Seminario de Ãcidos nucleicos_Con_Textos_2023

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La unión de la base nitrogenada a la pentosa recibe el nombre de nucleósido y se realiza a
través del carbono 1’ de la pentosa y los nitrógenos en las posiciones 3 (pirimidinas*) o 9
(purinas⧫) de las bases nitrogenadas, mediante un enlace de tipo N-glucosídico.
La unión del nucleósido con el ácido fosfórico se realiza a través de un enlace de tipo éster
entre el grupo OH del carbono 5’ de la pentosa y el ácido fosfórico, originando un nucleótido.
Los nucleótidos son las unidades o monómeros utilizados para construir largas cadenas de
polinucleótidos.
- Nucleósido = Pentosa + Base nitrogenada.
- Nucleótido = Pentosa + Base nitrogenada + Ácido fosfórico.
- Polinucleótido = Nucleótido + Nucleótido + Nucleótido + ....
*Las bases púricas derivadas de la purina (fusión de un anillo pirimidínico y uno de imidazol)
son Adenina y Guanina.
⧫Las bases pirimidínicas (derivadas de la pirimidina) son Timina, Citosina y Uracilo.
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Las bases nitrogenadas que generalmente forman parte del ADN son: adenina (A), guanina
(G), citosina y timina (T). Las bases nitrogenadas que forman parte del ARN son: adenina (A),
guanina (G), citosina (C) y uracilo (U). Es decir que la timina es específica del ADN y el
uracilo es específico del ARN.
Los tipos de bases nitrogenadas son:
Pirimidinas: formadas por un único anillo (C, T y U). El enlace con el azúcar lo hacen a través
del átomo N3 (Nitrógeno en posición 3 del ciclo).
Purinas: formadas por 2 anillos (A y G). El enlace con el azúcar lo hacen a través del N9
(Nitrógeno en posición 9 del heterociclo).
Además de las bases nitrogenadas citadas en la anterior diapositiva, es frecuente encontrar
modificaciones de las mismas, tanto púricas como pirimídicas. Entre las más abundantes se
encuentran: la 5-metilcitosina y la 5-hidroximetilcitosina, que reemplazan a la citosina en
varios tipos celulares (ver tabla en diapositiva 14); la 6-metiladenina, que se la ha
relacionado con la regulación de la expresión del ADN; la 7-metilguanina (Cap5’) y el
dihidrouracilo, que forman parte de la estructura de los ARN (estas bases llegan a constituir el
10% del total de las bases); y la hipoxantina y la xantina, los cuales son intermediarios
metabólicos y productos de reacción del ADN con sustancias mutagénicas.
La inosina, nucleósido de hipoxantina, permite el apareamiento del anticodón del ARNt (ver
diapositiva 35) con más de un codón (A, C y G). Adicionalmente, en el ARNt también se
encuentran la seudouridina, formada por uracilo y ribosa unidos a través de un enlace β(1’-5);
la ribotimidina (un nucleósido de timina y ribosa); y la dihidrouridina, formada por ribosa y
dihidrouracilo unidos por enlace β(1’-1).
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El azúcar pentosa en el caso de los ácidos ribonucleicos (ARN) es la D-ribosa, y en el caso de
los ácidos desoxirribonucleicos (ADN) es la 2-desoxi-D-ribosa. Esta última se diferencia de la
primera por la pérdida del grupo OH en el carbono 2 del azúcar. Notar que ambas poseen 5
carbonos y estructura pentagonal (de furanosa).
En esta figura se muestran, a modo de resumen, las estructuras de los nucleótidos que
componen el ARN (las 4 estructuras ubicadas en la parte superior de la figura) y el ADN (las 4
ubicadas abajo).
Las diferencias entre ellas son: la ausencia del grupo OH en los azúcares que forman parte de
los nucleótidos constitutivos del ADN y la presencia diferencial de Uracilo y Timina en el
ARN y el ADN, respectivamente.
Si bien las estructuras mostradas poseen una única molécula de fosfato asociada, los
nucleótidos pueden tener 1, 2 ó 3 grupos fosfato, unidos al carbono 5’ de la pentosa, existiendo
por tanto, nucleótidos 5’ monofosfato (NMPs), nucleótidos 5’ difosfato (NDPs) y nucleótidos
5’ trifosfato (NTPs).
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Además de ser los pilares estructurales de los ácidos nucleicos, los nucleótidos desempeñan en las
células otras funciones no menos importantes.
● Los nucleótidos di y trifosfato (NDP y NTP) actúan como sustancias precursoras en la síntesis
enzimática de los ácidos nucleicos.
● El ATP es un transportador de fosfato en muchas reacciones enzimáticas en las que se requiere la
fosforilación de una sustancia para obtener energía. Por ejemplo, en la degradación de glucosa, el
primer paso es la fosforilación, que se realiza mediante una molécula de ATP que pasa a ADP.
Los enlaces éster entre las moléculas de ác. fosfórico de los NDPs y NTPs son enlaces de alta
energía. Estos enlaces son tan fuertes porque tienen que superar la repulsión electrostática que se
genera entre las cargas (O- de los grupos fosfato). Tal característica es aprovechada en el
metabolismo celular: cuando se produce el paso de ATP a ADP y de ADP a AMP, se cede una
cierta cantidad de energía que es aprovechada para la formación de un enlace de alta energía entre
el sustrato y el ác. fosfórico.
● El AMPc (un fosfato cíclico de adenosina en el que el grupo fosfato está unido mediante enlace
éster al hidroxilo de la posición 3' y al de la posición 5'), se forma a partir del ATP en el interior de
las células. Actúa como mediador de muchos mensajeros extracelulares, como hormonas,
neurotransmisores, prostaglandinas, etc.
● Algunos nucleótidos no nucleicos (que no forman parte de los ácidos nucleicos), funcionan como
coenzimas, por ejemplo: NAD, NADP, FAD, etc. Todas estas intervienen en las reacciones de
oxidación-reducción y actúan asociadas a las deshidrogenasas, de forma que las enzimas quitan
H+ y e- del sustrato (lo oxidan) y las coenzimas los captan quedando reducidas a NADH+H,
NADPH+H y FADH2. De forma inversa pueden actuar provocando la reducción del sustrato y
quedando las coenzimas reducidas.
● Los nucleótidos NTPs y NDPs actúan como transportadores de determinadas sustancias sillares
para la fabricación de macromoléculas. Por ejemplo, el UDP es el transportador de la glucosa
durante la síntesis del glucógeno. La coenzima A incluye un nucleótido (ADP) en su molécula.
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Las pirimidinas y purinas libres son compuestos débilmente básicos y son por lo tanto
llamados bases. Tienen una variedad de propiedades fisicoquímicas que afectan la estructura,
y la función de los ácidos nucleicos. Las purinas y pirimidinas comunes en el ADN y el ARN
son moléculas altamente conjugadas y ello influye sobre la estructura, distribución de
electrones, y absorción de la luz de los ácidos nucleicos. La resonancia entre los átomos en el
anillo otorga a la mayor parte de los enlaces el carácter de doble enlace parcial. Un resultado
es que las pirimidinas son moléculas planas y las purinas son casi planas.
Las bases púricas y pirimidínicas son hidrofóbicas y relativamente insolubles en las soluciones
acuosas con pH casi neutro del interior celular. Contrariamente, en soluciones ácidas o básicas
las bases adquieren cargas por lo cual su solubilidad aumenta.
Debido a la presencia de anillos aromáticos que forman parte de la estructura de todas las
bases nucleotídicas, éstas absorben luz ultravioleta presentando un máximo de absorbancia en
longitudes de onda cercanas a 260 nm.
Como puede verse en la figura, dependiendo de cuál de los nucleótidos se trate tanto la
longitud de onda en la cual se observa la máxima absorbancia como la absortividad o
coeficiente de extinción variará.
El valor máximo de absorbancia de las distintas bases puede utilizarse no sólo para detectar y
cuantificar las bases, los nucleósidos y los nucleótidos, sino especialmente para determinar la
concentración de los ácidos nucleicos.
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Además, las pirimidinas y purinas libres pueden existir en dos o más formas tautoméricas
dependiendo del pH, la ceto-enólica y la imina-amina.
A principios de 1900, Levene propuso que la nucleína se encontraba en las células
animales y estaba compuesta por ácido fosfórico, una pentosa y bases nitrogenadas.
Con el tiempo identificó que la pentosa era una ribosa y varios años después se supo
que era la desoxirribosa. Levene tuvo mucha importancia en el estudio de la química
de los ácidos nucleicos, a pesar de su incorrectapropuesta de que los cromosomas
vegetales eran de ARN y los animales de ADN. En 1926 propuso un modelo
estructural de los ácidos nucleicos: el tetranucleótido plano, en el cual los ácidos
nucleicos estaban formados por planos de cuatro pentosas, exponiendo hacia el
interior los grupos fosfatos y hacia el exterior las bases nitrogenadas.
En el año 1950 Erwin Chargaff demostró que las proporciones de las bases
nitrogenadas eran diferentes en los distintos organismos sugiriendo que el modelo
anterior era incorrecto. Además, en base al estudio de las proporciones relativas de
cada uno de los nucleótidos planteó las reglas que se detallan en la diapositiva.
Estas reglas se cumplen en los organismos cuyo material hereditario es ADN de doble
hélice.
