Seminario de ácidos nucleicos 2023

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Química Biológica
Seminario: Ácidos Nucleicos
Dibujo realizado por Rodolfo Fucile
Estructura y propiedades fisicoquímicas
- Nucleótidos
- Ácidos nucleicos - ADN
- ARN
Purificación
- ADN y ARN
- ARN mensajero
- Plásmidos
Secuenciación, amplificación y cuantificación
Nucleótidos
Los nucleótidos están formados por tres componentes 
característicos:
Una pentosa: 2´-desoxi-D-ribosa o D-ribosa
Grupos fosfatos (1, 2 ó 3)
Una base nitrogenada: Purina o Pirimidina
Nucleósido 
Base nitrogenada + Pentosa
Nucleótido
Base nitrogenada + Pentosa + Ácido 
fosfórico
Polinucleótido o Ácido nucleico
Nucleótido + Nucleótido + ....
Las bases nitrogenadas en los nucleótidos pertenecen, en general, a dos tipos:
PIRIMIDINAS
PURINAS
Adenina (A) Guanina (G)
(ADN y ARN) (ADN y ARN)
Citosina (C) Timina (T) Uracilo
(ADN y ARN) (ADN) (ARN)
Bases nitrogenadas
Intermediarios 
Metabólicos
El ADN y el ARN pueden contener también otras bases secundarias
tRNA --> Inosina, seudoUridina, riboTimidina.
Otras bases nitrogenadas
Las pentosas de los nucleótidos son:
2´-desoxi-D-ribosa en el 
ADN
D-ribosa en el 
ARN
Pentonsas
Desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos de los ácidos nucleicos
Funciones de los nucleótidos
ATP
AMPc
- Unidades monoméricas de los ácidos nucleicos
- Metabolismo energético, ejemplo el ATP que actúa 
como dador de fosfato para la generación de los otros 
nucleósidos 5´-trifosfatos (por ej. GTP, UTP, CTP).
- Mediadores fisiológicos: El AMPc actúa como segundo 
mensajero en el metabolismo y vías de activación. 
- Componentes de coenzimas, tales como el NAD, FAD 
y coenzima A, constituyentes metabólicos en muchas 
rutas metabólicas.
- Intermediarios activados, tales como UDP-glucosa, 
GDP-manosa, la GDP-fucosa, la UDP-galactosa y el 
CMP-ácido siálico en la síntesis de glucoproteínas; CDP-
colina, CDP-etanolamina y CDP-diacilgliceroles en el 
metabolismo de fosfolípidos.
- Todas las bases nucleotídicas presentan una alta absorción de luz de longitudes
de onda cercanas a 260 nm.
Propiedades químicas de los nucleótidos
- Las bases púricas y pirimidínicas son hidrofóbicas y relativamente insolubles en 
soluciones acuosas con pH fisiológico.
-Las pirimidinas son moléculas planas y las purinas casi planas, con una ligera
deformación.
- Las bases púricas y pirimidínicas libres pueden existir en dos o más formas tautoméricas 
según el pH.
Tautomería ceto-enólica (lactama-lactima): interconvierte un grupo ceto (=O) y 
enol (-OH) Extracíclicos cerca de un N cíclico. Se puede producir en G, C, T y U
Tautomería imina-amina: interconvierte un amino (-NH) extracíclico en un amino 
(=N) cerca de un N cíclico. Se puede dar en G, A y C.
Propiedades químicas de los nucleótidos
Ácidos Nucleicos
- La composición de bases varía de una especie a otra. 
- La composición de bases es la misma en distintos tejidos de una misma especie.
- La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T): %A = %T
- La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C): %G= %C
- La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidínicas (T+C): 
(A+G) = (T + C) 
- La proporción entre (A+T) y (G+C) es característica de cada organismo, pudiendo tomar por 
tanto, diferentes valores según la especie estudiada. 
