EJERCICIOS RESUELTOS DE MACROMOLÉCULAS-BIOQUIMICA (9)

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CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE PROTEÍNAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL
FACULTAD DE BIOQUÍMICA Y CIENCIAS BIOLÓGICAS
Santa Fe, Argentina
Caracterización estructural de proteínas
¿Para qué purificar una proteína?
¿Qué hacer con una proteína homogénea?
Los estudios estructurales y funcionales permiten establecer relaciones entre la estructura y la función.
Diagramar estrategias en función de los métodos disponibles y de los objetivos buscados.
El análisis es integral e importa la identificación de residuos y/o dominios y su localización en los distintos niveles estructurales.
Métodos:
Químicos
Físicos
Bioinformáticos
Combinación de los anteriores
Determinación de estructuras
Primaria:
Secuencia de aminoácidos
Residuos funcionales
Secundaria:
Arreglos estructurales (estructuras super-secundarias)
Determinación de dominios funcionales
Terciaria:
Arreglos y dominios 3D funcionales
Cuaternaria:
Características oligoméricas
Relaciones funcionales
Estructura primaria
Métodos químicos:
Determinación del contenido de aminoácidos. Hidrólisis completa ácida y alcalina. Separación y cuantificación (HPLC).
Determinación de -SH y -S-S-. Tratamiento con reductor (2-ME o DTT) y posterior acetilación (iodoacetato). Oxidación a ácido cistéico con ácido perfórmico.
Proteólisis química y enzimática.
Determinación de extremos N- y C-term.
Proteólisis para la obtención de péptidos
Química:
Bromuro de cianógeno
Enzimática (proteasas):
Tripsina
Quimotripsina
Pepsina
– …
Armado de la secuencia por solapamiento de péptidos parciales.
Actualmente, uso de la biología molecular (a partir de la secuencia de ADN/ARN) y espectrometría de masas.
Estructura primaria
C-term:
Formación de ésteres (butanol)
Reducción a -amino-alcohol (borohidruro)
Enzimático, con carboxipeptidasa
N-term:
Sanger: fluoro-dinitrobenceno
Cloruro de dansilo (similar a Sanger)
Degradación de Edman: fenil-isotiocianato
Método de Sanger
Frederic Sanger fue el primero en determinar la secuencia completa de una proteína (insulina bovina) en 1953, lo que le valió el Premio Nobel en Química en 1958.
De hecho, lo ganó dos veces, ya que en 1980 lo recibió por su aporte a la determinación de la secuencia de ácidos nucléicos.
Su método consiste en la marca del aminoácido N-term con el reactivo de Sanger (fluoro-dinitrobenceno).
Alternativamente se puede utilizar cloruro de dansilo.
La proteína marcada es hidrolizada con HCl 6 M a 110 °C.
El perfil de elusión cromatográfico del residuo marcado se compara con el de todos los aminoácidos marcados.
Método de Sanger
Los reactivos producen residuos coloreados que se pueden seguir fácilmente por absorbancia.
Desventajas:
La proteína es completamente hidrolizada, por lo cual no se puede repetir el ciclo con la misma muestra.
En el segundo ciclo (y los subsiguientes) se debe eliminar el residuo N-term con una proteasa (aminopeptidasa).
Estos reactivos marcan el grupo N-term, por lo cual también pueden unirse a las cadenas laterales de los aminoácidos que posean grupos amino libres.
Degradación de Edman
El aminoácido N-term reacciona con el reactivo de Edman (fenil-isotiocianato), lo cual bajo condiciones levemente ácidas, forma un compuesto cíclico derivado de feniltioidantoína (PTH-derivado o PTH-aminoácido).
El PTH-derivado se identifica mediante las propiedades cromatográficas del mismo.
Luego del primer ciclo, el extremo N-terminal queda libre para reaccionar con el reactivo de Edman.
El proceso continúa hasta el final o hasta encontrar un puente disulfuro (se deben reducir y alquilar las Cys antes de comenzar).
Este método es útil para polipéptidos de hasta 50 aminoácidos.