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De la observación de la tabla pueden extraerse las siguientes conclusiones:
● Casi todos los ADN estudiados, provenientes de distintas fuentes, cumplen la relación A=T y G=C,
con excepción del ADN del bacteriofago ØX174*. El ADN de este virus es de una sola hebra.
● En los virus ARN no se cumple la equimolaridad de las bases excepto en el caso del virus del
Tumor de las heridas y de los Reovirus que tienen ARN de doble hélice. En estos virus se cumple
que A=U y G=C, además se cumple que A+G/U+C=1.
● El fago T7 en vez de citosina tiene hidroximetil-citosina (HMC, ver diapositiva 6).
● Algunos organismos tienen en su ADN una pequeña proporción de 5-metil-citosina (5-
Me-C) que sustituye a la citosina (ver diapositiva 6).
La proporción A+T/G+C es específica de cada organismo y como veremos más adelante cuando hablemos
de las propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos, dicha proporción está relacionada con la
densidad y la temperatura de fusión.
*Este fue el primer organismo secuenciado completamente, trabajo que realizó Sanger en 1977 (ver
diapositiva 62).
Para determinar la estructura tridimensional o disposición espacial de las moléculas de ADN,
se hace incidir un haz de rayos X sobre fibras de ADN y se registra la difracción de los rayos
sobre una película fotográfica donde, al revelarse, se observan manchas en los lugares donde
inciden los rayos X. El ángulo de difracción presentado por cada una de las manchas en la
película suministra información sobre la posición de cada átomo en la molécula de ADN.
La imagen es la famosa fotografía 51, un patrón de difracción de rayos X obtenido por
Franklin y Gosling y publicado en el artículo de abril de 1953 de la revista Nature (abajo a la
izquierda). En las conclusiones de dicho artículo los autores señalan que:
(a) La estructura es probablemente helicoidal.
(b) Posiblemente esté formada por dos hebras coaxiales (con un mismo eje).
(c) Los fosfatos se encuentran hacia el exterior (y no hacia el centro como propuso Levene y
apoyó Pauling en 1953*).
(d) El diámetro de la hélice es de 20 Å.
Mencionan además que sus resultados concuerdan con el modelo de Watson y Crick publicado
en el mismo número de la revista Nature: “Thus our general ideas are not inconsistent with
the model proposed by Watson and Crick in the preceding communication.”. Asimismo, en
Julio de 1953 publicaron otro trabajo donde mediante el uso de difracción de rayos X se
observa con mayor claridad la naturaleza helicoidal de ADN.
*El modelo de Pauling consistía en una hélice de tres cadenas, donde iones de magnesio
sostenían los fosfatos, y hacia la periferia se encontraban las pentosas y las bases nitrogenadas.
Watson y Crick lo mencionan en su trabajo, pero deciden no apoyarlo, entre otras razones,
porque observan que algunas distancias de Van der Waals eran muy pequeñas.
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James Watson y Francis Crick (1953) fueron los primeros investigadores en proponer una
estructura para los ácidos nucleicos. Para realizar su trabajo emplearon dos tipos de datos ya
existentes: por un lado, utilizaron los datos obtenidos por Chargaff (1950) relativos a la
composición de bases nitrogenadas en el ADN de diferentes organismos; y por el otro,
estudios de difracción de rayos X sobre fibras de ADN publicados por Astbury (1947) y
Maurice Wilkins (1953).
Su teoría sobre la estructura helicoidal del ADN fue apoyada por los datos cristalográficos
publicados por Wilkins, et al., y Franklin y Gosling, en el mismo número de la revista. Por
este trabajo, Watson, Crick y Wilkins recibieron el Premio Nobel de Medicina en 1962. No
compartieron el premio con Rosalind Franklin, ya que para entonces había fallecido.
Watson y Crick propusieron un modelo de estructura para el ADN conocido con el nombre de
Modelo de la Doble Hélice. Las características del modelo son las siguientes:
● El ADN es una doble hélice enrollada helicoidalmente “a derechas” (sentido
dextrorso).
● Enrollamiento de tipo plectonémico: para separar las dos hélices es necesario girarlas
como si fuera un sacacorchos.
● Los grupos fosfato se encuentran hacia el exterior de la hélice, en tanto que las bases
púricas y pirimidínicas están apiladas en el interior de la doble hélice.
● Cada hélice es una serie de nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster en los que un
grupo fosfato forma un puente entre grupos OH de dos azúcares sucesivos (posiciones
3’ y 5’ de uno y otro, ver la siguiente diapositiva).
● Las hélices son antiparalelas (secuencias inversas), una hélice lleva la secuencia de
átomos 5’P → 3’OH , mientras que la hélice complementaria sigue la secuencia de
átomos 3’OH → 5’P.
● Las hélices se mantienen unidas mediante puentes de hidrógeno producidos entre las
bases nitrogenadas de cada una. Las bases se encuentran en sus configuraciones
cetónicas, cumpliendo así las reglas de apareamiento A-T (mediante dos puentes de
hidrógeno) y G-C (mediante tres puentes de hidrógeno).
● Las bases nitrogenadas están apiladas a una distancia de 3,4 Å y cada 10 bases (34 Å)
se produce una vuelta completa de la doble hélice (360º).
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● La secuencia de bases nitrogenadas puede ser cualquiera, no existe ninguna
restricción.
● El diámetro de la doble hélice es de 20 Å.
En la diapositiva se muestran dos formas de representación de la estructura del ADN y el
modelo original presentado por Watson y Crick. Observar los surcos mayor y menor, el
diámetro de la hélice (20 Å), las distancias entre las bases (3.4 Å) y la vuelta que se completa
cada 36 Å (10,5 pb).
En el campus de la materia se encuentra un video donde se puede observar la
estructura tridimensional del ADN (estructura ADN B_1bna.pdb.mpg).
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Los nucleótidos se unen entre sí para formar largas cadenas de polinucleótidos. Como
mencionamos en la diapositiva anterior, la unión entre monómeros de nucleótidos se
realiza mediante enlaces fosfodiéster entre los carbonos de las posiciones 3’ de un
nucleótido y la 5’ del siguiente.
También observar en la imagen el detalle en los puentes de hidrógeno que se
establecen entre A-T (dos) y G-C (tres), y que, como se mencionó anteriormente, se
trata de hebras antiparalelas.
Además, la estructura en doble hélice de Watson y Crick (1953) planteó varias
propiedades importantes del material hereditario:
● Al no existir ninguna restricción en la secuencia de bases nitrogenadas, el ADN
posee la suficiente variabilidad como para ser el material hereditario. Además,
debe existir algún código que permita pasar de la secuencia lineal de bases
nitrogenadas en el ADN a la secuencia lineal de aminoácidos en las proteínas.
● Las reglas de complementariedad de las bases nitrogenadas A-T y G-C indican
una forma sencilla de replicación del material hereditario, el método
semiconservativo. Cuando el ADN se replica, sus dos hélices se separan y cada una
de ellas sirve de molde para sintetizar una nueva hélice siguiendo las reglas de
apareamiento de las bases nitrogenadas.
● La mutación a nivel molecular consistiría en un cambio en la secuencia de bases
nitrogenadas.
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● Los enlaces de hidrógeno entre las bases permiten la asociación complementaria de dos
(y de vez en cuando tres o cuatro -ver más adelante) hebras deácido nucleico. Los
patrones más importantes de puente de hidrógeno (A-T y G-C) predominan en ADN y
ARN de doble cadena y es el que permite la duplicación de la información genética. Sin
embargo, los cambios de pH, al afectar la ionización de los grupos químicos de las bases
nitrogenadas y al equilibrio de tautómeros, modifican las posibilidades de formación de
enlaces de hidrógeno y, por tanto, el apareamiento de bases.
● El apilamiento de bases refiere al tipo de interacción que se da entre las nubes
electrónicas de los anillos de las bases nitrogenadas (interacciones hidrófobas). El
apilamiento no es un fenómeno cooperativo, puesto que dos bases se aparean a igual
velocidad si están solas o si están formando parte de un polinucleótido. Sin embargo, se
ha observado que el apilamiento se encuentra energéticamente favorecido cuanto mayor
sea el número de bases que interaccionen.
● La interacción hidrofóbica es un fenómeno descubierto por Wilkins y Astbury al tratar
de validar el modelo del tetranucleótido de Levene. En esta disposición, se minimiza la
interacción de los anillos de las bases nitrogenadas, de carácter hidrofóbico, con el
entorno polar de la solución acuosa que los rodea. También disminuye la tensión
superficial generada entre las bases y el agua. Al disponerse el agua por fuera del
polinucleótido de una manera ordenada, éste tiende aún más a agregarse, por lo que se
genera una especie de cavidad estable en el agua.
El modelo de la Doble Hélice propuesto por Watson y Crick está basado en estudios del ADN
en solución (hidratado). La denominada forma B ó ADN-B tiene un mayor interés biológico
ya que es la que presenta el ADN en interacción con las proteínas nucleares, pero también
existen otras estructuras posibles que puede presentar el ADN.
ADN-A: cristalografía de ADN con 75% de humedad, requiere Na, K o Cs como contraiones,
presenta 11 pares de bases por giro completo y 23 Å de diámetro. Es interesante por
presentar una estructura parecida a la de los híbridos ADN-ARN y a las regiones de
auto-apareamiento ARN-ARN. El plano de los pares de bases de ADN-A se inclina
20º con respecto al eje de la hélice. Estos cambios estructurales profundizan el surco
mayor al mismo tiempo que el surco es menos profundo.
