Práctica 5a-Ósmosis Resistencia osmótica eritrocitaria (2)

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Primera Unidad
Fundamentos Bioquímicos, Enzimología y Biología Molecular de las membranas biológicas
PRACTICA N° 05a
 - ÓSMOSIS Y RESISTENCIA OSMÓTICA ERITROCITARIA --
INTRODUCCION:
Las membranas celulares son semipermeables y es donde ocurre los procesos osmóticos, debido a los niveles de concentración de solutos o electrolitos disueltos en el agua de los líquidos biológicos. Las células, en estado normal deben encontrarse en un medio isotónico, esto es que la concentración de solutos está en equilibrio electroquímico en ambos lados de la membrana celular. Cuando las células se colocan en un medio hipertónico, en donde la concentración de solutos extracelular es mayor, se producirá un flujo de agua desde la célula hacia el exterior hasta que se igualen las concentraciones a ambos lados de la membrana. Si las células se colocan en un medio hipotónico, es decir menos concentrado en soluto fuera que dentro de la célula, se provocará un flujo de agua desde el medio exterior hacia el interior de la célula, lo cual aumenta su volumen.
La prueba de resistencia osmótica eritrocitaria (ROE) proporciona una indicación de la razón volumen/superficie de los eritrocitos y refleja su capacidad para incorporar una cierta cantidad de agua antes de lisarse. La habilidad de los glóbulos rojos normales para resistir la hipotonicidad proviene de su forma bicóncava, lo cual permite que la célula aumente su volumen hasta un 70% antes de que la membrana se estire; una vez superado este límite ocurre la lisis. La prueba de ROE ha sido ampliamente usada en el diagnóstico de esferocitosis hereditaria (EH) y en su modalidad tubo único (ROETU) como prueba de cribado para talasemia.
COMPETENCIA A LOGRAR POR EL ESTUDIANTE:
Explica el fenómeno de la ósmosis, evaluando con responsabilidad el comportamiento de los glóbulos rojos frente a soluciones hipotónica, isotónica e hipertónica con el fin de comprender las anomalías relacionadas al proceso osmótico.
PROCEDIMIENTO:
A)	OBSERVACIÓN DEL FENÓMENO DE ÓSMOSIS: Efecto de una solución hipertónica, isotónica e hipotónica.
· Extraer 5 ml de sangre venosa de la parte interna del codo y colocarlo en un tubo vacutainer con EDTA.
· Hacer un sistema de 3 tubos de ensayo y agregarles lo siguiente:
	COMPONENTE
	Tubo 1
	Tubo 2
	Tubo 3
	Solución de NaCl al 2,5%
	3 ml
	
	
	Solución de NaCl al 0,9%
	
	3 ml
	
	Solución de NaCl al 0,45%
	
	
	3 ml
	Sangre periférica
	2 gotas
	2 gotas
	2 gotas
· Mezclar suavemente cada uno de los 3 tubos.
· Colocar una gota del tubo 1 sobre una lámina portaobjetos limpia y cubrir con una laminilla portaobjetos
· Inmediatamente, llevar al microscopio a 40X.
· Observar e interpretar en base a la competencia de la práctica, evaluando el comportamiento de los glóbulos rojos frente a soluciones hipotónica, isotónica e hipertónica según exista hemólisis, eritrocitos íntegros o crenación.
B)	RESISTENCIA OSMÓTICA ERITROCITARIA (ROE):
· Hacer un sistema de 11 tubos de ensayo y agregarles lo siguiente:
	COMPONENTE
	Tubo1
	Tubo2
	Tubo3
	Tubo4
	Tubo5
	Tubo6
	Tubo7
	Tubo8
	Tubo9
	Tubo10
	Tubo11
	Solución de NaCl al 0,9%
	3.0ml
	2.7ml
	2.4ml
	2.1ml
	1.8ml
	1.5ml
	1.2ml
	0.9ml
	0.6ml
	0.3ml
	0.0ml
	Agua destilada
	0.0ml
	0.3ml
	0.6ml
	0.9ml
	1.2ml
	1.5ml
	1.8ml
	2.1ml
	2.4ml
	2.7ml
	3.0ml
	Sangre periférica
	5 gotas
	5 gotas
	5 gotas
	5 gotas
	5 gotas
	5 gotas
	5 gotas
	5 gotas
	5 gotas
	5 gotas
	5 gotas
· Tapar los tubos con parafilm y mezclar suavemente por inversión cada uno de los 11 tubos.
· Dejar en reposo por 10 minutos y centrifugar a 2000 rpm por 3 minutos.
· Calcular la concentración de NaCl (en porcentaje) de cada uno los tubos.
· Observar e interpretar en base a la competencia de la práctica, evaluando la resistencia osmótica de los eritrocitos (ROE) de manera cualitativa, según a la ausencia o de la presencia (menor o mayor) de hemólisis, evidenciada por un color rojo del sobrenadante y sobre la existencia o no (hemólisis total) de un sedimento de eritrocitos en el fondo del tubo.
RESULTADOS:
A)	OBSERVACIÓN DEL FENÓMENO DE ÓSMOSIS: Efecto de una solución hipertónica, isotónica e hipotónica.
	COMPONENTE
	Tubo 1 (Hipert.)
	Tubo 2 (Isot.)
	Tubo 3 (Hipot.)
	Respuesta de los eritrocitos: Crenación / GR íntegros / Hemólisis
	Crenación
	GR íntegros
	Hemólisis
ERITROCITOS EN MEDIO HIPERTONICO (Solución de NaCl al 2,5%):
 
