
Q2
C_
052
Q2
C_
054
Q2
C_
055
a
Q2
C_
055
b
Q2
C_
057
Q2
C_
058
a
Q2
C_
058
b
Q2
C_
060
Q2
C_
061
Q2
C_
062
a
Q2
C_
062
b
Q2
C_
064
a
Q2
C_
064
b
Q2
C_
065
Q2
C_
066
Q2
C_
068
Q2
C_
069
Q2
C_
071
A
Q2
C_
072
Q2
C_
073
a
Q2
C_
073
b
Q2
C_
074
a
Q2
C_
075
a
Q2
C_
077
a
Q2
C_
077
b
Q2
C_
078
Q2
C_
079
a
Q2
C_
080
Q2
C_
082
Q2
C_
083
a
Q2
C_
083
b
Q2
C_
084
Q2
C_
085
a
Q2
C_
086
Q2
C_
087
a
Q2
C_
087
b
Q2
C_
088
Q2
C_
089
Q2
C_
091
a
Q2
C_
092
a
Q2
C_
094
Study Centre
C
on
ce
nt
ra
tio
n 
(n
g/
ul
) A
B
C
D
E
F
G
H
Fluorescence Concentrations
0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
250.00
300.00
350.00
400.00
450.00
500.00
Q2
C_
00
1b
Q2
C_
00
4
Q2
C_
01
0
Q2
C_
01
1b
Q2
C_
01
4
Q2
C_
01
6
Q2
C_
01
7
Q2
C_
02
3a
Q2
C_
02
7a
 
Q2
C_
02
7b
Q2
C_
02
8
Q2
C_
02
9a
Q2
C_
02
9b
Q2
C_
02
9c
Q2
C_
02
9d
 )
Q2
C_
03
0
Q2
C_
03
1
Q2
C_
03
9
Q2
C_
04
2a
Q2
C_
04
2b
Q2
C_
04
7
Q2
C_
04
9
Q2
C_
05
9
Q2
C_
06
0
Q2
C_
06
2
Q2
C_
06
7
Q2
C_
07
0
Q2
C_
07
1B
Q2
C_
07
4b
Q2
C_
07
5b
Q2
C_
07
9b
Q2
C_
08
1
Q2
C_
08
5b
Q2
C_
08
7c
Q2
C_
09
0a
 