ADN-B: cristalografía de ADN en solución, 92% de humedad, se encuentra en soluciones con
baja fuerza iónica y se corresponde con el Modelo de la Doble Hélice.
ADN-Z: doble hélice sinistrorsa (enrollamiento a izquierdas), 12 pares de bases por giro
completo, 18 Å de diámetro, se observa en segmentos de ADN con secuencia
alternante de bases púricas y pirimidínicas (GCGCGC), debido a la conformación
alternante de los residuos azúcar-fosfato sigue un curso en zig-zag. Requiere una
concentración de cationes superior a la del ADN-B, y teniendo en cuenta que las
proteínas que interaccionan con el ADN tienen gran cantidad de residuos básicos
sería posible que algunas convirtieran segmentos de ADN-B en ADN-Z. La ranura
principal es apenas evidente en Z-ADN, y el surco menor es estrecho y profundo.
Se desconoce si hay estructura ADN-A en las células, pero hay evidencias de la presencia de
tramos cortos de ADN-Z en células procariotas y eucariotas. Estas extensiones de ADN-Z
pueden desempeñar un papel en la regulación de la expresión de algunos genes o en la
recombinación genética.
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Otras variaciones estructurales que han sido detectadas en el ADN es el palíndromo.
Un palíndromo es una palabra, frase u oración que se escribe de forma idéntica ya sea
hacia adelante o hacia atrás (como Neuquén, o Yo dono rosas, oro no doy).
El término se aplica a las regiones de ADN con repeticiones invertidas de secuencia
de bases (una hebra es autocomplementaria consigo misma), y que tienen simetría en
las dos hebras de ADN (es decir que la secuencia 5’→3’ de una cadena es idéntica a la
secuencia 5’→3’ de la otra, el palíndromo). Las secuencias auto-complementarias
tienen el potencial para formar horquillas o estructuras cruciformes (en forma de
cruz).
La medida en la que palíndromos forman estructuras cruciformes en las células no se
conoce, aunque se las ha visto en E. coli, y se han encontrado estructuras conteniendo
múltiples horquillas en hebras individuales de ADN (o ARN) en solución. Se cree que
en algunos casos sirven para la reparación de secuencias dañadas, o como medios de
regulación de la expresión génica, como en el caso de los Elementos de Respuesta al
Hierro (IRE). Por ejemplo, la aconitasa es una enzima que une clusters de Fe-S, pero
en su ausencia, la forma apo de la enzima se une a la secuencia 5’ del mensajero de la
ferritina (una estructura de tipo horquilla), bloqueando su traducción, y disminuyendo
la concentración de la enzima que almacena hierro. A su vez, también se une al
extremo 3’ del mensajero del receptor de Fe (otra estructura de tipo horquilla),
evitando su degradación.
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Cuando la repetición invertida se produce dentro de la misma cadena de ADN, la
secuencia se llama repetición espejo. Las repeticiones espejo no tienen secuencias
complementarias dentro de la misma cadena y no pueden formar horquillas ni
estructuras cruciformes. Estos tipos de secuencias se encuentran en prácticamente
todas las moléculas de ADN y pueden abarcar unos pocos pares de bases o miles. Su
utilidad en la célula se ha asociado con el reconocimiento por enzimas de restricción,
o para el reconocimiento de sitios de metilación.
El ADN triple hélice o ADN-H, es una estructura poco habitual, formada por 3 hebras
(una triple hélice, triplex, o tríplice). Se descubrió por primera vez en un ARN,
aunque es en el ADN donde se encuentra con más frecuencia. Se forman en regiones
ricas en pirimidinas (secuencia (CT)n) en una hebra y por lo tanto ricas en purinas
(secuencia (AG)n) en la hebra complementaria. En condiciones normales, dichas
secuencias se encuentran totalmente apareadas sin alteración alguna en la doble
hélice. Sin embargo, puede ocurrir que parte de la doble hélice se abra y la hebra rica
en CT se repliegue y aparee con la hebra AG, mediante una nueva clase de enlaces de
hidrógeno (conocidos como enlaces de Hoogsteen). Aparece así una triple hélice
(CT)n/(AG)n/(CT)n en dicho segmento del ADN, en tanto que la otra hebra
desapareada (rica en A y G) forma una especie de bucle.
Ciertas regiones del ADN (y ARN) ricas en guanina pueden plegarse en estructuras
secundarias no canónicas, llamadas G-cuadruplex o ADN cuadruplexo. Estas estructuras
comprenden dos o más tétradas de guanina que se forman cuando cuatro guaninas se
mantienen en una disposición plana a través de enlaces de tipo Hoogsteen, y con una
estabilización adicional proporcionada por un catión monovalente coordinado por los átomos
de oxígeno de cada guanina.
Los ADN cuadruplexos se han asociado con varios aspectos importantes de la función del
genoma, incluidas la transcripción, la recombinación y la replicación. Dado que son
estructuras que poseen una alta estabilidad termodinámica, estos motivos también se
encuentran protegiendo los extremos de los cromosomas (telómeros*). De hecho, se ha visto
cómo el desplazamiento de los componentes proteicos asociados al ADN cuadruplexo conduce
a la muerte celular.
*Por el descubrimiento de la telomerasa y la protección de los cromosomas por los telómeros
fueron galardonados con el Premio Nobel en Fisiología y Medicina en 2009 Elizabeth
Blackburn (ex estudiante doctoral de Sanger), Carol Greider (ex estudiante doctoral de la
primera), y Jack Szostak.
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Se denomina desnaturalización de los ácidos nucleicos a la separación de las hebras
que lo constituyen. Es importante señalar, que esto se debe a la ruptura de puentes de
hidrógeno e interacciones hidrofóbicas en la molécula y no a la ruptura de enlaces
covalentes, siendo entonces un proceso reversible. Puede tratarse de un proceso total o
parcial, que se ve favorecido por el aumento en la temperatura y por el cambio del pH
delas soluciones (ver diapositiva 19). La renaturalización de una molécula
parcialmente desnaturalizada es un proceso rápido, en tanto que es muy lento cuando
la molécula se encuentra totalmente desnaturalizada.
La desnaturalización espontánea suele darse en regiones ricas en A-T, en tanto que
cuanto mayor es el contenido en G+C mayor es la cantidad de energía (calor) que hay
que suministrar para alcanzar el mismo efecto (ver más adelante).
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Un parámetro relacionado con la desnaturalización del ADN, muy utilizado en
técnicas de biología molecular, es la Temperatura de Fusión (Tm). Ésta temperatura
se define como la temperatura necesaria para desnaturalizar la mitad del ADN de una
mezcla (punto medio de la reacción ADN doble hélice → ADN hélice sencilla).
La estabilidad de la doble hebra de ADN está relacionada con la proporción de A+T
respecto de C+G; aumentando cuando el contenido de bases G + C sea mayor. Esto se
debe a que estas bases interaccionan con un número mayor de puentes de hidrógeno (3
respecto de los 2 con los cuales interaccionan A y T) por lo cual será necesario
suministrar una mayor cantidad de energía (temperatura) para separarlas.
¿Cuál de las dos muestras de la figura de la izquierda tiene mayor contenido de C+G?
¿Por qué?
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La desnaturalización del ADN se produce en un estrecho intervalo de temperatura y da lugar a
cambios relevantes en muchas de sus propiedades fisicoquímicas. En particular, el cambio en la
absortividad es particularmente útil.
Como mencionamos en la diapositiva 9, los anillos heterocíclicos de los nucleótidos absorben luz
UV (con un máximo cercano a 260 nm, que es característico de cada base). Pero cuando las bases
están apareadas (ADN doble cadena o dsDNA), la absorción del ADN es un 40% menor que la
que mostraría una mezcla de nucleótidos libres con la misma composición y concentración. El
cambio en la absorbancia debido a la renaturalización del ADN se denomina efecto hipocrómico
y se debe a interacciones entre los sistemas de electrones de las bases, que es posible gracias a su
apilamiento en una disposición paralela a la doble hélice.
La absorbancia del ADN de cadena sencilla (ADN simple cadena, o ssDNA) es mayor que la
absorbancia del dsDNA, y el cambio en la absorbancia debido a la desnaturalización del ADN se
conoce como efecto hipercrómico (significa: "más color").
Cualquier desviación del estado bicatenario se refleja en un cambio en la absorbancia, es decir, en
un aumento en la densidad óptica hacia el valor característico de las bases libres. Por tanto, se
puede monitorear la desnaturalización del ADN mediante medidas de absorbancia. Como ejemplo
podemos citar el estudio de la desnaturalización de dobles hebras para determinar el valor de TM
en el cual se realizan cambios en la temperatura y se mide la absorbancia a 260 nm.
El tamaño de las moléculas de ADN es considerablemente grande en comparación con
el tamaño de una célula (observar en la figura aproximadamente a escala, los tamaños
de la célula E. coli y su ADN), si el ADN humano dentro del núcleo de cualquier
célula pudiese extenderse mediría más de metro y medio. Para poder contenerlo en su
interior, las células deben desarrollar sistemas de almacenamiento o empaquetamiento
llamados cromosomas. Los cromosomas son las moléculas más grandes dentro de una
célula.
En general bacterias y virus tienen un único cromosoma, en tanto que los eucariotas
tienen varios.
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El ADN se encuentra muy compactado dentro de la célula, lo que implica que
presenta un alto grado de organización estructural, ya que los mecanismos de plegado
no sólo deben empacar el ADN, sino también permitir el acceso a la información
contenida.