Análisis comparativo de secuencias
Bases de datos de secuencias:
AND
Transcriptos (ARNm)
Proteínas
–	…
Identificación de dominios funcionales:
Mutantes al azar o sitio-dirigidas
Proteínas quiméricas
Intercambio de dominios
–	…
Análisis evolutivo (árboles filogenéticos)
Modelado por homología y dinámica
Estructuras secundaria y terciaria
Métodos físicos
Espectrofotometría de absorción
Ligando (metales o cofactores)
Cambios conformacionales (cuarta derivada)
Fluorescencia
Intrínseca
Ligando
Dicroísmo circular
Composición de estructuras secundarias
Cambios estructurales (mutantes)
Absorción UV-visible
UV-visible (cuarta derivada)
Fluorescencia
La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia, que caracteriza a las sustancias que son capaces de absorber energía en forma de radiaciones electromagnéticas y luego emitir parte de esa energía en forma de radiación electromagnética de longitud de onda diferente.
Las sustancias que son capaces de emitir luz al ser excitadas por diferentes tipos de radiación se denominan fluoróforos.
Es posible obtener una amplia variedad de colores por fluorescencia, dependiendo de la longitud de onda que emita el compuesto fluorescente.
Fluorescencia en proteínas
La medida de emisión fluorescencia es una propiedad mucho mas sensible y específica que la espectroscopía de absorción UV-Visible (presenta menos background)
Se puede medir fluorescencia intrínseca o aumentar la sensibilidad con el uso de fluróforos unidos en forma covalente o no covalente.
Se pueden efectuar medidas relativamente sencillas en estado estacionario para obtener información acerca de conformación y cambios conformacionales inducidos por solventes, temperatura, mutaciones, unión de ligandos, oligomerizaciones, etc.
Las medidas resueltas en el tiempo permiten un análisis estructural más fino, pero de mayor complejidad instrumental y de mayor complejidad de análisis teórico e interpretación en relación con la estructura.
Aplicaciones generales
Marcadores	para	la	detección	y	cuantificación	de compuestos y reacciones químicas.
Propiedades dinámicas de la célula:
Localización intracelular de componentes.
Visualización de movimientos intracelulares.
Evaluación de variables fisiológicas intracelulares.
Propiedades	estructurales,	funcionales	y	dinámicas	de macromoléculas:
Caracterización de estados conformacionales y seguimiento de cambios en solución:
Procesos de desnaturalización.
Cambios inducidos por unión a ligandos.
Accesibilidad de residuos e interacción con el solvente.
Distancias intramoleculares e intermoleculares de complejos.
–	…
Triptofano en proteínas
Es el principal fluoróforo	de	las proteínas y	es muy	sensible al
entorno molecular.
Es posible ver cambios en los espectros de emisión en respuesta a cambios en el entorno local del anillo indol:
Cambios de solvente
Conformacionales
Asociación de subunidades
Unión de sustratos
Desnaturalización
También es muy sensible al quenching (apagamiento) colisional (quenchers externos), como así también al estático por grupos vecinos en la proteína (formación de complejos).
Dicroísmo circular
Se mide absorción diferencial de haz de luz polarizada circularmente.
La absorción es por estereoisomería de aminoácidos y por isomería de estructuras terciarias.
En algunos casos (caracterización de mutantes) es muy útil para determinar si hay cambios importantes en la estructura 3D.
Upper panel: Circular dichroism spectroscopy in the ultraviolet wavelength region (UV-CD) of MBP- cytochrome b6 fusion protein in different detergent solutions. It shows that the protein in DM, as well as in Triton X-100 solution, recovered its structure. However the spectra obtained from SDS solution shows decreased ellipticity in the range between 200–210 nm, which indicates incomplete secondary structure recovery.
Lower panel: The content of secondary structures predicted from the CD spectra using the CDSSTR algorithm. The protein in SDS solution shows increased content of unordered structures and decreased helices content.
Métodos para estudiar la estructura 3D
Difracción de rayos X
Resonancia Magnética Nuclear (RMN)
Crio-Microscopía Electrónica
Modelado por homología
Utilización de herramientas bioinformáticas
Bases de datos (secuencias y estructuras)
Programas de modelado
Programaspara analizar el modelo
Difracción de rayos X
Método de alta resolución. Tiene como limitante que requiere la obtención de cristales de la proteína que difracten.
El haz de rayos X es difractado por los electrones alrededor de los núcleos atómicos, por lo que la difracción es proporcional al número de los mismos.
El patrón de difracción se relaciona con la posición espacial de los átomos que componen el cristal.
Los cristales se pueden obtener con ligandos unidos y en diferentes estados funcionales de la proteína.
Los resultados se depositan en bases de datos (PDB) que permiten modelar proteínas homólogas.
