Penicilina y cefalosporina - Investigación

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Penicilina y cefalosporina
Antecedentes:
John Burdon Sanderson y William Roberts: esencia del concepto de antibiosis. Observeron que algunos hongos inhibían bacterias.
John Tydall: 1876 fungi consumen el oxígeno de las bacterias y por ello inhibe su crecimiento.
Ernest Duchesne: Antagonismo Penicillium glaucum y Bacillos.
Pasteur y Joubert, Cornill y Babes: experimentos in vitor de antagonismo.
Garre: 1887 Bacillus fluorescens inhibición Straphyclococcus pyogenes.
Selman Waskman: Nombró a estos antagonismos antibiosis ¨vida contra vida¨.
Descubrimiento de la penicilina: 
1928 Alexander Fleming. Estudaiba el crecimiento las características de sthaphylococci. Encontró un moho azul verdoso con alta inhibición de staphylococci cerca de su micelo.
Mismo año, aisló y cultivó el moho, lo llamó Penicillium rubrum y a la sustancia que producía penicilina.
Estudio de bacterias contra penicilina, inhibía muchos patógenos humanos (staphylococcus, streptococcus, pneumococcus y gonococcus)
Paine: 1930’s uso la sustancia que encontró Fleming en pacientes con enfermedades en la piel y los ojos producidas por pneumococcus y gonococcus.
Estudios bioquímicos en la penicilina y su extracción
Debido a la importancia biomédica de la penicilina, en 1932 Clutterbuck comenzó a estudiar la especie utilizada por Fleming. Encontró que la peniculina era sintetizada por el gongo cuando crecía en un medio sintético por 16-20 días y que la sustancia era estable en un pH de 5-6 por 3 semanas. 
El hongo productor fue caracterizado de nuevo por Charles Thom y la renombró Penicillium notatum.
En el contexto de pocos recursos debido a la segunda guerra mundial, en 1939 Howard Florey estuvo estudiando las características y propiedades de la penicilina así como su interferencia en el crecimiento de algunos microorganismos sensibles. A su equipo se unieron Ernst Chain y Norman Heatley. Encontraron nuevos métodos para su análisis y mejoraron los métodos de extracción del compuesto de los medios. En 1940 hicieron experimentos con ratones a los que la penicilina les permitió sobrevivir dosis normalmente letales de streptococci.
Después de esto Florey y su grupo querían comenzar a hacer experimentos similares con humanos convencidos de la importancia médica de sus descubrimientos. En conjunto con Charles Fletcher en 1941 trataron con éxito a los primeros 5 pacientes, algunos se recuperaron por completo, otros probablemente se hubieran recuperado teniendo una dosis más adecuada. 
Aunque convirtieron unas habitaciones vacías de la escuela de patología William Dunn en su pequeña una fábrica de penicilina, la producción seguía siendo muy baja.
Esto los llevó a tratar de buscar métodos para recuperar la penicilina de la orina de los pacientes.
Lo siguiente fue buscar financiamiento de compañías farmacéuticas para aumentar la producción, pero estaban ocupadas produciendo recursos para la guerra por lo que rechazaron el proyecto. Por esto, Florey y Heatley viajaron a Estados Unidos en 1941 para buscar financiamiento y tecnología para su proyecto y lo consiguieron, por esto aunque los británicos fueron quienes descubrieron la penicilina, los estadounidenses fueron quienes se quedaron con las patentes para su producción.
Descubrimiento de la cefalosporina
En 1945 Giusseppe Brotzu se preguntó por qué en su ciudad la fiebre tifoidea era menos virulenta que en otros lugares. Así que fue a la bahía Su Siccu donde mucha gente joven acudía a nadar y en aunque en este lugar se descargaba el drenaje de la ciudad no había casos de tifoidea relacionados. Tomó una muestra del agua y probó su efecto en un cultivo de Salmonella Thypi. Como resultado logró aislar una especie de hongo que producía una sustancia efectiva contra bacterias gran-negativas. El hongo que encontró lo llamo Cephalosporium acremonium y hoy se le conoce como Acremonium chysogenum.
Aunque Brotzu logró aislar la sustancia que producía este hongo, trató en vano de convencer a las farmacéuticas italianas de invertir en su investigación, por lo que fue a Inglaterra a buscar recursos, donde los consiguió e incluso fue nominado a un premio Nobel por el descubrimiento de este hongo.
Los estudios encontraron que podría producir al menos 5 diferentes tipos de antibióticos.
EL primero en ser extraído y aislado fue la Cefalosporina P, pero este no fue el que originalmente describió Brotzu, ya que este solo mostraba efectividad contra ciertas bacterias gram positivas. En 1949 encontró la Cefalosporina N que era efectiva contra contra bacterias gran negativas y positivas. Se demostró que era eliminada por una penicilinasa, por lo que hoy en día se le conoce como Penicilina N.