El primer aspecto topológico del ADN, luego de la doble cadena, es el
superenrollamiento. Esto es, un enrollamiento de una estructura que ya es espiralada.
Un ejemplo de esto se observa en los tramos de cable entre la base y el receptor del
teléfono que a menudo incluye uno o más superenrollamientos. El ADN se enrolla
como una doble hélice alrededor de un eje (estado relajado), y cuando sigue
espiralándose sobre sí mismo se produce el superenrollamiento del ADN. El
superenrollamiento sólo permanece si los extremos se mantienen retenidos o sujetos,
ya que de no ser así, el libre giro deshace las superhélices. Tal sujeción puede ser
externa o bien debida a la unión de ambos extremos entre sí, de modo que la cuerda (o
la molécula de ADN) forme un círculo.
Cuando un ADN presenta 10 bp por vuelta de hélice aparece en estado relajado.
Cuando un ADN presenta menos vueltas de hélice (porque hay más de 10 bp/vuelta),
se produce un superenrollamiento negativo que dobla la hélice en sentido dextrógiro.
Cuando un ADN presenta más vueltas de hélice alrededor de su eje imaginario
(porque hay menos de 10 bp/vuelta) se produce un superenrollamiento positivo que
dobla la hélice en sentido levógiro (ver videos en el campus de la materia). En el
interior de las células, el ADN aparece superenrollado negativamente (en la forma
menos compacta), lo que facilita la apertura de la doble hélice durante la replicación y
la transcripción.
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Las topoisomerasas son las enzimas encargadas de modificar la topología del ADN in vivo
catalizando los procesos de torsión y relajación, lo que ayuda a solucionar los problemas que
surgen durante la replicación, transcripción, y reparación del DNA. El resultado de la acción
continua de las topoisomerasas en las células es que el ADN se encuentre habitualmente en
estado superenrollado (–).
La función de estas enzimas es importante porque:
● Ayuda en la compactación del ADN.
● Permite el acercamiento de regiones alejadas en secuencia (clave en procesos de
regulación).
● Permite que tengan lugar los procesos de replicación y transcripción. Durante estos
procesos se separan las dos hebras mediante el desenrollamiento local de la doble hélice
(que es mediado por polimerasas y helicasas), esto provoca un superenrollamiento (+) en las
regiones adyacentes, que es relajado por topoisomerasas (la de tipo IV).
Topoisomerasas tipo I:
● Relajan sup– en E. coli; en eucariotas relajan el (–) y el (+).
● Hidrolizan un enlace fosfodiéster en una hebra, hacen pasar la otra hebra a través del
corte y vuelven a unir los extremos de la primera.
● No necesitan ATP.
Topoisomerasas tipo II:
● Relajan el (+) a (–) y pueden aumentar el (–)
● Hidrolizan los enlaces fosfodiéster de ambas hebras, hacen pasar otro segmento de la
doble hebra a través del corte, y sellan nuevamente los enlaces hidrolizados.
● Requieren ATP
gel: Visualización de topoisómeros. En este experimento, todas las moléculas de ADN tienen
el mismo número de pares de bases pero exhiben diferentes grados de superenrollamiento.
Debido a que las moléculas de ADN superenrolladas son más compactas que las moléculas
relajadas, migran más rápidamente durante la electroforesis en gel (movimiento de arriba a
abajo -se puede revisar este concepto en diapositiva 60).
30
31
El material genético nuclear se encuentra estrechamente asociado a proteínas llamadas
histonas. Estas proteínas (con carga positiva) unen al ADN delimitando un bucle
donde la doble hélice tiene el giro restringido, y fuerzan el enrollamiento de la
molécula de ADN a su alrededor.
Todas las células eucariotas tienen cinco grandes clases de histonas (H1, H2a, H2b,
H3, y H4), que difieren en peso molecular (entre 11.000 y 21.000 daltons) y
composición de aminoácidos (son proteínas ricas en aminoácidos básicos, como
arginina y lisina).
La hebra de ADN alrededor de las proteínas (aproximadamente 150 pb), más la hebra
de conexión con el siguiente complejo ADN enrollado a las proteínas (apróx. 50 pb)
constituye el nucleosoma (ver esquema). Cada nucleosoma contiene ocho moléculas
de histonas: dos copias de cada uno de H2A, H2B, H3, y H4, y a su vez, una sucesión
nucleosomas se asocian a la histona H1.
Al microscopio electrónico es posible observar la estructurade la cromatina como
cuentas de un rosario, en donde el ADN se une a las histonas.
32
El nucleosoma es la unidad fundamental de organización sobre la cual se construye el
embalaje de orden superior llamado cromatina. Esta se compone de fibras que
contienen proteína y ADN en aproximadamente iguales masas, junto con una pequeña
cantidad de ARN. En la cromatina también se encuentran otras proteínas no
histónicas, algunas de las cuales ayudan a mantener la estructura cromosómica, o
regulan la expresión de genes específicos. Empezando por el nucleosoma, el ADN
cromosómico eucariótico se va empaquetando en una sucesión de estructuras de orden
superior, dando finalmente la estructura compacta del cromosoma que puede ser visto
al microscopio óptico.
Durante el ciclo celular eucariótico se producen importantes cambios en la estructura
de los cromosomas. En las células eucariotas que no se dividen (en G0) y en aquellas
que están en la interfase (G1, S, y G2), la cromatina es amorfa y parece estar dispersa
aleatoriamente en ciertas partes del núcleo. Durante la fase S, el ADN en su estado
amorfo se replica, y cada cromosoma produce a su cromosoma hermano (llamado
cromátidas hermanas) que permanecen asociados uno con el otro después de que la
replicación se haya completado. Los cromosomas se vuelven mucho más condensados
durante la profase de la mitosis.
El ácido ribonucleico (ARN) está presente tanto en las células procariotas como en las
eucariotas, y es el único material genético de ciertos virus. Se cree que las primeras
formas de vida contenían ARN y no ADN como molécula de la herencia. Severo
Ochoa ganó el Premio Nobel de Medicina en 1959 tras descubrir cómo se sintetiza el
ARN.
Entre otras funciones, los ARN cumplen un rol fundamental en la síntesis de
proteínas.
33
La estructura primaria del ARN es muy similar a la del ADN está formada por ribosa
(observar el grupo OH en el C2 ausente en la desoxirribosa), las bases nitrogenadas,
adenina, guanina, citosina y uracilo, y fosfato.
Existen tres principales tipos de ARN.
● ARN mensajero (ARNm o mRNA): transporta el mensaje genético del ADN a los
ribosomas para dirigir la síntesis de proteínas. Representa el 5% del ARN total. En
el extremo 3’ los ARNm contienen citosina y guanina metiladas, y una secuencia
de poliadenilato (cola poliA) con 100 a 200 nucleótidos. En el extremo 5’
contienen 7-metilguanina (Cap5’) que identifica a este ARN como mensajero.
● ARN ribosomal (ARNr o rRNA): forma parte de la estructura de los ribosomas.
Se compone por un grupo de moléculas que se clasifican en base a sus coeficientes
de sedimentación como 23s, 16s y 5s (en procariotas), o 28s, 17s, 7s y 5s (en
eucariotas). Es el ARN que se encuentra en mayor proporción (constituye el 80%
del total). Los ARNr poseen bases metiladas y la longitud de sus cadenas es
variable (p. ej. el ARNr 5s tiene alrededor de 120 nucleótidos, mientras que el
ARNr 28s tiene aproximadamente 4000 nucleótidos).
● ARN de transferencia (ARNt o tRNA): se trata de las moléculas más pequeñas de
ARN (70 a 95 nucleótidos) y constituye el 15% del total. Su función es acoplar la
información del ARNm con los aminoácidos. Los ARNt tienen ribotimidina,
seudourudina y dihidrouridina (DHU). Además, en el extremo 3’ se encuentra una
secuencia constante CCA que es el sitio de unión del aminoácido.
● Además, en el núcleo existe un grupo heterogéneo de moléculas de ARN
(hnRNA) que cumplen funciones en diversos procesos (ver a continuación).
35
Además de cumplir un rol fundamental en la síntesis de proteínas, existen diversos
tipos de ARN que llevan a cabo gran variedad de funciones, que aún se siguen
descubriendo y clasificando. En términos generales, las moléculas de ARN que no son
del tipo ARNm se denominan ARN no codificante. La gran diversidad, la abundancia
y la capacidad de intervenir en procesos regulatorios han llevado a la hipótesis de que
ARN habría precedido en la evolución al ADN y a las proteínas.
● Catalítico: Muchas enzimas están compuestas total (ribozimas) o parcialmente
(ribonucleoproteínas) por ARN. El representante más importante es el ARNr que
forma parte de los ribosomas. La Ribonucleasa P es una ribozima con actividad
ARNsa, y la telomerasa es una ribonucleoproteína.
● Replicación del ADN: la ARNsa de procesamiento de ARN mitocondrial
(RMRP) es una ribonucleoproteína que inicia la replicación del ADN
mitocondrial. La telomerasa se encarga de mantener los extremos de los
telómeros en eucariotas durante la replicación. Además, en animales existen los
Y-ARN que interaccionan con la cromatina y con proteínas iniciadoras de la
transcripción.