Estructura del ADN … Un poco de historia …
Proporciones de las bases nitrogenadas
Reglas de Chargaff – 1949/1950
Proporción de bases nitrogenadas en algunos organismos 
- Patrón helicoidal del ADN
- Dos periodicidades a los largo del eje, una
primaria de 3,40 Å y una secundaria de 34 Å
Patrón de Difracción de Rayos 
X
Estructura del ADN
El primer modelo estructural completo del DNA.
Cuando James Watson (izquierda en la fotografía) y Francis Crick plantearon en 1953 la
estructura del ADN utilizando los datos de Rosalind Franklin, eran estudiantes de
investigación en el Laboratorio Henry Cavendish de la Universidad de Cambridge.
Modelo de Watson y Crick
Estructura del ADN
- Dos cadenas helicoidales de ADN enrolladas alrededor del mismo eje
formando doble hélice dextrógira.
- Las cadenas hidrofílicas formadas por desoxirribosa y los grupos fosfato
alternados se encuentran en el exterior de la hélice.
- Las bases púricas y pirimidínicas apiladas en el interior de la doble
hélice, anillos casi planos apilados en forma perpendicular al eje
longitudinal
- Cada base apareada en el mismo plano con la base de la otra cadena
mediante puentes de hidrógeno.
- Disposición antiparalela de las hebras de ADN.
Modelo de Watson-Crick para la estructura del ADN
Modelo original: 10 pares de bases o 
34 Å (3.4 nm) por vuelta de hélice.
Mediciones posteriores 
confirmaron: 10,5 pares de bases o 
36 Å (3.6 nm) por vuelta. 
Estructura del ADN
Unión 
fosfodiéster
Grupo 
fosfato
C
- Enlaces de hidrógeno
- Apilamiento de bases e interacción hidrofóbica
- Interacciones iónicas
Fuerzas que estabilizan la doble hélice
Forma A Forma B Forma Z
Sentido de giro de la hélice Dextrógiro Dextrógiro Levógiro
Diámetro de la hélice ~26 Å ~20 Å ~18 Å
Pares de bases por vuelta de hélice 11 10.5 12
Aumento de tamaño de la hélice por pb 2,6 Å 3,4 Å 3,7 Å
Forma A Forma B Forma Z
Estructura del ADN - Alternativas al modelo de doble hélice
Variaciones estructurales del ADN
Secuencias autocomplementarias
Palíndromo: repeticiones invertidas de 
secuencia con simetría binaria en las dos 
hebras de ADN.
Horquilla Estructura cruciforme
Las secuencias palindrómicas suelen formar parte del sitio de
reconocimiento de muchas proteínas que se unen a secuencias específicas de
ADN.
No forman estructuras en horquilla o 
cruciformes.
Estructura espejo
Variaciones estructurales del ADN
Apareamiento tipo Hoogsteen: Bajo ciertas condiciones, los nucleótidos pueden formar puentes de
hidrógeno adicionales dando lugar a tramos de ADN de triple hélice.
ADN-H: “in vitro" es posible obtener tramos de triple hélice intercalando oligonucleótidos cortos
constituidos solo por pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una doble hélice. No se
conoce la función biológica del ADN-H aunque se ha detectado en cromosomas eucarióticos.
Apareamiento tipo 
Hoogsteen 
Estable a pH ácidos (citocina protonada, 
C+)
H-
ADN
Estructura del ADN – ADN triple
ADN cuádruplex: Los extremos de los cromosomas eucariotas (telómeros) tienen una
estructura especial con un extremo 3‘OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se
repite muchas veces en tándem una secuencia rica en guaninas. Se piensa que el ADN
cuádruplex telomérico serviría para proteger los extremos cromosómicos de la degradación
enzimática.