En 1953 Guy Newton y Edward Abraham encontraron la cefalosporina C, esta es antibiótica contra Straphylococcus aerus, Salmonella thypi y Escherichia coli. Esta cefalosporina demostró ser inofensiva aún siendo administrada en grandes cantidades de forma intravenosa en ratones, lo que los protegia de infecciones por streptococci.
 Biosíntesís de la penicilina y la cefalosporina
Para ambas, la ruta de biosíntesis comienza con una condensación no ribosomal de 3 aminoácidos: ácido L-a-aminoadipídico. L-disteína y L-valina para producir el tripéptido D-(L-a-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina (ACV). 
Para el segundo paso, el tripéptido se cicla formando isopenicilina N. Aquí es donde diverge el proceso.
Para Penicillium, la cadena lateral de a-aminoadipil es cambiado por una cadena lateral hidrofóbica, mientras que en Acremonium, la isopenicilina N es convertida en penicilina N por la acción de un sistema de 2 2 enzimas, la acil CoA sintetasa y la acil CoA racemasa (Enzimas que catalizan la inversión de un centro estereoespecífico en una molécula biológica) y finalmente el CoA tioester es hidrolizado para la formación de isopenicilina N.
En el caso de la vía de la cefalosporina, la penicilina N es transformada en deacetoxicefalosporina C por la expansión del anillo dihidrotiazónicode 5 átomos en un anillo de 6, esto es catalizado por la CAOC sintetasa / DAC hidroxilasa. Esta misma enzima trnaforma la droxilatin deacetoxicefalosporina C en deacetil cefalosporina C. Por último, esta es acetilada dando como resultado la cefalosporina C.
Genetica de la biosíntesis de la cefalosporina y la penicilina.
En P. chrysogenum, los genes que codifican las 3 enzimas implicadas en la biosíntesis de la penicilina están agrupadas en un cluster. El pcbAB forma la ACV sintetasa. El pcbC forma la isopenicillin N sintetasa. El penDE forma la isopenicillin N aciltransferasa.
En A. Chrysogenum tenemos 2 clusters en diferentes cromosomas. El pcbAB también forma la ACV sistentasa, y el pcbC la isopenicillin N sintetasa. Aquí es donde divergen. cefD1 y cefD2 forman la enzima que convierten la isopenicilina N en penicilina N. Los siguientes pasos del proceso son llevados a cabo por enzimas producidas por cefEG. Y el paso final a cefalosporina C es catalizado por una proteína formada por cefG.
Mejoras en la producción industrial de antibióticos B-lactamicos
La aplicación de técnicas clásicas y recombinantes del DNA han sido importantes para aumentar la producción de penicilina y cefalosporina, así como para obtener antibióticos semisintéticos de bajo costo.
Tradicionalmente se han producido mutaciones por 2 tipos de métodos: físicos (radiación ultravioleta, rayos gamma y X) y químicos (etil metanosulfonato, N-metil-N’-nitro-N-nitrosuguanidina, gas mostaza y ácido nitroso).
Modelos experimentales de producción, selección y empleo de cepas mutantes de P. chrysogenum con alta producción de penicilina han sido desarrolladas desde mediados del siglo pasado, partiendo de la base de la Wisconsin Q-176, un hongo encontrado en un melón. Por otro lado las mejoras en C. acremonium se han desarrollado desde la cepa inicialmente aislada por Brotzu.
Para esto se han necesitado muchos métodos, compuestos químicos y proteínas como indicadores para medir e identificar las posibles mutaciones. Una de las estrategias más utilizada debido a su bajo costo es el aislamiento de mutantespara su crecimiento en colonias pequeñas y compactas en medios bien definidos.
Una desventaja de la mejora por mutaciones es que las cepas pueden ser muy inestables ya que las mutaciones son aleatorias y muchas veces no afectan al gen de interés o si lo hacne incluso pueden acabar por completo con su capacidad de producción. Por eso es un proceso muy extenso y que requiere después de generar las mutaciones hacer cruzas entre distintos organismos para generar una mejora.
La biología molecular ha representado un avance muy importante para el mejoramiento de cepas para producciones industriales. Las técnicas que emplea permiten el contorl de las modificaciones en el genoma y permiten establecer relaciones causa-efecto, además de identificar de una manera más sencilla las rutas de biosíntesis de los distintos productos. La forma más sencilla de incrementar la producción inicial es aplicar las ténicas de DNA recombinante que permiten aumentar la cantidad de veces que encontramos un determinado gen. Esto permite agregar la copia sin los efectos secundarios de otros procesos de mutación.
La primera vez que se usó con éxito esto en la producción de antibióticos B-lactámicos fue con el gen cefEF de Acremonium chrysogenum. La sobre expresión del gen ayudó a reducir la cantidad de penicilina N acumulada e incrementar la producción de cefalosporina C.
La sobre expresión del gen pcbAB de Aspergillus nidulans ha aumentado 30 veces la producción de penicilina.
El agregar copias adicionales del gen pcbC en P. chrysogenum Wisconsin 54-1255 no ha mostrado un aumento considerable de la producción de penicilina G, pero sí ha aceleradola biosíntesis entre 30 y 80 horas.