● Modificación postraduccional: en eucariotas y arqueas, los small nuclear RNA
(snRNA)—en asociación con proteínas, que en conjunto se conocen como snurps-
—y la ribonucleoproteína RMRP participan en la maduración del pre-ARNm para
producir el ARNm funcional (splicing). Los small nucleolar RNA (snoRNA) son
abundantes en los nucleolos y se encargan de procesar las moléculas de ARNr,
mediante metilaciones y pseudouridilaciones de nucleótidos específicos. La
Ribonucleasa P es una ribozima con actividad ARNsa que participa de la
maduración del ARNt.
● Regulación génica: la traducción de ciertos ARNm está regulada por moléculas
de ARN, en base a complementariedad de secuencia. Los microRNA (miRNA)
son pequeñas moléculas de aproximadamente 22 a 26 nucleótidos que se unen a
regiones complementarias del ARNm y reprimen su traducción. Se demostró que
participan durante ciertos estadíos del desarrollo, y que su concentración se
encuentra alterada en ciertos tipos de cáncer y otras enfermedades.
Por su parte, los small interfering RNA (siRNA) son moléculas de entre 21 y 25
pares de bases; una hebra de una molécula de doble cadena de siRNA se
incorpora al complejo RISC (complejo de silenciamiento inducido por RNA), y
este reconoce una secuencia de ARNm complementaria a la que unió previamente
e inhibe su transcripción. Este mecanismo podría haber surgido como un
mecanismo de defensa contra virus de ARN de doble cadena.
Más recientemente se han descripto los denominados long noncoding RNAs
(lncRNAs)--de más de 200 nucleótidos--que regulan la expresión suprimiendo o
promoviendo la transcripción, La evidencia actual sugiere que los lncRNAs
podrían regular prácticamente todos los procesos celulares, y su expresión está
estrictamente regulada.
En varias especies bacterianas, incluyendo a Escherichia coli, se han descripto los
small RNAs (sRNAs) que actúan en trans regulando genes. Algunos genes
pequeños codifican para sRNAs que poseen complementariedad de bases con los
ARNm de los genes que se regulan, pudiendo inhibir o estimular su traducción, o
bien promover su degradación. Otro tipo de sRNA bacteriano es el 6S RNA, que
inhibe a la ARN polimerasa uniéndose a la subunidad que estimula la
transcripción para permitir a la bacteria entrar en fase estacionaria.
De particular relevancia en bacterias y arqueas es el sistema CRISPR, que
destruye moléculas de ADN o ARN (dependiendo de la especie) extrañas que
ingresen a la célula y confiere resistencia a parásitos. Este sistema depende en
parte de moléculas cortas de ARN denominadas crRNA que reconocen el ADN
foráneo.
Los riboswitches son secuencias antisentido que forman elementos de estructura
secundaria y funcionan como sensores que detectan estímulos del entorno (por
ejemplo: la temperatura o la concentración de metabolitos) y responden a ellos
regulando la traducción del ARNm. Han sido descriptos tanto en procariotas
como en eucariotas.
36
Las estructuras tridimensionales de muchos ARN, como las de las proteínas, son
complejas y únicas, no existiendo una estructura secundaria simple que sirva como
punto de referencia (como sí ocurre con la doble hélice del ADN). Interacciones
débiles, especialmente las de base apilables, desempeñan un papel importante en su
estabilización. La estructura de doble cadena predominantementehallada es la de tipo
A, con giro a la derecha; las hélices tipo Z solo se han obtenido en el laboratorio (en
condiciones de alta concentración salina o en altas temperaturas); en tanto que no se
ha observado la forma B en el ARN.
La mayor parte de los ARN tienen bases y nucleótidos modificados, que
probablemente les permiten resistir la acción de las nucleasas del citoplasma.
(a) Estructura tridimensional del ARNt-fenilalanina de levadura.
(b) Una ribozima cabeza de martillo (así llamado debido a que la estructura
secundaria en el sitio activo parece la cabeza de un martillo), derivado de ciertos
virus de plantas. Las ribozimas, son enzimas de ARN que catalizan una variedad
de reacciones, principalmente en el metabolismo de ARN y síntesis de proteínas.
(c) Un segmento de ARNm conocido como intrón, del protozoo ciliado
Thermophila tetrahymena. Este intrón (una ribozima) cataliza su propia escisión
de entre los exones en una cadena de ARNm.
(d) Se muestra un patrón de emparejamiento de bases inusuales que se encuentra
frecuentemente en el tARN (G-U). El apareamiento entre G-U sólo está permitido
cuando las hebras de ARN se pliegan o hibridan con ellas mismas. No hay
polimerasas de ARN (las enzimas que sintetizan ARN a partir de un molde de
ADN) que inserten un U opuesto a una G (o viceversa) en el templado de RNA
durante su síntesis.
37
Se muestra la estructura secundaria del componente ARN de la enzima ARNasa P de
E. coli (contiene también un componente proteico que no se muestra), que interviene
en el procesamiento de ARN de transferencia.
Las diferentes estructuras secundarias que puede adquirir el ARN son producidas por
bases no apareadas o mal apareadas, las cuales son comunes y dan lugar a
protuberancias (cuando una o dos bases de una hebra no están apareadas) o bucles
internos. También se forman horquillas entre secuencias autocomplementarias
cercanas. Los dos corchetes indican secuencias complementarias adicionales que
pueden estar apareadas en la estructura tridimensional del ARN. Los puntos azules
indican pares no Watson-Crick (G-U).
Debido a la presencia del OH en el C2 de la ribosa, el ARN presenta una menor
estabilidad en soluciones alcalinas que el ADN. Observar la reacción química: esta
propiedad será aprovechada en los métodos de purificación.
El primer paso en la purificación es liberar los ácidos nucleicos de la fuente que lo
contiene, por lo que dependiendo de la muestra se disgregará el tejido, o se lisarán los
cultivos o las células aisladas (ej. sangre).
La clarificación es una centrifugación donde se eliminan los restos de tejido y células.
La purificación propiamente dicha consiste en separar el ácido nucleico de interés, de
las proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos no deseados, y otros compuestos
inorgánicos. Se realiza por medio de diferentes técnicas que veremos a continuación.
Dependiendo de si se trata de ADN o ARN se utilizan en cada paso algunas enzimas o
reactivos que permiten la purificación de uno u otro ácido nucleico. Lo importante es
mantener la integridad del mismo, y un alto grado de pureza.
Hay diferentes procedimientos para la disgregación del tejido que puede ser mecánica,
química o enzimática.
La homogeneización mecánica consiste en romper las uniones entre las células para
facilitar su interacción con las soluciones de lisis, que son soluciones que
desnaturalizan las proteínas y mantienen estable al ácido nucleico. Se puede realizar
de varias formas, utilizando distintos tipos de morteros u homogeneizadores. Antes de
iniciar la disgregación mecánica, es recomendable adicionar una pequeña cantidad del
buffer de lisis, para asegurar que el pH del medio sea el adecuado, para inactivar
enzimas que podrían dañar la muestra y también para ayudar en el proceso de
homogeneización.
En la homogeneización mediante agentes químicos, la muestra se mantiene en
solución en presencia de detergentes, proteasas y agentes caotrópicos que rompen las
uniones entre las células o que incluso pueden perforar la membrana celular. La
disgregación química es recomendable para bacterias, muestras pequeñas de tejidos
frescos o sangre.
La disgregación enzimática involucra el uso de enzimas, como la lisozima (hidroliza
las uniones β-1,4 entre el N-acetilmurámico y la N-acetil-D-glucosamina de la pared
celular bacteriana), proteasas (rompen los enlaces peptídicos de las proteínas) y
liticasas (hidroliza enlaces β-1,3-glicosídicos como los presentes en el glucano de la
pared celular de levaduras).
42
Durante el proceso de lisis se modifican o destruyen las interacciones entre las
moléculas que conforman la pared y las membranas celular y nuclear, permitiendo
que los ácidos nucleicos se liberen. En la diapositiva se listan, con su función,
diferentes compuestos que podrían formar parte del buffer de lisis.
Es importante tener presente que los compuestos deben mantener la integridad del
ácido nucleico de interés, pudiendo o no degradar los contaminantes (proteínas, ácidos
nucleicos no deseados, etc). Se utilizan soluciones básicas, detergentes o agentes
caotrópicos que permiten disolver la membrana celular, así como inhibidores para
inactivar las enzimas que degradan los ácidos nucléicos. Muchas soluciones de lisis
contienen EDTA, que forma un complejo con los iones de Mg2+ para inhibir nucleasas
disminuyendo la degradación de los ácidos nucléicos.
A continuación, los componentes celulares no solubles, como el material fibroso y
algunas proteínas, se separan del ADN por centrifugación (clarificación).
43
La diapositiva muestra un ejemplo sobre el uso de Proteinasa K. Se observan
diferentes resultados si se usa proteinasa K, subtilisina A (otra proteinasa, pero menos
efectiva). En el 1er tubo se puede ver una buena cantidad de ADN (desnaturalizado y
blanquecino), en tanto que en el 2do se ve poca cantidad de ADN.
Se mencionan distintos métodos de purificación que detallaremos en las siguientes
diapositivas. Los tres primeros pueden ser usados tanto para la purificación de ADN
como de ARN.
El procedimiento de purificación por extracción orgánica se basa en la separación de
fases mediante centrifugación. El fenol es poco soluble en agua, y disuelve las
proteínas formando la fase orgánica, el cloroformo solubiliza lípidos y mejora la
separación de las 2 fases (quedaría difusa usando solo fenol), y el alcohol isoamílico
reduce la formación de espuma. A su vez, estos disolventes son reconocidos por su
color: una fase acuosa clara, superior y una fase inferior de color rosa brillante.