Ejemplo de secuencia telomérica rica en guaninas (G):
5´P TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG 3'OH
Estructura del ADN – ADN cuádruplex
Desnaturalización de los ácidos nucleicos
Propiedades fisicoquímicas del ADN
- Alta Temperatura
Favorecida por:
- Baja Fuerza Iónica (repulsión de Fosfatos)
- Alto pH (desprotonación de las bases)
tm: temperatura de fusión: temperatura a la cual la mitad de la cantidad de ADN total se encuentra 
como hebras sencillas separadas.
Desnaturalización de los ácidos nucleicos: Temperatura de fusión 
(Tm)
Propiedades químicas del ADN
Efecto hipercrómico
La desnaturalización produce efecto hipercrómico.
La renaturalización ocasiona un efecto hipocrómico.
Propiedades químicas del ADN
Las moléculas de ADN se encuentran, dentro de la célula, 
empaquetadas en estructuras denominadas cromosomas.
Las bacterias tienen un solo cromosoma, mientras que los 
eucariotas tienen múltiples cromosomas. 
Un solo cromosoma contiene miles de genes, cada uno codificante 
de una proteína o ARN, con función estructural o catalítica. 
Todos los cromosomas de un organismo constituyen su genoma
Las topoisomerasas modifican el gradode relajación o enrollamiento del ADN 
Superenrollamiento del ADN
Superenrollamiento es el retorcimiento o giro sobre sí misma de una hélice, de 
forma que su eje no sigue una línea recta, sino otra hélice 
Topoisómeros
Moléculas de ADN con la misma secuencia pero distinto grado de enrollamiento
1: ADN altamente superenrollado.
2 y 3: efecto del tratamiento del ADN 
superenrollado con una topoisomerasa I. 
La muestra en la calle 3 se incubó con la 
enzima durante más tiempo.
ADN 
relajado
ADN 
Super
enrollado
Topoisomerasa
Tipo I: realizan un corte transitorio en una 
de las dos hebras de ADN
Tipo II: realizan un corte en ambas hebras. 
Requiere ATP.
Las topoisomerasas modifican el grado de relajación o enrollamiento del ADN 
El nucleosoma constituye la unidad fundamental de organización de la cromatina
a partir de la cual se organiza el empaquetamiento de orden superior.
La cromatina y los cromosoma son dos aspectos 
morfológicamente distintos de una misma entidad celular
Cromosomas
ARN
ARN
Principales tipos de ARN
- Ribosomal (80%)
- Transferencia (15%)
- Mensajero (5%)
3 tipos más comunes:
Reparación de ADN
Regulación epigenética
Telomerasa
Silenciamiento génico
Otras funciones del ARN
Patrón típico de un ARN de 
cadena única de giro a la derecha. 
El ARN puede formar pares de bases con regiones complementarias de
ADN o ARN, siguiendo las mismas reglas de apareamiento de bases que el
ADN: la G se aparea con C y la A con U.
Las monohebras tienden a adoptar una
conformación helicoidal dextrógira,
dominada por las interacciones de
apilamiento de bases.
Fenilalanina-ARNt 
de levadura
Ribozima de virus 
vegetal
Segmento de ARNm 
de protozoo
Bases: en gris
Fosfatos: en amarillo
Ribosa-fosfato: en verde
Estructura del ARN
Bucle interno
Horquillas
Complementariedad
interna
Protuberancia
Las regiones apareadas adoptan generalmente una
estructura en hélice dextrógira en la forma A.
Estructura del ARN
El ADN es más estable que el ARN
El ADN no presenta 2′ OH por lo que presenta mayor estabilidad en soluciones 
alcalinas.