Q2
C_
09
0b
 
Q2
C_
09
1b
Study Centre
C
on
ce
nt
ra
tio
ns
 n
g/
ul
A
B
C
D
E
F
G
H
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
1
Valores esperados:
Absorbancia a 260nm
Fluorescencia (Picogreen)
Utilizar de rutina espectrofotometría UV.-
Lo que si es IMPORTANTE que tengáis en cuenta al medir el UV es:
1º.- Verificar la calibración del espectrofotómetro frecuentemente
(p.ej. una vez al mes), para comprobar que mide bien.
.- En un espectrofotómetro UV de referencia (verificado/calibrado):
medid varios ADNs de muy buena calidad (elevada pureza, buena
concentración y ausencia de contaminantes –proteínas, fenoles,
sales…-), conservadlos en condiciones óptimas (múltiples alícuotas
congeladas), y utilizadlos como muestras de referencia (concentración
conocida).
.- Una vez al mes sacáis una alícuota de cada ADN y los medís en el
Espect. UV que queréis verificar. Haced al menos 10 medidas de cada
ADN. Si la precisión y exactitud no se van más allá de entre un 2%-
5%, entonces todo OK.
www.bancoadn.org
RECOMENDACIONES
a) Exactitud y precisión buenas.
b) Exactitud deficiente y buena precisión, 
c) Exactitud y precisión deficientes.
Exactitud: es la cualidad de un instrumento para proporcionar
resultados (medidas) muy próximas al valor esperado.
Precisión: es un término cualitativo que hace referencia a la habilidad
de un instrumento para proporcionar resultados (medidas) muy
similares entre ellos. También se suele referir como repetitividad o
reproductibilidad del equipo.
Utilizar de rutina espectrofotometría UV.-
Lo que si es IMPORTANTE que tengáis en cuenta al medir el UV es:
1º.- Verificar la calibración del espectrofotómetro frecuentemente
(p.ej. una vez al mes), para comprobar que mide bien.
2º.- En todas las muestras hacer un gel de agarosa para verificar la
integridad del ADN (no está fragmentado). Es muy sencillo, rápido y
barato.
.- Un gel agarosa al 0.8 -1 % es suficiente.
.- Migrar 20 minutos a 100V
.- Revelar con EtBr (u otro menos tóxico de los que hay en el mercado).
Resultado: Banda de gran tamaño y sin arrastre (o muy poco) es que el
ADN está perfecto.
www.bancoadn.org
RECOMENDACIONES
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA (0,7%):
INTEGRIDAD DEL ADN
CONTROL DE CALIDAD DEL ADN
www.bancoadn.org
Utilizar de rutina espectrofotometría UV.-
Lo que si es IMPORTANTE que tengáis en cuenta al medir el UV es:
1º.- Verificarla calibración del espectrofotómetro frecuentemente
(p.ej. una vez al mes), para comprobar que mide bien.
2º.- En todas las muestras hacer un gel de agarosa para verificar la
integridad del DNA (no está fragmentado).
3º.- Verificar periódicamente la eficiencia del protocolo de extracción
de ADN, mediante la comparación de la cuantificación mediante
PicoGreen vs Absorbancia 260nm.
Con esto podremos conocer nuestra “incertidumbre de medida” y saber
si ésta es aceptable o no
www.bancoadn.org
RECOMENDACIONES
CONCENTRACIÓN
CONCENTRACIÓN (ng/l):
RELACIÓN PicoGreen®/ Nanodrop ND1000
www.bancoadn.org
CONTROL DE CALIDAD DEL ADN
Nanodrop ND1000
-Espectrofotometría: concentración y pureza
medida de absorbancia 260 nm todos los 
nucleótidos
PicoGreen®
-Fluorimetría: concentración e integridad
unión exclusiva al ADN de doble cadena
R < 1
R 0.8muestra óptima de ADN: >
¡GRACIAS!
CONTROLES DE CALIDAD 
Taller 3
Coordina: Andres C. García ‐ Rosa Pinto (Banco Nacional de ADN, Salamanca)
María Almeida Parra (Banco Nacional de ADN, Salamanca)
María Pérez Caro (Banco Nacional de ADN, Salamanca)
Raquel Paternain (Fundación para la Investigación Médica Aplicada, Navarra)
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos
nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
Dra. María Pérez Caro. Área de Control de Calidad
Banco Nacional de ADN Carlos III‐ Universidad de Salamanca
12 de Noviembre de 2014
Cuando tratamos el control de calidad tenemos que distinguir entre:
PUREZA: ausencia de contaminantes
INTEGRIDAD:  banda única de gran tamaño (DNA) /relación 28S:18S 2:1 (RNA)
FUNCIONALIDAD: que la solución sea apta para realizar los ensayos que se propongan.
CONCENTRACIÓN
• El término calidad engloba concentración, pureza e integridad.
• En el DNA y RNA el análisis de la calidad, tradicionalmente, comprende electroforesis y análisis del 
ratio 260/280 
• En el RNA concretamente,  se determina la calidad del rRNA (>80% ribosómico y 1‐3% mRNA)
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
‐D.O A260/230 ~2,0
< 1.5  (contaminación sales, comp. orgánicos)
PUREZA ÓPTIMA
‐CONCENTRACIÓN Y PUREZA: RELACIÓN ABSORBANCIAS
PUREZA ÓPTIMA‐D.O A260/280 2.0‐2.1
 1.8 Pureza aceptable
< 1.8 Contaminación comp. aromáticos
‐INTEGRIDAD DNA RNA
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
‐FUNCIONALIDAD
5 parejas de oligonucleótidos (primers) simultáneamente
amplificación en 6 cromosomas diferentes
amplicones entre 17.5 kb y 2.0 kb
Long PCR Múltiple: DNA
M
RT‐PCR  oligos inter‐exónicos: RNA
Agilent 2100 bioanalyzer combina técnicas de electroforesis capilar y fluorescencia.
•Evalúa calidad e integridad.
•Requiere de muy poca cantidad de muestra.
•Da valores numéricos a las imágenes que se ven habitualmente‐RIN (RNA Integrity Number) 
RIN < 4  RNA baja calidad
RIN > 7  RNA alta calidad (arrays)
RIN 4‐7 RNA calidad media (qRT‐PCR)
Técnicas de microfluídos
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
•Uso de geles multi‐línea y microfluidos que permiten un ensayo semi‐automático. 
•Simplifica el manejo de muestras y reduciendo los tiempos de ensayo. 
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
Tapestation‐Agilent
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
TÉCNICAS DE MICROFLUÍDOS
Control de calidad del RNA
OBJETIVO:
Comprobar fiabilidad y repetitividad: 
RIN y concentración
• 5 muestras RNA (diluciones)
• extraídas por métodos diferentes
• analizadas por duplicado
• y en días distintos
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
Well RINe
Conc. 
[ng/µl]
Sample Description Replicas Datos 
Bioanalyzer
A1 7,2 168 ladder [1]/[2] RIN []
B1 6,1 114 28853 patol 0.9 7.5 95ng/ul
C1 6,1 123 28853 patol
D1 6,3 61,4 28853 patol 1/2 1.1 6.9 44ng/ul
E1 6,4 55,7 28853 patol 1/2
F1 6,4 31.0 28853 patol 1/4 1 7.1 27ng/ul
G1 6,4 31.0 28853 patol 1/4
H1 1,8 75,8 28854 patol 1 2.4 97 ng/ul
A2 2,1 79,2 28854 patol
B2 1,8 52,4 28854 patol 1/2 1.3 2 50 ng/ul
C2 1,7 41,4 28854 patol 1/2
D2 1,4 27,5 28854 patol 1/4 1 1.1 27 ng/ul 
E2 1,7 28,5 28854 patol 1/4
F2 6,4 107 28855 norm 0.9 7.5 78ng/ul
G2 6,5 94,7 28855 norm
H2 6 56,3 28855 norm 1/2 0.9 N/A 14ng/ul
A3 6,3 61,4 28855 norm 1/2
B3 6,6 26.0 28855 norm 1/4 1 N/A 7ng/ul
C3 6,5 26,9 28855 norm 1/4
D3 7,9 250 28849 neutro 1.1 7 209ng/ul
E3 8 228 28849 neutro
F3 8,1 105 28849 neutro 1/2 1.1 7.8 58ng/ul
G3 8,1 97,9 28849 neutro 1/2
H3 7,8 55,5 28849 neutro 1/4 1.1 7.7 29ng/ul
A4 7,8 52.0 28849 neutro 1/4
B4 7,7 147 28849 mono 1.1 8.6 100ng/ul
C4 7,7 131 28849 mono
D4 8,2 61,5 28849 mono 1/2 1.1 8.1 55ng/ul
E4 8,2 58,2 28849 mono 1/2
F4 7,9 33.0 28849 mono 1/4 1 8.8 24ng/ul
G4 8 33,9 28849 mono 1/4
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
El análisis de las medidas de concentración
aportada por bioanalizador y tapestation de
• lasmismas muestras,
• por duplicado
• y en días distintos,
determinó la baja reproducibilidad entre ambas
técnicas, resultando ser la medida más estable la
aportada por el nanodrop.
DIA 1 DIA 2
Tape 1 Tape 2 Tape 1 Tape 2 Agilent Agilent
muestras concentración concentración concentración concentración concentración concentración
28853 patol 114 123 91 129 95 122
28853 patol 1/2 61,4 55,7 46,4 68 44 61
28853 patol 1/4 31 31 19,7 38,2 27 45
28854 patol 75,8 79,2 50,5 78,2 97
28854 patol 1/2 52,4 41,4 48,2 50,1 50
28854 patol 1/4 27,5 28,5 16,8 31,2 27
28855 norm 107 94,7 55,2 42,6 78 87
28855 norm 1/2 56,3 61,4 62,6 31,5 14 60
28855 norml 1/4 26 26,9 16,9 32,7 7 33
28849 neutro 250 228 156 249 209 308
28849 neutro 1/2 105 97,9 104 69,1 58 146
28849 neutro 1/4 55,5 52 18,1 29,7 29 73
28849 mono 147 131 58,1 51 100 80
28849 mono 1/2 61,5 58,2 34,6 28,1 55 31
28849 mono 1/4 33 33,9 19,3 12,2 24 40
DIA 1 DIA 2
Well RINe
Conc. 
[ng/µl]
Sample Description RINe/RIN Observations
A1 7,2 168 ladder RIN []
B1 6,1 114 28853 patol 0,84 7.5 95ng/ul
C1 6,1 123 28853 patol
D1 6,3 61,4 28853 patol 1/2 0,89 6.9 44ng/ul
E1 6,4 55,7 28853 patol 1/2
F1 6,4 31.0 28853 patol 1/4 0,93 7.1 27ng/ul
G1 6,4 31.0 28853 patol 1/4
H1 1,8 75,8 28854 patol 2.4 97 ng/ul
A2 2,1 79,2 28854 patol
B2 1,8 52,4 28854 patol 1/2 2 50 ng/ul
C2 1,7 41,4 28854 patol 1/2
D2 1,4 27,5 28854 patol 1/4 1.1 27 ng/ul 
E2 1,7 28,5 28854 patol 1/4
F2 6,4 107 28855 norm 0.82 7.5 78ng/ul
G2 6,5 94,7 28855 norm
H2 6,0 56,3 28855 norm 1/2 0.87 N/A 14ng/ul
A3 6,3 61,4 28855 norm 1/2
B3 6,6 26.0 28855 norm 1/4 0.88 N/A 7ng/ul
C3 6,5 26,9 28855 norm 1/4
D3 7,9 250 28849 neutro 1.16 7 209ng/ul
E3 8,0 228 28849 neutro
F3 8,1 105 28849 neutro 1/2 1.07 7.8 58ng/ul
G3 8,1 97,9 28849 neutro 1/2
H3 7,8 55,5 28849 neutro 1/4 0.94 7.7 29ng/ul
A4 7,8 52.0 28849 neutro 1/4
B4 7,7 147 28849 mono 0.89 8.6 100ng/ul
C4 7,7 131 28849 mono
D4 8,2 61,5 28849 mono 1/2 0.938.1 55ng/ul
E4 8,2 58,2 28849 mono 1/2
F4 7,9 33.0 28849 mono 1/4 0.87 8.8 24ng/ul
G4 8,0 33,9 28849 mono 1/4
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
CONCLUSIONES:
 Resultados obtenidos en el BNADN muestran cómo las mismas  muestras de 
RNA analizadas en días diferentes, en ambas plataformas, NO reproducen la  
concentración entre réplicas (a pesar del que cumplen con las especificaciones del aparato)…
 … pero SÍ reproduce los valores de RIN/ RINe en el RNA, siendo la diferencia 
entre ambos ~1
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
TÉCNICAS DE MICROFLUÍDOS
Control de calidad del DNA
TA
PE
ST
AT
IO
N
‐A
G
IL
EN
T
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
Sample 
Description
Ratio 
Picogreen/ 
TapeStation
Ratio 
Nanodrop/ 
TapeStation
Ratio
Picogreen/ 
Nanodrop
1 1,1 1,2 0,91
2 1,2 1,2 0,94
3 1,3 1,3 0,97
4 1,2 1,2 0,98
5 1,1 1,1 0,96
6 1,2 1,4 0,87
7 1,3 1,3 1
8 1,3 1,4 0,93
9 1,2 1,4 0,85
10 1,5 1,7 0,89
Taller 3: CONTROLES DE CALIDAD
Evaluación de los métodos de control de calidad de ácidos nucleicos mediante electroforesis capilar y electroferogramas.
CONCLUSIÓN:
Cada sistema de análisis aporta resultados diferentes, NO COMPARABLES,
de ahí la importancia de utilizar siempre la misma plataforma, conociendo 
sus ventajas e inconvenientes.
DIRECCIÓN:
Prof. Dr. Alberto Orfao de Matos
PERSONAL DE LABORATORIO:
Javier García Palomo
Teresa Malvar Ferreras
Mª Teresa Márquez de Sousa
Sheila Mateos Domínguez 
Mª Isabel Morante Arroyo
COORDINACIÓN TÉCNICA:
Dr. Andrés García Montero
Dra. María Almeida Parra
CONTROL DE CALIDAD:
Dra. Rosa Pinto Labajo
Dra. María Pérez Caro
SECRETARÍA y ADMINISTRACIÓN:
Elena Chamorro Castro
GESTIÓN DE CALIDAD:
Ana Regalado Mayordomo
www.bancoadn.org
¡GRACIAS!
���������	
��
��������	
��
��
��
��	���
��
��
���
��
���
���
�
���	
�
��
	��
��
�����
�
�������������	
����
��
������	�����
�������
�
�����
��	��
	������������������
��	��
	��������������� ���	��
��	�����	����������	��
��	�����	���������	����	���	����	�
� ���
��������������
�����
�������������
�������
�������
����������������
������������
���
�����
��
����������
Objetivo inicialObjetivo inicial
� �������
 !���
��
���"��#��
�
�������������������
�����
���
��$��%�
�����
� �
�����
���
� ���
&��' �()*+(,*
� 
��
�������' �-
� ���
�����
	