ADN: En este caso se trabaja a pH 8, por lo que los ácidos nucleicos estarán cargados
negativamente y quedarán en la fase acuosa. Sin embargo, el ARN será degradado
por la acción de ARNasas y el pH alcalino (ver diapositiva 39). Luego de recuperar
la fase acuosa, el ADN se precipita con isopropanol o etanol en presencia de sales
(iones de sodio o amonio): el agregado de alcoholes a una solución acuosa de ADN
hace que disminuya la polaridad del medio; en tanto que las sales se unen a los
grupos fosfato reduciendo las fuerzas repulsivas entre las cadenas. En ambos casos
disminuyen las interacciones ADN-solvente (recordar que el ADN interacciona con
el solvente acuoso a través de uniones polares), permitiendo que el ADN se pliegue
sobre sí mismo y se insolubilice (el ARN degradado quedará en solución). Un paso
de centrifugación permite que el ADN permanezca en el fondo del tubo mientras
que el alcohol puede ser desechado. Sin embargo, dado que las sales utilizadas
pueden co-precipitar con el ADN, se realiza este paso más de una vez, de modo de
lavar el pellet de ADN y purificarlo (el etanol 70% tiene una polaridad intermedia
que permite disolver muchas de las sales sin disolver el ADN). En el último paso se
descarta el etanol y el remanente se elimina por evaporación.
46
ARN: En este caso, se trabaja a pH 4, por lo que el ADN (doble cadena) tendrá sus
grupos fosfatos protonados(y sin carga neta) y no se encontrará soluble en la fase
acuosa, en tanto que el ARN (simple cadena) sí permanecerá en dicha fase. A pH
ácido la mayoría de las proteínas se desnaturalizan y junto con los pequeños
fragmentos de ADN (<10 kb) se fraccionan en la fase orgánica. También es
frecuente adicionar un agente caotrópica, como el tiocianato de guanidina para
favorecer la desnaturalización de las proteínas (entre ellas las ARNasas) y separar
el ARNr de las proteínas que lo acompañan. Actualmente, se utiliza trizol que está
compuesto por una mezcla de tiocianto de guanidina/fenol/cloroformo/isoamilico.
El ARN se recupera de la fase acuosa mediante precipitación con 2-propanol o
etanol.
A bajas concentraciones de sal, muchas veces se observa un aumento en la solubilidad
de las proteínas (salting-in) debido al aumento de las interacciones electrostáticas que
tienden a mantener la proteína en solución. Al aumentar la concentración de sal,
disminuye la solubilidad de la proteína, (salting-out) debido al aumento de las fuerzas
hidrofóbicas que tienden a agregarlas y precipitarlas. Las sales de los iones divalentes
(como el K2SO4 y el (NH4)2SO4), son mucho más eficaces en la solubilización de las
proteínas que las sales de iones monovalentes (como el NaCl y el KCl).
Para purificar el ácido nucleico, eliminando las proteínas y otros contaminantes
celulares, se utiliza precipitación salina (que sustituye al tratamiento clásico con
disolventes orgánicos tóxicos), y luego se centrifuga la muestra quedando el AN en el
sobrenadante. Finalmente, el ácido nucleico se precipita en presencia de alcohol como
estudiamos en la diapositiva anterior.
La unión a soportes sólidos es el método más utilizado para la separación de ácidos
nucleicos. Se trata de un mecanismo reversible de intercambio entre los iones en
solución y los grupos funcionales de la fase estacionaria (insoluble) llamada resina.
● En un primer paso, las moléculas en solución con cierta carga neta quedarán
retenidas en la matriz que tendrá la carga opuesta. En este caso, para purificar un
ácido nucleico, que tendrá carga negativa a pH 7, se utiliza un intercambiador
iónico con grupos funcionales cargados positivamente.
● Al aumentar la concentración de sal, eluirán las moléculas contaminantes que se
encuentran unidas a la matriz mediante interacciones débiles.
● Para finalmente eluir la molécula de interés, se debe cambiar el pH del medio de
elución de modo que una de las dos especies (la matriz o la molécula de interés)
pierda o cambie su carga neta. En la diapositiva se muestra un intercambiador
iónico capaz de perder su carga al aumentar el pH.
● Dado que el ácido nucleico eluido estará contenido en un volumen muy grande, y
en soluciones de pH o concentración de sales inadecuados para el trabajo posterior,
se lo suele precipitar con etanol y luego resuspender en el volumen y solución
deseados.
Los ácidos nucleicos en solución acuosa también están recubiertos por una capa de
hidratación de moléculas de agua (ver diapositiva 48). El mecanismo de purificación
por unión a matrices de sílice se basa en la adsorción y desorción de los ácidos
nucleicos en presencia de sales caotrópicas. Bajo estas condiciones, los ácidos
nucleicos se unen a la membrana de sílica, mientras que las proteínas y otros
contaminantes no se unen, y son eliminados durante los pasos de lavado.
Posteriormente, los ácidos nucleicos se eluyen de la membrana de sílica utilizando
baja concentración de sal o simplemente agua.
Con esta tecnología, los ácidos nucleicos se unen selectivamente a pequeñas esferas
paramagnéticas recubiertas de sílice (Si) en presencia de sales caotrópicas mientras
que el resto de los contaminantes son eliminados de la muestra, al igual que como
discutimos previamente. Las esferas son retenidas con un imán, lo que permite el
lavado de los contaminantes para luego ser eluidas utilizando una solución de baja
salinidad y están listos para ser usados en posteriores aplicaciones.
51
Como mencionamos anteriormente, los distintos tipos de ARN están presentes en la
célula en diferentes cantidades relativas (ver diapositiva 35). En ocasiones deseamos
recuperar solo el ARNm, por ejemplo si nos interesa estudiar la expresión de algún
gen en particular (ver más adelante), y para ello se puede utilizar este sistema. Se trata
de una sucesión de timinas (oligo(dT)) unida a una matriz o a esferas paramagnéticas.
Dado que el ARNm posee en su extremo 3’ una repetición de adeninas (cola de
poliA), hibridará con el oligo(dT) de la matriz y los contaminantes podrán ser
removidos. La elución se realiza con soluciones de baja fuerza iónica.
Un plásmido es un fragmento de ADN doble cadena, extracromosómico y circular que
puede replicarse de manera independiente al cromosoma bacteriano. En general estos
fragmentos de ADN portan genes que les confieren ciertas ventajas adaptativas a las
células (como la resistencia a antibióticos o la producción de sustancias tóxicas). Estas
características han sido aprovechadas en la investigación científica y su uso está
ampliamente distribuido en las técnicas de manipulación genética, como por ejemplo
en la obtención de proteínas de interés en grandes cantidades.
Para separar el ADN plasmídico del genómico es necesario hacer una
desnaturalización y renaturalización rápida llamada lisis alcalina.
● El buffer de lisis celular contiene: i) SDS, que solubiliza los fosfolípidos de las
membranas y desnaturaliza proteínas e ii) hidróxido de sodio (NaOH), que
desnaturaliza el ADN (genómico y plasmídico), ARN y proteínas. Debido a su gran
tamaño, el ADN genómico se fragmenta durante este paso, en tanto que el ADN
plasmídico solo se desnaturaliza y sus hebras continuarán vinculadas físicamente.
Es importante que este paso se realice en forma rápida y eficiente porque largos
períodos de incubación en estas condiciones pueden resultar en una
desnaturalización irreversible del ADN plasmídico.
● La solución de renaturalización (KAc/HAc, acetato de potasio a pH 4.8)
53
neutraliza el pH básico de la solución de lisis y permite la renaturalización sólo del
ADN plasmídico. Esto es debido, a que el ADN plasmídico es pequeño y puede
renaturalizarse más fácilmente que el genómico el cual no se renaturaliza porque
las largas hebras complementarias no se aparean correctamente (se producen
apareamientos parciales) y a su vez forma un complejo con proteínas y otros
componentes de la célula, que cubiertos por SDS, precipitan cuando este pierde
solubilidad al reemplazar los iones sodio por potasio.
● Luego de un paso de centrifugación, el ADN plasmídico permanece en solución
en tanto que los contaminantes quedan en el fondo del tubo.
53
Luego de la purificación se puede determinar su rendimiento midiendo absorbancia a
260 nm, y su pureza e integridad por cromatografía en geles de agarosa.
La concentración de ADN se puede estimar utilizando un espectrofotómetro de luz
ultravioleta (UV), debido a que las bases púricas y pirimidínicas del ADN tienen la
propiedad de absorber la luz UV a 260 nm (ver diapositiva 10). Dado que el ADN
bicatenario absorbe menos que el monocatenario, y este menos que los nucleótidos sin
oligomerizar (ver diapositiva 27), una unidad de densidad óptica (DO) a 260 nm
equivale aproximadamente a 50 μg/ml de ADN de doble cadena, a 40 μg/ml de ARN
ó ADN de cadena simple, y a 33 μg/ml de oligonucleótidos.
La determinación de la pureza de ADN se establece mediante la lectura de las
absorbancias a 260, 280 y 320 nm. En las preparaciones de ácidos nucleicos, son
frecuentes las impurezas de naturaleza proteica. Dado que los aminoácidos aromáticos
(Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV (revisar seminario de proteínas), la presencia de
proteínas lleva a sobreestimaciones de la concentración de ácidos nucleicos. La
concentración de proteína puede ser evaluada a una absorbancia de 280 nm, por lo que
es posible estimar el grado de impurezas de origenproteico a partir del cociente
A260/A280. La presencia de proteínas en la muestra hará que el cociente A260
nm/A280 sea menor que el esperado para ácidos nucleicos puros. Una muestra pura
debe presentar una relación 260/280 nm que exceda el valor de 1.7 para propósitos
analíticos.