Hidrólisis del ARN en condiciones alcalinas
Purificación y cuantificación 
de ácidos nucleicos
Purificación de ácidos nucleicos 
Durante todo el 
procedimiento se 
debe usar 
soluciones y 
material estéril, 
además de guantes
❖Métodos físicos: Homogenización mecánica en solución,
molienda manual mediante uso de mortero, bolitas de vidrio
❖Métodos químicos: uso de detergentes
❖Métodos enzimáticos:
lisozima (rompe enlaces en peptidoglicanos de pared celular de las bacterias); 
proteasa (rompe enlaces peptídicos)
liticasa (rompe uniones entre glucanos presentes en la membrana celular de levaduras)
Purificación de ácidos nucleicos: 
Disgregación del tejido
- EDTA : Quelante de iones divalentes. Inhibe nucleasas y disminuye degradación 
del ácido nucleico durante la extracción/purificación
- Sales: cloruro de sodio (NaCl), recubre al DNA y ayuda a evitar su degradación
- TRIS-HCl: solución que aporta un pH entre 7.5 y 8.2 para purificación de ADN, y 
4,5 para la purificación de ARN
- Proteinasa K: enzima que degrada proteínas
- RNAsa para la purificación de ADN
- Inhibidores de RNAsa para la purificación de ARN
Clarificación 
Purificación de ácidos nucleicos
solución de lisis para la extracción de ADN/ARN
Con tratamiento
con 
Proteinasa K
Con tratamiento
con 
Subtilisina A
Purificación de ácidos nucleicos
Tratamiento con diferentes proteinasas
- Extracción orgánica (fenol/cloroformo/alcohol isoamílico)
- Extracción inorgánica o “Salting out”
- Unión a soportes sólidos: columnas con matrices de sílica o 
intercambio iónico, partículas magnéticas.
- Purificación de ARN mensajero: columnas de oligo(dT)
Purificación de ácidos nucleicos
Purificación
Extracción orgánica
(fenol/cloroformo/alcohol isoamílico)
- Fenol desnaturaliza proteínas 
- Cloroformo permite la formación de 2 fases
Se recupera la fase acuosa
1- Precipitación con Isopropanol --> Baja la polaridad del medio.
(25:24:1)
2- Se lava el pellet con EtOH 70% --> Polaridad intermedia, solubiliza sales.
3- Se resuspende en agua.
ADN
Fenol pH 8
Extracción orgánica
(fenol/cloroformo/alcohol isoamílico)
ARN
ADN
Fenol pH 4
Fenol pH 8
Extracción inorgánica: “salting-out”
Acetato de Potasio
Acetato de Amonio
Cloruro de Sodio
Unión a soportes sólidos: intercambiador iónico
Unión a soportes sólidos: matrices de sílice
Unión a soportes sólidos: Partículas magnéticas
Purificación de ARNm:
columnas de oligo(dT)
Partículas magnéticas 
con oligo(dT)
(1) Detergente (SDS) lisa la bacteria; el NaOH
desnaturaliza al DNA plasmídico y cromosómico en
cadena simple.
(2) KAc/HAc neutralizan el pH e inducen la
precipitación de proteínas y lípidos. El ADN
cromosómico parcialmente renaturalizado queda
atrapado en el precipitado, mientras que el
plasmídico renaturalizado permanece en solución.
(3) Centrifugación que separa ambos tipos de ADN.
- Solución de resuspensión (Tris-HCl 50 
mM, EDTA 10 mM pH 8). 
- Solución de lisis alcalina (NaOH 200 
mM, SDS 1%).
- Solución de renaturalización 
(K+AcO3M pH 4.8).
Purificación de ADN plasmídico
ADN plasmídico
ADN cromosómico
Análisis del ácido nucleico
Permite determinar la cantidad, la calidad y el tamaño molecular del ADN o 
ARN purificado.
• Espectrofotometría UV: medida de la Absorbancia a 260 nm
• Electroforesis en geles de agarosa
Cuantificación de ácidos nucleicos: 
Absorbancia a 260 nm
- ADN y ARN presentan su máximo de absorción a 260 nm
- Proteínas presentan su máximo de absorción a 280 nm.