Cristalografía de rayos X
Cristalización: proceso de formación de cristales sólidos por precipitación en una solución.
¿Para qué obtener cristales?
Para obtener un modelo a nivel atómico que revele información estructural en 3D
La estructura determina la función
Obtención de cristales:
Difusión de líquidos (1)
Difusión de vapor (2)
RMN
Se utiliza radiofrecuencia para estudiar entornos de núcleos magnéticos, con electrones con spin no apareado.
Límite de resolución alrededor de 30-50 kDa.
Útil para analizar la unión de ligandos, como por ej. cationes.
Crio-Microscopía Electrónica (cryo-EM)
El Premio Nobel 2017 en Química se otorgó al trabajo que ayudó a los investigadores a observar cómo son las biomoléculas.
Jacques Dubochet, Joachim Frank y Richard Henderson fueron premiados por desarrollar la microscopía crio-electrónica (cryo-EM), una técnica que consiste en disparar haces de electrones a proteínas congeladas en solución, para deducir la estructura de la biomolécula.
Desde la izquierda: Jacques Dubochet, Joachim Frank and Richard Henderson.
La cryo-EM de proteínas como la β-galactosidasa ha progresado desde el mapa de densidad con baja resolución a la izquierda hasta las coordenadas atómicas a la derecha.
Estructura de la alcohol oxidasa de Pichia pastoris obtenida por crio-EM
Protein Data Bank (PDB)
https://www.rcsb.org/
Modelado por homología
Secuencia de la proteína a modelar
Estructura de una proteína (PDB)
Identidad mayor al 30%
Alineamiento de secuencias (BioEdit)
Paso clave para el éxito del proceso
Construcción del modelo (Modeller)
Verificación del modelo (Verify3D)
Proceso iterativo
Corregir errores y repetir (alineamiento)
Estructura cuaternaria
Determinación de masa molecular:
Condiciones nativas: cromatografía de exclusión molecular (filtración por geles)
Condiciones desnaturalizantes: SDS-PAGE
Es necesario estar seguros sobre la pureza de la muestra.
Se pueden combinar con secuenciación N-term (degradación de Edman) y espectrometría de masas (MALDI-TOF)
La ADP-glucosa pirofosforilasa del alga verde
Chlamydomonas reinhardtii se purificó a homogeneidad
Para el caso de la enzima de cianobacterias la demostración de la estructura cuaternaria necesitó de electroforesis bidimensional: IEF y SDS-PAGE.
La ADP-glucosa pirofosforilasa de cianobacterias es homotetramérica (α4). La estructura cuaternaria no está relacionada con la especificidad por 3PGA y Pi como reguladores alostéricos, sino con que le enzima sea de procariotas o eucariotas. En la enzima de estos últimos, la subunidad α es la catalítica, mientras que la subunidad β cumple funciones regulatorias, determinando variaciones en la modulación de la actividad según la especie y el tejido. La subunidad α está más conservada entre organismos distintos, no así la β.
Proteómica
Un proteoma es el complemento completo de proteínas expresado por un
genoma, célula, tejido u organismo.
Más específicamente, es el juego completo de proteínas expresadas a un determinado tiempo y bajo condiciones definidas.
El proteoma es más complejo que el genoma y obliga a redefinir términos relacionados a sistemática de proteínas.
La proteómica es el estudio sistemático de varias y diversas propiedades de las proteínas determinadas en forma paralela, a fin de proveer una detallada descripción de la estructura, la función y el control de los sistemas biológicos en distintas condiciones (salud y enfermedad).
El proteoma de un individuo se define como la suma de todas las especies proteicas, y sus dinámicas en el tiempo, ocurrentes durante la vida de tal individuo.
El subproteoma es la composición de especies proteicas de un compartimiento biológico a un cierto tiempo y bajos condiciones ambientes definidas.
Isoelectroenfoque (IEF)
SDS-PAGE
Visualización
Consideraciones:
Alta sensibilidad
Rango lineal amplio para cuantificación
Reproducibilidad
Compatibilidad con espectrometría de masas
Baja toxicidad y amigable con el ambiente
Opciones:
Azul de Coomassie (R-250 or G-250)
Tinción con plata
Marcado fluorescente / Tinción fluorescente
Autoradiografía
Immunodetección
Fluorescencia
Características:
Unión del colorante a los residuos básicos y al enlace peptídico
Sensibilidad (2 ng/spot)
Rango dinámico lineal 103-104
Protocolo rápido y sencillo
Compatibilidad con MS
Mínima variación entre proteínas
Punto final
Buena reproducibilidad
Desventajas:
Muy caro
Fluoróforo
Equipo para detección
Programas informáticos
Difference gel electrophoresis (DIGE)
2D	gel	electrophoresis	is	the	technology	that everyone loves to hate. Although almost everyone
would like to replace it, the resolution and sensitivity it offers are exquisite and unsurpassed if one wants a global view of cellular activity’.