Otro parámetro a considerar es la absorbancia a 230 nm, que está relacionada con la
difracción de la luz por material particulado en la muestra. En algunos casos también
se determina la absorbancia a 230 nm. Si Abs230/Abs260 es mayor de 0.5, sugiere
contaminación con fenol, cloroformo o carbohidratos.
Cuando la muestra es impura se revisa y repite el protocolo de purificación empleado.
55
Al igual que las proteínas, la concentración de ADN también se puede determinar
utilizando el equipo Nanodrop (revisar seminario de proteínas). La gran ventaja de
esta técnica es que el volumen necesario para la cuantificación es muy pequeño (1ul).
56
La electroforesis en geles de agarosa es una de las técnicas analíticas utilizadas en la
caracterización de ácidos nucleicos en base a la forma y tamaño de las moléculas. La
carga neta negativa, producto de los grupos fosfatos en el ADN y el ARN, resulta en
una migración de las moléculas desde el polo negativo hacia el positivo cuando se
aplica un campo eléctrico. La matriz, formada por agarosa (un polisacárido ramificado
de unidades de D-galactosa y 3,6-anhidro-galactosa) ofrece resistencia al movimiento:
las moléculas de mayor tamaño podrán migrar menos a través de la matriz por lo que
quedarán en la región más cercana al punto de siembra, mientras que los fragmentos
de menor tamaño se movilizarán con mayor velocidad. La conformación también
afecta la migración, y en este sentido los ácidos nucleicos migran más cuanto más
superenrollados se encuentran (observar en las diapositivas 30 y 60 las diferencias en
la migración de un mismo ácido nucleico según su grado de enrollamiento).
Generalmente los geles de agarosa en corrida horizontal son utilizados para separar
fragmentos entre 100 pb hasta 20 kb, en tanto que para la separación de moléculas de
menor tamaño se utilizan geles de poliacrilamida.
57
Uno de los métodos más utilizados para la visualización de los ácidos nucleicos en
geles de agarosa es la tinción con el fluoróforo bromuro de etidio. Una molécula con
grupos planares tricíclicos que se intercalan entre las bases del ADN sin especificidad
de secuencia (debido a esto es que es altamente cancerígeno). Al unirse a los ácidos
nucleicos, esta molécula aumenta su fluorescencia emitiendo luz visible (color
naranja).
Dependiendo de la concentración de agarosa en el gel, la matriz formada permitirá la
separación efectiva de diferentes tamaños de ácidos nucleicos durante la
electroforesis, y en consecuencia el tamaño (expresado en pares de bases o pb) puede
ser calculado utilizando como referencia un marcador de pares de bases conocido.
En la figura se pueden observar las diferencias en la migración del ADN de uno de los
marcadores más utilizados, el bacteriófago lambda, antes (1 banda de 48.5 kbp) y
después de ser digerido con la enzima de restricción Hind III. También se muestran
otros marcadores, como el 1 kb ladder, que contiene bandas que aumentan su tamaño
cada 500 bp (zona inferior) y cada 1000 bp (zona superior), y el 100 bp ladder, que
como su nombre lo indica, contiene bandas cada 100 bp.
Las concentraciones de ADN en cada banda son conocidas y en ocasiones los
fabricantes incluyen más ADN de determinado tamaño de modo de producir una
banda más intensa que sea fácil y rápidamente distinguible.
Para que la estimación del tamaño sea efectiva, es importante que el ADN de la
muestra también se encuentre linealizado.
59
60
La purificación de ADN plasmídico (imagen de la izquierda) o de ARN (imagen de la
derecha) también puede ser evaluada mediante electroforesis en geles de agarosa. En
las dos figuras se muestran ejemplos de los mismos.
En la imagen correspondiente al resultado de la purificación del ADN plasmídico se
observa la presencia de tres bandas. Si bien la purificación fue exitosa, esto se debe a
las formas lineal, circular y superenrollada que pueden encontrarse para un ADN
plasmídico.
Gel 1 (izquierda): calle 1: marcadores de número de pares de bases y en la calle 2:
muestra de ADN plasmídico. Observar los perfiles de migración, ¿a qué se deben?
Se puede obtener información de la integridad del ARN mediante la observación de la
intensidad de las principales bandas de ARNr. Para ARNr de mamífero, una relación
de 28S:18S de 2:1 es generalmente representativa de ARN de buena calidad.
Gel 2 calle 1: marcadores de bp.
calle 2: ARN degradado por la presencia de ARNsas
calle 3: ARN purificado correctamente.
En las siguientes diapositivas hablaremos de diferentes métodos de secuenciación.
La flecha en la figura señala el -OH que se reemplaza por -H para obtener el dideoxi
NTP (ddNTP) utilizado en el método de Sanger.
El método de secuenciación de Sanger* se basa en la incorporación de
dideoxinucleótidos (ddNTP) durante la replicación in vitro del ADN. El método hace
uso de la capacidad natural de la ADN polimerasa de generar la hebra de ADN
complementaria a otra, mediante la extensión de una cadena preexistente
complementaria (primer). Durante la reacción, la enzima incorpora nucleótidos
(dNTPs) en el sentido 5' → 3', dejando el libre 3'-OH tras la incorporación de cada
nucleótido, lo cual es necesario para la incorporación del siguiente. La técnica de
secuenciación requiere un primer, complementario al extremo 3' de la región de ADN
que se desea amplificar, marcado radiactivamente. Además, junto con los 4
deoxinucleótidos (dNTPs) debe agregarse--de a uno por vez--una baja proporción de
uno de los ddNTP, que carecen del grupo OH en el C3 y que, por tanto, una vez
incorporados por la polimerasa no permiten que continúe la elongación de la cadena.
De esta manera, se generarán fragmentos con ddNTPs en todas las posiciones, dando
lugar a fragmentos de distinto tamaño que permiten reconstruir la secuencia.
Procedimiento:
Se preparan cuatro mezclas de reacción en tubos diferentes. Todos las mezcla
contienen los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dTTP y dGTP), ADN
polimerasa I y un primer marcado radiactivamente. Sin embargo, a cada uno de los
tubos se le incorporará uno solo de los dideoxinucleótido (ddATP, ddCTP, ddTTP o
ddGTP); es decir, cada tubo tendrá un ddNTP diferente.
El ddNTP utilizado competirá con su homólogo por incorporarse a la cadena de ADN
que se está sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en el momento y
lugar donde se incorpora. De este modo, en cada mezcla de reacción se sintetizan
moléculas de ADN de diferente longitud que terminarán todas cuando el ddNTP sea
incorporado(ver secuencias en paso 2).
A continuación se realiza una electroforesis en gel para separar los fragmentos de
ADN producidos (como se indica en la figura, en cada calle se siembra el contenido
de cada uno de los tubos de reacción). Para este procedimiento se utilizaban geles
verticales muy finos (0,5 mm de espesor) y de gran longitud (50-100 cm) que
permiten distinguir diferencia de tamaño de 1 bp.
Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una película
fotográfica de autorradiografía; recordemos que los primers utilizados se encuentran
marcados radioactivamente. La aparición de una banda en una posición concreta de
una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN está la
base correspondiente al ddNTP utilizado en la mezcla de reacción correspondiente.
Teniendo en cuenta que el ADN se sintetiza en dirección 5' → 3', los fragmentos de
menor tamaño corresponderán al extremo 5' (es decir que de abajo hacia arriba es 5'
→ 3'). A su vez, como los ddNTP son agregados siguiendo las reglas de
complementariedad, la secuencia obtenida es la complementaria a la que se desea
secuenciar.
https://youtu.be/FvHRio1yyhQ*En 1980 Sanger recibió su segundo Premio Nobel en Química por desarrollar esta
técnica.
62
El método automático, al igual que el método de Sanger, utiliza ddNTPs pero el
análisis de los productos de reacción se realiza mediante fluorescencia ya que se
emplean los 4 ddNTPs marcados con fluorocromos diferentes. La separación de los
fragmentos se realiza una electroforesis en capilar lo que permite que la detección se
lleve a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, ya que los productos pasan por
delante de un láser que excita los fluoróforos mientras un detector recoge la señal. A
su vez, este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al
mismo tiempo los productos de reacción de cada una de las cuatro mezclas.
Adicionalmente, como los fragmentos de ADN de menor tamaño que han sido
detectados se dejan escapar del gel, la técnica permite aumentar el número de
nucleótidos que se pueden determinar en cada secuenciación.
https://youtu.be/wdS3j0TgbjM
https://youtu.be/wdS3j0TgbjM
En la figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el método
automático de secuenciación. Cuando aparece la letra N significa que no ha sido
posible determinar el nucleótido existente en esa posición de la secuencia.
En la figura se muestra una tabla comparativa de distintos métodos de secuenciación.
Observar los costos, la demora experimental y la longitud de la muestra a secuenciar.
Next Generation Sequencing (NGS) es una plataforma que permite la secuenciación
de miles de millones de ADN a la vez, por lo que revolucionó los campos de la
medicina personalizada, las enfermedades genéticas y el diagnóstico clínico. Las
diferencias en las 4 metodologías de NGS radican en los detalles técnicos de las
reacciones de secuenciación:
Pirosecuenciación: se incuba con un ddNTP a la vez y se detecta la liberación de PPi
con cada nucleótido incorporado gracias a una reacción acoplada de la enzima
luciferasa. Permite secuenciaciones largas, pero tiene mucho error.