�������.�����������
��������/,*0�

��
��$
������1221/(**)
MetodologMetodologííaa
�
�
���.���
������
����
31(*���
�����+1*��
�����4
5����
�
�&���.�
6����	����!	1*������
������7�����.��
"������$"8/1***
�
��������
�������
 !$
���� ������
 !������.���
���"�
�����7�����' ���$��$����
 ������9*:�/ 5(*�8 ��
�
������
���
�����
��
1�����
�	��/�
��
��
���%���������������1(*���
�������
�1*��
���������������
Resultados inicialesResultados iniciales
Pureza* Rendimiento**
N A2 60/280 < 0,1 0,1 - 1 > 1
Esófago-estómago 7 1,86± 0,11 2 2 3
Ganglio 5 1,92± 0,07 0 2 3
Hígado 6 1,93± 0,03 0 1 5
Intestino 27 1,93± 0,06 0 11 16
Mama 24 1,58± 0,39 10 9 5
Ovario 7 1,81± 0,36 1 4 2
P.blandas y hueso 11 1,83± 0,16 3 7 1
Pulm ón 8 1,79± 0,23 1 5 2
Riñón-vejiga 20 1,91± 0,09 1 10 9
Útero 5 1,79± 0,23 1 1 3
TOTAL 120
*Media +/- Desviación estándar
* * Nº de muestras cuyo rendimiento de RN A es (ug/mg tejido) : <0,1 , >0,1 y >1 , y >1
Pureza* Rendimiento**
N A2 60/280 < 0,1 0,1 - 1 > 1
Esófago-estómago 7 1,86± 0,11 2 2 3
Ganglio 5 1,92± 0,07 0 2 3
Hígado 6 1,93± 0,03 0 1 5
Intestino 27 1,93± 0,06 0 11 16
Mama 24 1,58± 0,39 10 9 5
Ovario 7 1,81± 0,36 1 4 2
P.blandas y hueso 11 1,83± 0,16 3 7 1
Pulm ón 8 1,79± 0,23 1 5 2
Riñón-vejiga 20 1,91± 0,09 1 10 9
Útero 5 1,79± 0,23 1 1 3
TOTAL 120
*Media +/- Desviación estándar
* * Nº de muestras cuyo rendimiento de RN A es (ug/mg tejido) : <0,1 , >0,1 y >1 , y >1
��$�����
������;����
�������
�
��
���$���
��
����
Resultados en tejido mamarioResultados en tejido mamario
���%������
���
������������� ()��
�������
�������������
)<��
�������
����������������
# BIOPSIA AÑO CAJA HUECO TEJIDO CLASE FECHA EXTR. Peso (mg) RENDIMIENTO 
(ug/mg tejido)
ng/ul ug RNA A260/280 CALIDAD 28S/18S RQI CLASE
005607 2000 59 44 mama NT 08/02/2011 25,50 0,7011 399,6000 7,9920 1,76 1 0,22 3,1 1
005921 2000 59 72 mama NT 16/02/2011 25,60 0,0078 9,8700 0,1974 1,35 0
038418 2003 89 45 mama NT 16/02/2011 48,20 0,0287 31,7100 0,6342 1,14 0
038714 2003 89 63 mama NT 16/02/2011 47,50 0,0053 6,2500 0,1250 1,17 0
042348 2004 92 71 mama NT 16/02/2011 22,10 0,0099 10,4400 0,2887 1,27 0
052352 2005 100 9 mama NT 16/02/2011 20,00 0,0800 80,0000 1,6000 0,99 0
061116 2006 108 4 mama NT 16/02/2011 31,30 0,0057 9,0000 0,1799 0,97 0
983612 1998 37 50 mama NT 24/02/2011 26,60 0,9086 1208,4600 24,1692 1,81 1
021688 2002 73 28 mama NT 24/02/2011 26,50 0,1802 238,8050 4,7761 1,89 1 0,62 6,3 2
022043 2002 73 54 mama NT 24/02/2011 29,50 0,0028 4,1400 0,0828 0,97 0
012521 2001 64 57 mama NT 04/03/2011 25,80 0,0276 35,6650 0,7133 1,92 1
997323 1999 52 45 mama NT 05/05/2001 26,10 0,7649 998,2100 19,9642 1,86 1 0,16 3,4 1
986648 1998 41 21 mama NT 11/05/2011 28,20 0,1142 161,0300 3,2206 1,83 1
004096 2000 58 13 mama NT 23/05/2011 28,80 0,0831 119,6950 2,3939 1,66 1 0,72 2,7 1
004727 2000 58 62 mama NT 23/05/2011 25,30 0,1157 146,3650 2,9273 1,77 0 3,04 1,9 1
004890 2000 58 72 mama NT 23/05/2011 28,80 0,0170 24,5400 0,4908 1,34 0
004931 2000 58 74 mama NT 18/05/2011 27,70 0,0823 113,9750 2,2795 1,07 0
009413 2000 62 21 mama NT 18/05/2011 26,80 0,0468 62,7750 1,2555 1,71 0
009457 2000 62 25 mama NT 18/05/2011 26,00 0,0971 126,2050 2,5241 1,03 0
021141 2002 72 70 mama NT 23/05/2011 26,90 0,1418 190,7550 3,8151 1,26 0
021290 2002 72 81 mama NT 23/05/2011 25,60 0,0201 25,7500 0,5150 0,91 0
040111 2004 90 76 mama NT 18/05/2011 25,40 0,0390 49,5150 0,9903 0,90 0
042751 2004 93 13 mama NT 18/05/2011 25,50 0,0417 53,2300 1,0646 0,91 0
042835 2004 93 16 mama NT 18/05/2011 25,60 2,2255 2848,6150 56,9723 1,86 1 0,93 N/A Low con.
010795 2001 63 21 mama NT 31/05/2011 48,20 0,0706 170,1700 3,4034 0,95 0
011437 2001 63 68 mama NT 31/05/2011 47,50 0,0503 119,5200 2,3904 1,12 0
002126 2000 56 18 mama NT 31/05/2011 27,20 0,1194 281,7600 5,6352 1,78 1 0,24 2,7 1
037107 2003 88 37 mama NT 31/05/2011 47,50 0,0345 81,9300 1,6386 1,65 0
037504 2003 88 67 mama NT 31/05/2011 49,10 0,0429 105,4100 2,1082 1,63 0
037697 2003 88 80 mama NT 31/05/2011 49,20 0,1566 385,2600 7,7052 1,81 1 1,04 7,3 3
040580 2004 91 28 mama NT 31/05/2011 48,70 0,0469 114,3200 2,2864 1,07 0
