Práctica 3b Demostración de la acción de la lipasa pancreática y sales biliares (1)

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Fundamentos Bioquímicos, Enzimología y Biología Molecular de las membranas biológicas
Primera Unidad
PRACTICA N° 03b
 - DEMOSTRACION DE LA ACCIÓN DE LA LIPASA PANCREÁTICA Y SALES BILIARES --
INTRODUCCION:
Los triglicéridos son los principales lípidos de la dieta. Las lipasas sublingual y gástrica actúan sobre los triglicéridos liberando los ácidos grasos, que si son de cadena corta o media son directamente absorbidos. Las contracciones gástricas contribuyen al fraccionamiento mecánico de las partículas grasas.
La principal digestión ocurre en el duodeno y yeyuno por acción de la lipasa pancreática, en la interfase agua-lípido y su velocidad depende de la superficie de la interfase, la cual es muy incrementada por el movimiento peristáltico del intestino combinado con la acción emulsificante de las sales biliares. La lipasa pancreática cataliza la hidrólisis de los triglicéridos en las posiciones 1 y 3 para formar secuencialmente 1-2 diacilglicerol y 2 acilglicerol, junto con ácidos grasos. La unión de la lipasa a la interfase agua-lípido requiere de la colipasa, una proteína de 90 residuos que forma un complejo 1:1 con la lipasa, con cambios conformacionales que forma una superficie hidrofóbica y deja libre el centro activo.
La finalidad de la práctica es demostrar la acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas comparando su efecto con el agua y demostrar la acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos y el efecto de las sales biliares.
COMPETENCIAS A LOGRAR POR EL ESTUDIANTE:
· Demuestra la acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas, empleando de manera responsable un sistema in vitro en el que se evalúa la solubilidad de las grasas.
· Demuestra el efecto que tienen las sales biliares sobre la lipasa pancreática, y de la acción que tiene la lipasa pancreática sobre los triacilgliceroles del aceite vegetal, empleando de manera responsable un sistema in vitro en el que se evalúa los ácidos grasos liberados por acción de la lipasa.
PROCEDIMIENTO:
A) Acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas:
Preparar el siguiente sistema, empleando tubos de ensayo de 15 x 125 mm.
	COMPONENTES
	Tubo 1
	Tubo 2
	Tubo 3
	Aceite de oliva (gotas)
	3
	3
	3
	Agua destilada (mL)
	5
	3
	
	Sales biliares (mL)
	--
	2
	--
	Cloroformo (mL)
	--
	--
	2
	Agitar enérgicamente los tubos por inversión y dejar en reposo por 10 minutos.
Anotar los resultados e interpretar en base a la competencia, considerando si se observa 1 ó 2 fases y la existencia de solubilidad-miscibilidad.
B) Efecto de las sales biliares sobre la enzima. Acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos:
Preparar el siguiente sistema, empleando tubos de ensayo de 25 x 150 mm.
	COMPONENTES
	Tubo 1
	Tubo 2
	Tubo 3
	Tubo 4
	Emulsificación de aceite vegetal (ml)
	--
	3
	3
	3
	Buffer fosfato 0.1 M pH 8.0
	2
	2
	2
	2
	Solución de sales biliares 1% 
	2
	2
	--
	2
	Solución de extracto pancreático 1%
	2
	--
	2
	2
	Agua destilada
	3
	2
	2
	--
	Mezclar cada uno de los tubos por inversión. Llevar a baño maría a 37 °C por 30 minutos, agitando de vez en cuando.
	Al finalizar el tiempo de incubación retirar los tubos y agregar a cada uno 3 gotas de fenolftaleína. Mezclar bien por inversión y realizar la titulación.
	Titulación: Empleando una pipeta graduada de 1 ml dejar caer gota a gota, hidróxido de sodio (NaOH) 0.1N en el fondo de cada tubo, mezclar bien por inversión hasta la aparición de un color rosado tenue persistente. 
Anotar la cantidad de NaOH empleado en cada tubo.
Interpretar los resultados en base a la competencia, considerando que la acción de la lipasa pancreática en cada uno de los tubos estará directamente expresada por los respectivos gastos de NaOH 0.1 N.
Como se liberan ácidos grasos por acción de la enzima, el menor o mayor gasto de álcali necesario para neutralizar el medio ácido equivaldrá, respectivamente, a una menor o mayor actividad de la lipasa pancreática.
RESULTADOS:
A) Acción emulsificante de las sales biliares sobre las grasas:
	EVIDENCIA / INDICADOR
	TUBOS DE ENSAYO
	
	1 (agua)
	2 (SB)
	3 (Cloroformo)
	N° de fases al inicio: 1 / 2
	2
	2
	1
	N° de fases al agitar: 1 / 2
	2
(gotitas de aceite)
	2
(gotitas de aceite)
	1
	N° de fases al final : 1 / 2
	2
	2
(gotitas de aceite)
	1
	Solubilidad-Miscibilidad: SI / NO
	NO
	NO
(Emulsión)
	SI
(Solución)
 
B) Efecto de las sales biliares sobre la enzima. Acción de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos:
	EVIDENCIA / INDICADOR
	TUBOS DE ENSAYO
	
	1 (Control)
	2
	3
	4
	Gasto de NaOH 0.1 N (gotas)
	15
	35
	40
	60
	Efecto de las sales biliares sobre la lipasa pancreática: NO / SI
	NO
	NO
(Si sobre las grasas)
	NO (——)
	SI
	Acción de la lipasa pancreática: NO / SI ( + / ++)
	NO
	NO (——)
	SI (+)
	SI (++)
DISCUSIÓN:
El estudiante discute o analiza los resultados. Para ello los interpreta comparándolos y verificándolos respecto al marco teórico (principios teórico-prácticos, teorías y leyes que existen para la temática de los resultados) que se encuentra principalmente en libros, y con respecto a los antecedentes (trabajos de investigación alusivos al tema) que se encuentran fundamentalmente en artículos publicados. El marco teórico y los antecedentes se encuentran en las referencias bibliográficas, las cuales deben ser citadas en la discusión.
CONCLUSIONES:
El estudiante, en base a lo realizado en la discusión, elabora conclusiones cortas y puntuales las cuales se enuncian según las competencias a alcanzar en la presente práctica.
Nota: Mínimo deben elaborarse 3 conclusiones por tema.
CUESTIONARIO:
1) ¿Cuál fue el propósito y/o finalidad de la práctica?
2) Identificar las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
3) ¿Cuál de los métodos para medir la actividad enzimática de la lipasa pancreática fue empleado en esta práctica?
4) Explicar el papel de la fenolftaleína en la titulación de los resultados.
5) Explicar en qué consiste una sustancia anfipática, emulsión, solución, solubilidad, miscibilidad.
6) Explicar el proceso de emulsión de lípidos.
7) ¿En el ser humano, qué enzimas participan en el proceso de digestión de lípidos, y cuál es la función de cada una de ellas?
8) Mediante un esquema, explicar el proceso de absorción de lípidos, luego de su digestión.
9) ¿Cuántas clases de lipasas actúan en el tubo digestivo y cuál es su rol? ¿Cuál es la importancia de las sales biliares?
REFERENCIAS:
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.
2) …
3) …
Nota: Mínimo deben revisar y consignar 3 referencias bibliográficas, las cuales deben estar citadas en la discusión. Emplear las normas Vancouver.
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