Fey SJ, Larsen PM (2001) Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 26-33
Espectrometría de masas (MS)
Técnica que permite la determinación de la masa de moléculas
individuales ionizadas en fase gaseosa.
El espectrómetro de masas permite analizar con gran precisión la composición de diferentes elementos químicos e isótopos atómicos, separando las núcleos atómicos en función de su relación masa-carga (m/z).
La ionización de las moléculas puede hacerse por diferentes
procedimientos:
Electrospray ionization (ESI)
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)
También puede variar la estrategia de análisis el espectrómetro
Trampa iónica (IT)
Cuadrupolo (Q)
Tiempo de vuelo (TOF)
Orbitrap
Combinación de las anteriores
https://www.youtube.com/watch?v=8R1Oyqx5KfE
Identificación - MASCOT
http://www.matrixscience.com/search_form_select.html
	804.580854512	1283.88418102	1479.90559899	1633.70799011
	832.588918326	1305.87244587	1486.95496241	1640.04436579
	834.574385642	1399.77189178	1491.69585487	1749.68131785
	870.542826657	1415.73738647	1497.10011383	2922.05749136
	893.36387025	1419.79615703	1502.79867006	
	927.700980104	1421.81073941	1511.97601014	
	974.662007756	1428.83627547	1518.89309764	
	1121.73156833	1437.82117772	1554.63555812	
	1163.79916217	1439.9261255	1567.83996225	
	1249.74993633	1464.70494172	1573.90102175	
List of MS (m/z) and MS/MS (m/z) values:
1224.6267 ions(112.1101, 129.1418, 165.1778, 168.0746, 175.1404, 175.4802, 177.5307, 201.1069, 212.1537, 254.2159, 255.1854, 264.1220, 266.1837,
272.2085, 276.1790, 300.1838, 326.1931, 343.2791, 353.2613, 379.2458, 380.2602, 381.2698, 389.2641, 390.2594, 423.2889, 428.3351, 440.3031, 460.3051,
477.3147, 478.3230, 481.7392, 495.3629, 520.3602, 522.8755, 537.3903, 538.8937, 557.3425, 558.4269, 560.3795, 575.3544, 615.4930, 633.4475, 650.4963,
652.1336, 653.6190, 660.4609, 672.4687, 688.4722, 707.3185, 747.5167, 748.5384, 750.0945, 757.5059, 765.5611, 781.4252, 785.5366, 820.5284, 836.5811,
840.7024, 846.6667, 851.4269, 906.3637, 949.7706, 953.5992, 954.7141, 1046.9182, 1047.6230, 1075.6365, 1077.8207, 1133.7629)
1373.6116
1490.6090
1564.7546 ions(167.1190, 169.1430, 171.1330, 175.1469, 197.1546, 203.5020, 215.1664, 239.0860, 268.1883, 284.2437, 286.1687, 303.2155, 332.2203,
341.2678, 353.2215, 357.2264, 367.2654, 369.1993, 374.2527, 377.1695, 378.3252, 384.2527, 385.2883, 403.2619, 466.3441, 468.3079, 471.2787, 472.2390,
479.2509, 482.3883, 484.3476, 489.2919, 560.3613, 586.3267, 593.2397, 603.3513, 604.3146, 611.3920, 634.5056, 650.4175, 688.4684, 693.3892, 708.4189,716.4481, 733.3248, 733.5054, 750.4358, 753.4319, 760.4202, 763.5436, 776.3953, 780.4843, 787.5020, 796.4583, 835.5974, 869.4702, 896.5518, 898.4522,
907.5488, 913.5543, 926.5986, 984.6169, 1046.7034, 1048.5839, 1064.6660, 1067.6471, 1081.6553, 1111.6836, 1163.7318, 1180.7692, 1281.8600, 1394.9752,
1521.3995)
2030.9626
2484.1165
2911.3179