040913 2003 91 52 mama NT 31/05/2011 49,50 0,0790 195,4400 3,9088 1,31 0
065295 2006 109 14 mama NT 31/05/2011 49,30 0,0491 120,9100 2,4182 1,32 0
042344 2004 92 72 mama T 16/02/2011 22,10 0,0549 60,6300 1,2100 1,60 0 1,28 8,4 3
052352 2005 100 8 mama T 16/02/2011 20,10 0,1174 118,0000 2,3599 1,22 0
061116 2006 108 3 mama T 16/02/2011 23,30 0,9402 1095,3600 21,9071 2,01 1 1,44 9,4 3
983612 1998 37 49 mama T 24/02/2011 28,00 0,2368 287,9300 5,7586 1,45 0 0,29 3,3 1
021688 2002 73 27 mama T 21/02/2011 26,90 0,8184 1100,6900 22,0138 1,95 1 1,25 9,1 3
021797 2002 73 36 mama T 21/02/2011 24,30 1,6848 2047,0150 40,9403 1,91 1 1,14 7,8 3
046414 2004 96 16 mama T 08/03/2011 31,40 1,5248 2393,8700 47,8774 1,98 1 1,33 9 3
997323 1999 52 44 mama T 03/05/2011 24,60 1,06741312,9500 26,2589 1,95 1 1,05 7,7 3
992213 1999 46 58 mama T 17/05/2011 26,50 1,3289 1760,8200 35,2163 1,94 1 0,19 2,6 1
001296 2000 55 30 mama T 11/05/2011 27,50 0,0525 72,1400 1,4428 0,97 0
004096 2000 58 12 mama T 23/05/2011 29,30 2,2290 3265,5250 65,3105 1,96 1 1,36 8,9 3
009413 2000 62 20 mama T 18/05/2011 28,80 0,6237 898,0900 17,9618 1,95 1 0,68 5,9 2
010180 2001 62 59 mama T 23/05/2011 27,10 0,1814 245,8400 4,9168 1,78 1
020613 2002 72 39 mama T 23/05/2011 26,80 2,0234 2711,4150 54,2283 1,97 1 1,12 8 3
021290 2002 72 80 mama T 23/05/2011 25,70 1,2158 1562,3300 31,2466 1,96 1 1,72 9,4 3
029811 2002 82 13 mama T 23/05/2011 28,60 0,5516 788,7200 15,7744 1,96 1 0,77 6,5 2
0210077 2002 82 48 mama T 23/05/2011 28,70 0,8201 1176,8300 23,5366 1,98 1 0,85 2,2 1
040111 2004 90 75 mama T 23/05/2011 27,80 0,9548 1327,1650 26,5433 1,93 1 0,75 3,2 1
042751 2004 93 12 mama T 18/05/2011 25,30 0,5924 749,4300 14,9886 1,73 1 1,08 8,7 3
043010 2004 93 24 mama T 18/05/2011 26,70 0,5169 690,1100 13,8022 1,87 1 0,83 6,8 2
043034 2004 93 26 mama T 23/05/2011 26,90 1,6236 2183,7550 43,6751 1,98 1 1,00 7,8 3
010819 2001 63 22 mama T 31/05/2011 45,80 0,2322 531,7200 10,6344 1,88 1 0,02 2,1 1
011437 2001 63 67 mama T 31/05/2011 48,60 1,7386 2112,4300 84,4972 1,97 1 0,80 6,6 2
MUESTRA EXTRACCIÓN NANODROP EXPERION
MetodologMetodologííaa
5����
�
�&���.�
6����	����!	1*������
 !������.���
���"�
�����7�����' ���$��$����
 ������9*:�/ 5(*�8 ��
�
��������
�������
 !$
���� ������
�
�
���.���
������
����
������7�����.��
"������$"8/1***
�
������
���
�����
��
1�����
�	��/�
��
��
Comparar distribución frecuencias entre las 
muestras T y NT
Resultados en tejido mamarioResultados en tejido mamario
� 
��� �������$����
����%�������
�������
�������
��
= <��
�()���
�������
��������!����311>?:4
= <<��
�)<���
�������
��������
��!����3?(>@:4
"
# ����
�
��	�
Rendimiento RNA
0
10
20
30
40
50
60
70
TUMOR NO TUMOR
N
úm
er
o 
de
 m
ue
st
ra
s
Cantidad RNA insuficiente para Experion
Cantidad RNA suficiente para Experion
Total
N=63
Total
N=26
Insuficiente
N=3
Insuficiente
N=33
$%&'&"
Resultados en tejido mamarioResultados en tejido mamario
� ��(�3�()*+(,*�A1>9?4 
��
= ?��
�()���
�������
��������!����312>(:4
= @1��
�)<���
�������
��������
��!����3)?>1:4
)
# �*��+�
Pureza RNA (A260/280)
0
10
20
30
40
50
60
70
TUMOR NO TUMOR
N
úm
er
o 
de
 m
ue
st
ra
s
A260/280 < 1,74
A260/280 > 1,75
Total
N=63
Total
N=26
< 1,74
N=5
< 1,74
N=41
$%&'&"
Resultados en tejido mamarioResultados en tejido mamario
,
# 
�	�-�
���
�������!���� ���������!����
�-
�B�9�3.$����4 1(�3?(>(:4 @�31<><:4
�-
�@/9�3������4 ?�3(1>9:4 ?�31)>9:4
�-
�A�@�3����4 )�3()>1:4 (1�39*:4
� Integridad RNA (Análisis de RQI )
Mama TUMOR
46%
19%
23%
12%
Mama NO TUMOR
6%
8%
33%
53%
NO APTO RQI > 7 4 < RQI > 7 RQI < 4
Integridad RNA (Análisis de RQI )
Mama TUMOR
46%
19%
23%
12%
Mama NO TUMOR
6%
8%
33%
53%
NO APTO RQI > 7 4 < RQI > 7NO APTO RQI > 7 4 < RQI > 7 RQI < 4
70%
13%
17%
22%
26%
52%
RQI > 7 4 < RQI > 7 RQI < 4RQI > 7 4 < RQI > 7RQI > 7 4 < RQI > 7 RQI < 4
$%&'&"
ConclusionesConclusiones
= ���
�������������
��
�$
�����
��
�$��.��!/����$����������
���.��
�
��"�>
= �� �
�����
���C� ��� $��
&�� #� ��� ���
������� �
�� �"�� ����
�����7��������
��
�$�����
��
��
��(���
��
��!�������$����������

���������>
�.�����
���
��
�������
�
$�����
��
��(���
!�!����
��0�����
���
!�������12�
��$��2 ���
$���
��
����1���
��
!������
34�
�5��������
��
��
���
PerspectivasPerspectivas
���������������
�$
�D7������
�

!������.���
��"��
�����
�����

!�
�
��
��
�����$��������
�
�
�����.�
��������
���.�
3�����
�4
E����
�$
�D7�����
�
������������
F��������
��
��
��
$���������������
G�������.����������
!�
���.���
�������
���.��#�����;���
��������$����
�������������H����;�
I���
�����
�����&
G�����I���
���
F��������F�����
��J�
�����
�����
¡¡GRACIAS!GRACIAS!
Biobanco Universidad de Navarra
CONTROLES DE CALIDAD 
Taller 3
Coordina: Andres C. García ‐ Rosa Pinto (Banco Nacional de ADN, Salamanca)
María Almeida Parra (Banco Nacional de ADN, Salamanca)
María Pérez Caro (Banco Nacional de ADN, Salamanca)
Raquel Paternain (Fundación para la Investigación Médica Aplicada, Navarra)
www.bancoadn.org
Controles de calidad en los sistemas de gestión 
de muestras para garantizar el seguimiento e 
identificación de muestras
María Almeida Parra
Banco Nacional de ADN Carlos III. Universidad de Salamanca
Palma de Mallorca, 12 noviembre 2014
Taller 3. CONTROLES DE CALIDAD
www.bancoadn.org
Un biobanco tiene que estar organizado como una unidad técnica 
con criterios de CALIDAD, orden y destino
MARCO JURÍDICO
Ley 14/2007, de 3 de julio, de Investigación Biomédica
Art. 66 ORGANIZACIÓN DEL BIOBANCO:
Tiene que haber un responsable del fichero, un registro de actividades
del mismo, y se debe garantizar la CALIDAD, la SEGURIDAD y la
TRAZABILIDAD de los datos y muestras biológicas almacenadas y de los
procedimientos asociados al funcionamiento del biobanco.
www.bancoadn.org
¿QUÉ ES LA TRAZABILIDAD?
Capacidad de asociar un material biológico determinado con información 
registrada referida a cada paso en la cadena de su obtención, así como a lo 
largo de todo el proceso de investigación.
Ley 14/2007, de 3 de julio, de Investigación Biomédica (Art. 3. Definiciones):
CALIDAD, SEGURIDAD y TRAZABILIDAD de muestras y datos
 Incrementa la eficacia y la calidad del trabajo en biobancos
 Reduce errores de tipo humano
 Aumenta el rendimiento de los procesos
 Control de la trazabilidad de las muestras y datos asociados
Ventajas:
SISTEMA INFORMÁTICO DE GESTIÓN DE MUESTRAS Y DATOS 
(Laboratory Integrated Management System)
www.bancoadn.org
 Herramienta óptima, flexible y multifuncional: gestión muestras biológicas y datos,
incremento eficiencia del biobanco y calidad de los productos.
 Cumplimiento requerimientos ético‐legales y técnicos.
Características:
CALIDAD, SEGURIDAD y TRAZABILIDAD de muestras y datos
www.bancoadn.org
ACCESO al LIMS
‐ ACCESO RESTRINGIDO (usuario y contraseña)
• Histórico registros de acceso.
• Control claves de entrada, autorizaciones y accesos no deseados.
• Bloqueo acceso con contraseña errónea.
• Tiempos de caducidad para contraseñas.
• Desconexión LIMS tiempo máximo de espera excedido.
‐Medidas de seguridad:
REGISTRO de muestras y datos asociados
Registro
Identificación única e inequívoca de las muestras y de su información
asociada como requisito básico de funcionamiento.
LIMS:
AUTOMÁTICO Etiquetas/lectores código barras
Manual NO RECOMENDADO
Datos asociados
ADJUNTAR 
DOCUMENTOS
PROCESAMIENTO de muestras
La correcta gestión de las muestras biológicas es un punto crítico y esencial
www.bancoadn.org
El LIMS debe:
• Adaptarse a tipos de muestras y líneas de procesamiento, pero siempre
manteniendo la trazabilidad de las muestras y de su información asociada.
• Proporcionar al usuario un seguimiento completo de la ejecución de todos los
procesos que tiene que seguir una muestra de acuerdo al esquema previamente
diseñado.
• Permitir su conexión al equipamiento del biobanco.
www.bancoadn.org
PROCESAMIENTO muestras: Sistemas AUTOMATIZACIÓN
Etiquetas y lectores de código de barras
¡¡¡Evitar rotular tubos 
a mano!!!
www.bancoadn.org
Automatización procesamiento (ROBOTS)
PROCESAMIENTO muestras: Sistemas AUTOMATIZACIÓN
ALMACENAMIENTO de muestras y datos
www.bancoadn.org
• Tener perfectamente localizada cada alícuota almacenada en el sistema.
El LIMS debe:
Laboratory Integrated Management System (LIMS)
www.bancoadn.org
Información disponible/alícuota almacenada
• Listado detallado de alícuotas que alberga cada almacén.
• Lugar exacto de almacenamiento.
• Código de la alícuota.
• Código de la muestra de procedencia.
• Información asociada (datos epidemiológicos, clínicos,…etc. del donante de procedencia).
• Centro de procedencia.
• Fecha y hora de obtención de la muestra original.
• Tipo de muestra deprocedencia.
• Tipo de subproducto que alberga la alícuota.
• Cantidad que contiene.
• Fecha y hora de almacenamiento.
• Proyectos de investigación que la han utilizado.
• …etc.
ALMACENAMIENTO de muestras y datos
www.bancoadn.org
ALMACENAMIENTO de muestras y datos
www.bancoadn.org
• Tener perfectamente localizada cada alícuota almacenada en el sistema.
El LIMS debe:
•Controlar movimientos muestras (cambios de posición, proyectos de investigación que las
han utilizado,…etc.).
ALMACENAMIENTO de muestras y datos
www.bancoadn.org
www.bancoadn.org
ALMACENAMIENTO de muestras y datos
ALMACENAMIENTO de muestras y datos
www.bancoadn.org
• Tener perfectamente localizada cada alícuota almacenada en el sistema.
El LIMS debe:
•Controlar movimientos muestras (cambios de posición, proyectos de investigación que las
han utilizado,…etc.).
•Gestionar sistemas de almacenamiento y espacios.
• Gestionar la información almacenada
ALMACENAMIENTO de muestras
Sistemas de identificación de muestras almacenadas
•Tubos rotulados/etiquetados a mano
•Tubos identificados con código alfanumérico de posición en caja/gradilla
•Tubos identificados con código bidimensional fijo y único
•Tubos identificados mediante etiquetas con código de barras
www.bancoadn.org
‐ Almacenamiento muestras TUBOS código 2D
LIMS
TRAZABILIDAD
Lectores código barras
Automatización
Etiquetas
Tubos código 2D
Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos
1. Búsqueda de muestras
www.bancoadn.org
Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos
1. Búsqueda de muestras
www.bancoadn.org
Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos
2. Generación solicitud muestras y/o datos
Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos
2. Generación solicitud muestras y/o datos
Posiciones 
muestras
Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos
2. Selección muestras a enviar
www.bancoadn.org
Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos
3. VALIDACIÓN de muestras a enviar
(96)
Ideal para mantener 
trazabilidad
(Código bidimensional)
Microtubos con código bidimensional
Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos
3. VALIDACIÓN de muestras a enviar
www.bancoadn.org
Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos
3. VALIDACIÓN de muestras a enviar
Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos
3. VALIDACIÓN de muestras a enviar
www.bancoadn.org
Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos
3. VALIDACIÓN de muestras a enviar
www.bancoadn.org
¿A qué muestras hay que hacer el control de integridad?
Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos
4. CONTROL DE CALIDAD de muestras a enviar
www.bancoadn.org
Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos
4. CONTROL DE CALIDAD de muestras a enviar Código 2D
www.bancoadn.org
Gestión de SOLICITUDES de muestras y datos
5. ALICUOTADO AUTOMÁTICO de muestras a enviar
www.bancoadn.org
Los sistemas informáticos de gestión de muestras y datos y de automatización
constituyen una herramienta de trabajo imprescindible para el correcto 
funcionamiento de un biobanco, ya que permiten garantizar la 
TRAZABILIDAD de todos los procesos e incrementar la CALIDAD de los 
productos que éste ofrece a sus usuarios. 
CONCLUSIÓN
www.bancoadn.org
DIRECCIÓN:
Prof. Dr. Alberto Orfao de Matos
PERSONAL DE LABORATORIO:
Javier García Palomo
Teresa Malvar Ferreras
Mª Teresa Márquez de Sousa
Sheila Mateos Domínguez 
Mª Isabel Morante Arroyo
COORDINACIÓN TÉCNICA:
Dr. Andrés García Montero
Dra. María Almeida Parra
CONTROL DE CALIDAD:
Dra. Rosa Pinto Labajo
Dra. María Pérez Caro
SECRETARÍA y ADMINISTRACIÓN:
Elena Chamorro Castro
GESTIÓN DE CALIDAD:
Ana Regalado Mayordomo
www.bancoadn.org
¡¡MUCHAS GRACIAS!!
bancoadn@usal.es
http://www.bancoadn.org
/BancoNacionalADN
www.bancoadn.org
CONTROLES DE CALIDAD 
Taller 3 
Coordina: Andres C. García - Rosa Pinto (Banco Nacional de ADN, Salamanca) 
 