ERITROCITOS EN MEDIO ISOTONICO (Solución de NaCl al 0,9%):
 
ERITROCITOS EN MEDIO HIPOTÓNICO (Solución de NaCl al 0,45%):
 
B)	RESISTENCIA OSMÓTICA ERITROCITARIA (ROE):
11
10
9
8
7
5
6
4
3
2
1
	COMPONENTE
	Tubo1
	Tubo2
	Tubo3
	Tubo4
	Tubo5
	Tubo6
	Tubo7
	Tubo8
	Tubo9
	Tubo10
	Tubo11
	Solución de NaCl 0,9%
	3.0ml
	2.7ml
	2.4ml
	2.1ml
	1.8ml
	1.5ml
	1.2ml
	0.9ml
	0.6ml
	0.3ml
	0.0ml
	Solución de NaCl: [%]
	0.9
	0.81
	0.72
	0.63
	0.54
	0.45
	0.36
	0.27
	0.18
	0.09
	0
	Color rojo del sobrenadante: SI / NO
	NO
	NO
	NO
	SI
(~)
	SI
(~+)
	SI
↓ (++)
	SI
↓ (+++)
	SI
(+++)
	SI
(+++)
	SI
(Total)
	SI
(Total)
	Hemólisis: SI / NO
	NO
	NO
	NO
	SI
(~)
	SI
(~+)
	SI
↓ (++)
	SI
↓ (+++)
	SI
(+++)
	SI
(+++)
	SI
(Total)
	SI
(Total)
	ROE: SI / NO
	SI
(Total)
	SI
↓(Total)
	SI
↓(Total)
	SI
↑ (+++)
	SI
(+++)
	SI
↑ (++)
	SI
↑ (~+)
	SI
(~)
	SI
(~)
	NO
	NO
Mínima (~). Ligera (~+). Baja (+). Regular (++). Alta (+++). Poco o Algo menos que (↓). Algo más que (↑)
Interpretación: En base a la competencia de la práctica, evaluando la resistencia osmótica de los eritrocitos (ROE) de manera cualitativa, según exista (menor o mayor) o no hemólisis, evidenciada por un color rojo del sobrenadante, y según exista o no (hemólisis total) un sedimento de eritrocitos en el fondo del tubo.
DISCUSIÓN:
El estudiante discute o analiza los resultados. Para ello los interpreta comparándolos y verificándolos respecto al marco teórico (principios teórico-prácticos, teorías y leyes que existen para la temática de los resultados) que se encuentra principalmente en libros, y con respecto a los antecedentes (trabajos de investigación alusivos al tema) que se encuentran fundamentalmente en artículos publicados. El marco teórico y los antecedentes se encuentran en las referencias bibliográficas, las cuales deben ser citadas en la discusión.
CONCLUSIONES:
El estudiante, en base a lo realizado en la discusión, elabora conclusiones cortas y puntuales las cuales se enuncian según las competencias a alcanzar en la presente práctica.
Nota: Mínimo deben elaborarse 3 conclusiones por tema.
CUESTIONARIO:
1) ¿Qué es un proceso osmótico celular?
2) ¿Cómo se define a la presión osmótica?
3) ¿Cuál es el fundamento de la Resistencia Osmótica Eritrocitaria – ROE?
4) ¿En qué patologías es aplicable la ROE?
REFERENCIAS:
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.
2) Lodish H, Darnell J. Biología Celular y Molecular. 7° edición. Buenos Aires: Edit Médica Panamericana; 2016.
3) UCV. Protocolo de seguridad en laboratorios. Trujillo 2018.
Nota: Mínimo deben revisar y consignar 3 referencias bibliográficas, las cuales deben estar citadas en la discusión. Emplear las normas Vancouver.
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