[ADN] = A260 x factor de dilución x ε (50 µg/mL)
[ARN] = A260 x factor de dilución x ε (40 µg/mL)
Pureza
Relación A260/A280
1.7 – 2.0 = buena purificación
<1.7 = contaminación con proteínas u otros componentes 
1 µl muestra
Cuantificación de ácidos nucleicos: 
Nanodrop
Electroforesis en geles de agarosa
ADN o ARN
Siembra de la muestra en el pocillo (well) 
del gel de agarosa. Aplicación de un campo 
eléctrico
Las moléculas se mueven a través 
de los poros del gel en una 
relación inversa a la longitud de la 
cadena
Revelado con bromuro de 
etidio u otras moléculas 
fluorescentes
Punto de siembra
Dirección 
de la 
migración
Bromuro de etidio intercalado en el ADN
Revelado de geles con bromuro de etidio
Cuando se expone esta sustancia a luz 
ultravioleta, emite una luz roja-anaranjada, 
que se intensifica unas 20 veces después 
de haberse unido a una cadena de ADN
Electroforesis en geles de agarosa
100 bp ladder
1 kb ladderLambda ADN cut with 
Hind IIILambda ADN
48,500 bp (48.5 
kb)
12,218 bp
23,130 bp
9,416 bp
6,557 bp
4,361 bp
2,322 bp
2,027 bp
517 bp
1,636 bp
3,054 bp
6,018 bp
100 bp
300 bp
600 bp
1,000 bp
1,500 bp
1,018 bp
2,036 bp
El tamaño se expresa en pb
Marcadores de peso molecular conocidos
Electroforesis en geles de agarosa
ADN plasmídico ARN
RNAsa
Secuenciación de ADN
�H
- Método enzimático de terminación 
de cadena de Sanger, también 
conocido por el método dideoxi.
- Método de secuenciación 
automática
-Next Generation Secuencing 
(NGS)
Método enzimático de terminación de 
cadena de Sanger
- ddNTPs fluorescentes
- Espectro único
Método de secuenciación automática
Láser
Fluorómetro
Gel
Cada ddNTP está unido a un molécula fluorescente de diferente color
ddTTP rojo; ddGTP negro; ddATP verde; ddCTP azul 
Método de secuenciación automática
Next Generation Sequencing (NGS)
o de Segunda Generación
Secuenciación de Tercera Generación
- Secuenciación en tiempo real y de molécula única
- Lecturas largas (ONT hasta 4Mbp)
- Detección de metilaciones y otros tipos de modificaciones
MinION ONT
Pacific Biosciences
Portable
Accesible (MinION starter kit: u$s 1000)
ONT
NGS vs Tercera Generación
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR, de la sigla en 
inglés Polymerase Chain Reaction )
● ADN molde
● Cebadores(Primers)
● ADN polimerasa (Taq polimerasa)
● Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP)
● Mg+
2n siendo n el # de ciclos Amplificación exponencial
PCR (Polymerase Chain Reaction)
✔ ¿Qué enzima se usa?
✔ ¿Cuál es el producto de esta 
reacción?
✔ ¿Es específica?
Transcripción reversa
(RT-PCR, reverse transcription
PCR)
NO !
✔Se obtiene el cDNA de “todo” el
ARN mensajero.
✔Depende de la actividad de la
enzima transcriptasa reversa.
✔El producto es el ADN copia
(cDNA)
Cuantificación de ADN mediante PCR en tiempo real 
(qPCR)
qPCR - Estrategias de detección
Basadas en moléculas
intercalantes
Basadas en sondas 
marcadas
qPCR – Curva de calibración
PCR digital
Amplificación isotérmica, Loop-Mediated Isothermal 
Amplification (LAMP)
(B)
(B)
(A)
(A)
(A)
Amplificación isotérmica, Loop-Mediated Isothermal 
Amplification (LAMP)
Amplificación isotérmica, Loop-Mediated Isothermal
Amplification (LAMP)
PLoS Neg Trop Dis 2023;17(4):e0011290. doi: 10.1371/journal.pntd.0011290 
A)
B)
C)