María Almeida Parra (Banco Nacional de ADN, Salamanca) 
María Pérez Caro (Banco Nacional de ADN, Salamanca) 
Raquel Paternain (Fundación para la Investigación Médica Aplicada, Navarra) 
Identificación y trazabilidad de las 
muestras mediante marcadores 
genéticos 
Taller 3: Controles de Calidad 
Dra. Rosa María Pinto Labajo. Área de Control de Calidad 
Banco Nacional de ADN Carlos III- Universidad de Salamanca 
www.bancoadn.org 
Laboratory Integrated Management System 
- Etiquetas y lectores de 
 códigos de barras 
 
- Microtubos 2D-coded 
 
- Automatización (Robots) 
IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS DE DIFERENTE SEXO 
PCR de Sexo: Utiliza una pareja de oligonucleótidos que amplifica 
en una región conservada en ambos cromosomas X e 
Y pero que da lugar a un fragmento de diferente 
tamaño en cada cromosoma 
Gen AME: AMEX y AMEY: diferencia de 6 pb por deleción en cromosoma X 
www.bancoadn.org 
IDENTIFICACIÓN DE SEXO: PCR de Sexo 
SEXO: amplificación gen ZF (Fredsten y Villesten, 2004) 
B1 
l-Hind III 1 2 3 4 5 
hombre mujer 
1560 pb 
1137 pb 
PCR sexo 
cromosoma X: inserción de un elemento Alu de 423 pb 
cromosoma Y: no existe elemento Alu 
PERFIL GENÉTICO por MICROSATELITES o STR´s 
STR´s: “ Short Tandem Repeats” 
-secuencias cortas de 2-7 pb que se repiten a lo largo de todo 
el genoma 
-el número de repeticiones es único en cada individuo 
-la amplificación de estas regiones constituye el perfil o huella 
genética del individuo 
kits comerciales con combinaciones de 15 y 18 STR´s 
- medicina forense 
- pruebas de paternidad requieren secuenciación 
son caros 
www.bancoadn.org 
- AmpFSTR Profiler Plus PCR Amplification Kit (Applied Biosystems) 
-STR analysis using the Promega PowerPlex 16 System 
 
Amplificación de 9 loci STRs: D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, 
D18S51, D21S11, FGA, y vWA , y el locus del gen de la amelogenina para la 
identificación del sexo del individuo. 
. 
Amplificación de 16 loci (15 loci STR y 1 para el gen de la amelogenina): Penta E, 
D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, Amelogenin, Penta 
D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 y D5S818. 
La detección de la fluorescencia de los genotipos es compatible con los equipos 
ABI PRISM® 310, 3100 y 3100-Avant Genetic Analyzers, Applied Biosystems 3130 
and 3130xl Genetic Analyzers and ABI PRISM® 377 DNA Sequencer. 
 
. 
www.bancoadn.org 
CHLC (Cooperative Human Linkage Center) markers 
Sheffield JC et al (1995), Gastier JM et al (1995) 
5 pares de oligonucleótidos PCR MÚLTIPLE 
5 parejas de oligonucleotidos: 
DXS7132 
GATA31E08 
DYS390 
GATA175D03 
DXS6789 
tamaño producto PCR marcadores: 
283-299 pb 
226-234 pb 
205-211 pb 
170-186 pb 
118-150 pb 
EPICENTRE Forum 5 (3) 
Multiplex PCR Amplification of STRs from DNA Isolated with the MasterAmp™ Buccal 
Swab DNA Extraction Kit| 
Haiying Grunenwald, Epicentre Technologies 
agarosa 3% 
carriles 3, 5, 7, 100 bp DNA ladder 
2: muestra mujer 
 
4, 6, 8 : muestras hombres 
50% Hi-Gel Matrix (Biotools) y 0,7% agarosa estándar 
310 
281 / 271 
234 
194 
118 
x174 HaeIII 
1 2 3 4 
VALIDACIÓN DEL PROTOCOLO 
AND molde 100 ng 
4 individuos en dos reacciones de PCR diferentes una con Tm a 55ºC y 
otra con Tm a 58ºC 
www.bancoadn.org 
Inmortalización 
ADN Plasma 
Sangre EDTA Sangre ACD 
Leucocitos 
Procesamiento/ alicuotado automático 
Sangre 
Papel FTA 
15-30ºC 
Microtubos con código 
bidimiensional 
(Micronic®) 
-80ºC 
N2 líquido 
 
-196ºC 
Tipo de Muestras 
Líneas celulares 
www.bancoadn.org 
Amplificación diferentes tipos de muestra: 
muestras obtenidas con diferentes protocolos . 
www.bancoadn.org 
Muestras ADN de sangre 
(100 ng ADN molde) 
Muestras ADN papel FTA 
(2 discos de 1.2 mm ADN molde) 
A B C D A B C D 
A = D 
B = C 
muestras de distintos orígenes 
. 
H1 H2 H3 M H 
No permite diferenciar hermanos pero sí grado madre/ padre de hijos/as 
H1 H2 H3 P M 
H1 H2 H3: tres hermanos 
M: madre 
H: hijo 
H1 H2 H3: tres hermanos 
M: marcador tamaño molecular: 
φ X174 DNA-Hae IIIP: padre 
281 
271 
234 
194 
310 
pb 
www.bancoadn.org 
Pérdida de trazabilidad durante el procesamiento de muestras de sangre 
en EDTA 
1- En un momento durante el procesamiento de la muestra de sangre en EDTA se 
sospecha un posible cruce entre la muestras 2708 y 2808 
2- Se continua el procesamiento 
3- Se compara el ADN de las muestras procesadas en EDTA con el ADN obtenido a 
partir de la línea celular (en ACD) 
4- Se confirma el error en la codificación de la 
muestra 
5- Se procede al cambio de codificación previamente 
al proceso de normalización 
www.bancoadn.org 
A 
0151: A 
Muestras codificadas erróneamente en el centro de obtención de la 
muestra 
1- Se reciben dos muestras rotuladas con el mismo código 0152 pero con 2 cuestionarios 
distintos: 0151 y 0152 
2- En la aplicación se registran los dos códigos del 
cuestionario: 
0152: B 
3- Se confirma que A y B son dos individuos distintos como indicaba 
el cuestionario 
B 
281 
271 
234 
310 
pb 
A M 
4- Se solicita al hospital que contacte 
con uno de los dos donantes para 
obtener muestra de nuevo bien 
codificada 
5- Se comparan los tres ADN: 
B M 
0151: B 
0152: A 
6- Se cambia la relación de códigos en 
la aplicación 
1- Se reciben de un mismo centro dos muestras con el mismo código origen 269 
C.O 269 = A 
C.O 270 = B 
2- Vuelven a enviar desde el hospital la muestra C.O 269 
A B 
C.O 269= A 
C.O 269= B 
C.O 270= A 
3- Se cambian los códigos en la aplicación 
M 
Muestras codificadas erróneamente en el centro de obtención de la 
muestra 
281 
271 
234 
194 
310 
pb 
118 
1 2 3 
Muestras codificadas erróneamente en el centro de obtención de la 
muestra 
1- Se recibe desde el hospital tres muestras de un proyecto correspondiente a un trío: 
padre, madre e hija. Estas muestras estas contenidas en tubos no identificados 
2- Las muestras se procesan y se lleva a cabo una PCR de sexo para identificar al padre 
3- Se solicita al hospital una muestra de saliva de cada individuo identificado. 
La muestra 2 es el padre 
4- Se comparan los perfiles genéticos de las muestras procesadas de sangre (no 
identificadas) y de saliva (identificadas) 
www.bancoadn.org 
2 = P 
1 = H 
3 = M 
 1 H 2 P 3 M 
M: madre 
P: padre 
H: hija 
M 1 2 3 H M P 
281 
271 
234 
194 
310 
pb 
118 
muestras 
saliva 1 y 3: ¿madre, hija? 
2: padre muestras 
sangre 
www.bancoadn.org 
Confirmación de las placas alicuotadas previamente al envío de muestras 
A02801 y A01068 
S901CWNJ y S901CWNI 
Réplicas de dos cajas micronic® 
En dos placas de 96 pocillos 
www.bancoadn.org 
A02801 S901CWNJ A01068 S901CWNI 
H1 H2 H1 H2 H1 H2 H1 H2 
1 2 3 4 5 6 7 8 
A02801 S901CWNJ = 
A01068 S901CWNI = 
1 = 3 
2 = 4 
5 = 7 
6 = 8 
= = = = 
* 
* 
* 
* 
Identificación de cajas de envío tras el alicuotado 
 1 3 5 7 2 4 6 8 
H1 H2 
1 N 1T 2N 2T 3N 3T 
Confirmación de las placas alicuotadas previamente al envío de muestras 
Réplicas en dos placas de muestras de tejido normal y tumoral 
N: normal 
T: tumoral 
www.bancoadn.org 
INFECCIÓN 
VIRUS EPSTEIN-
BARR 
CULTIVO 
ALÍCUOTAS 
LINFOBLASTOS 
EXTRACCIÓN 
ADN 
ALÍCUOTAS 
LINFOBLASTOS 
Incidencia durante la inmortalización de líneas celulares (sangre ACD) 
1- Durante el proceso de inmortalización se sospecha de un cruce entre dos muestras (cada muestra 
se realiza por duplicado). Los códigos de las muestras son 19916 y 19917 
2- Las muestras se denominan temporalmente como: 
19916-a1 19916-b1 
19916-a2 19916-b2 
Incidencia durante inmortalización de líneas celulares 
3- Se realiza un perfil genético entre las 4 muestras problema y las muestras 19916 y 19917 
procesadas a partir de sangre EDTA almacenadas en tubos micronic® 
 El técnico que realiza la inmortalización sugiere que las muestras 19916-a2 y 19916- b2 podrían 
corresponderse a la muestra 19916 almacenada en micronic® 
Se cumple que las muestras 19916-a2 y 19916- b2 son el individuo 19916 y las muestras 19916-a1 y 
19916- b1 son el individuo 19917 
 
www.bancoadn.org 
Xxxx 
Xxxx : muestra ya normalizada y alicuotada en micronic® 
Xxxx = Xxxx 
¿¿ Xxxx = Xxxx ?? 
muestra de ADN en solución a 4ºC para ser normalizada 
Incidencia durante el proceso de normalización (1) 
M 
La muestra Xxxx se normaliza y se alicuota en micronic® 
www.bancoadn.org 
Durante el proceso de alicuotado de muestras la aplicación informática detecta que uno de los 
códigos (11030) correspondiente a una muestra que va a ser alicuotada, y que hasta el 
momento se ha mantenido en la nevera a 4ºC, se corresponde a una muestra ya almacenada 
en caja micronic®. 
1- La muestra fue procesada en dos tubos uno de ellos ha sido 
encontrado en la nevera pero su perfil genético no se corresponde 
con la muestra del mismo código alicuotada en micronic®. 
 
2- En la nevera también se ha encontrado un solo tubo de la muestra 
11130 (código muy similar) mientras que el otro tubo no ha sido 
encontrado ni existe registro de que haya sido alicuotado. 
 
3- Se sospecha que uno de los tubos de la muestra 11030 se ha 
mezclado con uno de los tubos de la muestra 11130 previamente al 
alicuotado de la muestra y que probablemente la mezcla de ambos 
sea la muestra alicuotada en caja micronic® correspondiente al 
código 11030. 
11030 micronic 11030 4ºC  
Incidencia durante el proceso de alicuotado 
www.bancoadn.org 
1º eliminamos la muestra del tubo micronic® 
2º inmortalizan las líneas celulares de 11030 y 11130 
para obtener ADN de cada de una de ellas 
3º se comparan los perfiles genéticos de las muestras a 
4ºC y el ADN obtenido de la línea celular inmortalizada 
4º para cada una de las muestras se unen el ADN 
almacenado a 4ºC y el ADN obtenido de la línea celular 
inmortalizada 
5º ambas muestras (correspondientes a los códigos 
11030 y 11130) se normalizan ¡¡POR SEPARADO!! y se 
alicuotan en tubos micronic® para su almacenamiento 
a -80ºC 
www.bancoadn.org 
Conclusión: 
Los cinco marcadores STR pertenecientes a Cooperative Human Linkage 
Center (CHLC) permiten diferenciar mediante PCR múltiple y electroforesis en 
gel de agarosa de alta resolución perfiles genéticos de diferentes individuos 
siempre y cuando dichos individuos no sean hermanos entre sí. 
www.bancoadn.org 
¡GRACIAS! 
DIRECCIÓN: 
Prof. Dr. Alberto Orfao de Matos 
PERSONAL DE LABORATORIO: 
Javier García Palomo 
Teresa Malvar Ferreras 
Mª Teresa Márquez de Sousa 
Sheila Mateos Domínguez 
Mª Isabel Morante Arroyo 
COORDINACIÓN TÉCNICA: 
Dr. Andrés García Montero 
Dra. María Almeida Parra 
CONTROL DE CALIDAD: 
Dra. Rosa Pinto Labajo 
Dra. María Pérez Caro 
SECRETARÍA y ADMINISTRACIÓN: 
Elena Chamorro Castro 
GESTIÓN DE CALIDAD: 
Ana Regalado Mayordomo 
www.bancoadn.org 
	1 Taller 3 Control de Calidad Cuantificación ADN.pdf
	2 Presentacion_CongresoBB2014taller3 técnicas microfluidos.pdf
	3 Caso práctico obtención RNA tejido mamario.pdf
	4 Taller 3_Controles de calidad_V Congreso Biobancos_LIMS.pdf
	5 Taller 3 Control de Calidad - Trazabilidad marcadores genéticos.pdf