Secuenciación por síntesis: se basa en la incorporación secuencial y reversible de
ddNTPs fluorescentes (con 4 colores distintos). Los 4 nucleótidos se incuban a la vez
y luego de 1 reacción, se lavan los restantes. La señal se lee y el ddNTP se escinde de
la secuencia, se lava y se continúa elongando. A medida que se extiende la secuencia
aumenta el ruido por eliminaciones imperfectas de la sonda.
Secuenciación por ligación: se diferencia por ser la única que no utiliza ADN
polimerasa. En su lugar emplean fragmentos fluorescentes de 8nt con secuencias
variables, donde cada color identifica sus 2 primeros nucleótidos (ACxxxxxx →
AC:rojo). Como las xxxxx son secuencias variables, siempre habrá una zona
complementaria donde hibridar. Cuando esto sucede junto al primer, una ligasa los
une, en tanto que todo lo demás se lava y luego se registra la señal. A continuación la
sonda y los últimos 3nt se clivan y se repite todo hasta terminar la cadena. El proceso
se repite usando un primer que hibrida en la misma región que el anterior, pero
desplazado 1nt. Se repite unas 5 veces hasta secuenciar por completo.
Secuenciación por Ion semiconductor: utiliza la liberación de hidrógeno durante la
elongación. Con cada incorporación de nt hay un ligero cambio en el pH que es
detectado por un semiconductor. Es muy similar a la pirosecuenciación, pero mucho
más económica.
https://youtu.be/jFCD8Q6qSTM
65
La secuenciación de 3ra generación surge con desarrollos de las empresas 
Biosciences (PacBio) y Oxford Nanopore Technologies (ONT) (en 2011 y 
2014). Presentan como principales ventajas que la secuencia se obtiene a 
partir de moléculas únicas en tiempo real y con lecturas largas. 
La plataforma PacBio utiliza una tecnología llamada SMRT (single-molecule real-
time), en la que no se requiere PCR en la preparación de la biblioteca. 
Durante el proceso de secuenciación, la señal fluorescente se obtiene cuando 
un dNTP marcado se incorpora a una nueva molécula de DNA, por lo que esta 
tecnología se basa en la secuenciación por síntesis de DNA. Una cámara 
registra el color y la duración de la señal, en tiempo real, y es capaz de 
traducir qué base fue incorporada y si tenía modificaciones (por ej. 
Metilación).
ONT emplea nanoporos insertados en una membrana eléctricamente resistente. 
Cuando se aplica una diferencia de potencial, sólo fluye la corriente a través 
de dichos poros, por los cuales también pasa una hebra de DNA. El sentido en 
el cual pasa la hebra puede ser revertido al invertir la corriente, lo que 
permite “destrabar” la hebra en caso de haber estructuras 2rias o 
66
plegamientos. En la preparación de la biblioteca, se añaden “secuencias 
códigos” y se obtienen las moléculas a secuenciar en fragmentos largos; 
también pueden generarse estructuras de tipo hairpin que permitan unificar 
ambas hebras de la doble hélice, para obtener así la secuencia de ambas 
cadenas en una secuencia única. Durante el proceso de secuenciación se 
“mide” la interferencia o modificaciones en la señal eléctrica, pudiendo 
obtener la identidad de los nucleótidos y también si poseen modificaciones. 
Mediante la tecnología de ON se pueden obtener secuencias tan largas como de 
millones de pb (el récord es de 4 millones), lo que simplifica mucho el 
ensamble de genomas o secuencias muy largas/complejas.
Además, los equipos son económicos y pueden ser transportables, lo que permite 
que se estén llevando a cabo proyectos de secuenciación a campo. Por 
ejemplo, el MinION fue utilizado en África en los últimos brotes de Ebola. 
Mediante la secuenciación de 3ra generación pueden obtenerse las secuencias de 
variantes estructurales, elementos repetitivos, secuencias altas en contenido 
GC, o secuencias con múltiples elementos homólogos dentro de un genoma, 
que resultan sumamente difíciles de obtener mediante las tecnologías de 
NGS.
https://encuentros.uma.es/assets/journals/13/175singles/175.4_secuenciacion.p
df
https://www.youtube.com/watch?v=R_GQDVZYzno
66
La tasa de error de PacBio y ONT ha sido mejorada en los últimos años, al punto 
de ya encontrarse por debajo del 5% utilizando los kits con las últimas 
químicas disponibles. 
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Esta técnica también se basa en la replicación realizada por las ADN polimerasas, y
utiliza reactivos similares. Una de las diferencias más importantes es que emplea 2
primers (en lugar de 1) que flanquean la secuencia de interés a amplificar, es decir
que se diseñan para que sean complementarios a la región 3’ de cada hebra del ADN
molde. Al hibridar el primer sobre la cadena molde, deja el OH 3’ libre para que la
polimerasa realice la elongación de cada cadena (ver detalle en siguiente diapositiva).
Esta técnica emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para, separar las
hebras de ADN formadas tras cada fase de replicación (desnaturalización), permitir
que los primers vuelvan a unirse (hibridación), y duplicar nuevamente las hebras
(extensión) (ver detalle en siguiente diapositiva).
Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar
los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevamente polimerasas luego de
cada ciclo. Sin embargo, se comenzaron a utilizar ADN polimerasas termoestables,
extraídas de microorganismos adaptados a vivir a altas temperaturas (como Thermus
aquaticus (Taq polimerasa), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis
(Vent) y Thermus thermophilus (Tth)). Generalmente se emplean mezclas de
polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores
(proofreading).
En 1993 Kary Mullis y Michael Smith recibieron el Premio Nobel de Química debido
a las mejoras que hicieron sobre esta técnica.
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La PCR se basa en la repetición de un ciclo formado por las tres etapas mencionadas
anteriormente:
1ª Desnaturalización del ADN doble cadena. La doble hélice de ADN se separa en dos
hebras. Para ello se realiza una incubación de la muestra aaltas temperaturas (93-
97ºC).
2ª Hibridación de los primers a las zonas que flanquean el fragmento que queremos
amplificar. Se producirá cuando la temperatura disminuya (50-65º C, dependiendo de
los primers utilizados).
3ª Extensión por ADN polimerasa (68-72°C). La polimerasa utiliza el OH libre en la
posición 3’ del primer y comienza a añadir dNTPs en dirección 5’→3’ siguiendo la
secuencia de la cadena molde (complementaria).
Una vez completado el primer ciclo, disponemos de 2 copias de la muestra original, al
final del segundo ciclo tenemos 4, al final del tercero 8,...Si los ciclos se producen un
número "n" de veces y suponiendo que el número de copias de ADN se duplica en
cada ciclo, obtenemos una cantidad de ADN de 2n, por lo que la amplificación se
realiza en forma de progresión geométrica (el amplificado será A=A0*2
n, donde A0
son la cantidad de moléculas de molde iniciales, y n es el número de ciclos).
Observar en la figura que la amplificación del fragmento de interés responde a una
velocidad levemente menor: al final del primer ciclo dispondremos de la hebra
original y 1 copia de cada cadena (no sólo la región a amplificar, sino también unos
pb extra -ver en figura productos largos), y será recién luego de finalizado el tercer
ciclo que obtendremos dos copias de la región a amplificar ( productos cortos). En el
siguiente ciclo tendremos 8 copias, y en el 5to ciclo tendremos 22 copias, 52,
114..etc.. Tanto el producto largo como el corto se amplifican en cada ciclo, pero es
importante aclarar que, al finalizar todos los ciclos de la PCR, la cantidad del producto
corto sintetizado es muy superior en comparación con el producto largo.
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La técnica llamada Transcripción Reversa o Retrotranscripción (RT-PCR) consiste en
obtener , a partir de una hebra de ARN, una molécula de ADN complementaria
(cDNA) a ella, en un proceso inverso al de la transcripción, mediante la enzima
retrotranscriptasa. Es una técnica muy utilizada debido a que la mayoría de los
procedimientos en el laboratorio de biología molecular (secuenciación, amplificación,
clonado) utilizan ADN (y no ARN).
Partiendo de un molde de ARN, implica la síntesis de una molécula híbrida de
ADN/ARN, la degradación de la porción de ARN en el híbrido, y la síntesis de la
hebra complementaria a la molécula de ADN simple cadena remanente.
Existen diversos tipos de retrotranscriptasas disponibles. Algunas poseen actividad
ADN polimerasa ARN dependiente, actividad ribonucleasa H y actividad ADN
polimerasa ADN dependiente, de modo que permite catalizar la polimerización de
ADN utilizando como molde ADN, ARN e híbridos ARN:ADN. Otras son solo ADN
polimerasa ARN dependiente, y requieren de enzimas y pasos adicionales para
completar el proceso de síntesis de cDNA. Requiere Mg2+ o Mn2+ y un primer,
pudiendo utilizarse oligo(dT), hexámeros al azar o primers específicos. Las
condiciones de reacción varían según el primer utilizado, pero típicamente implican
una incubación de 60 minutos a 37-60°C.
El producto de retrotranscripción puede utilizarse directamente en una PCR porque la
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enzima se inactiva al calentarla a 95°C.
https://youtu.be/0MJIbrS4fbQ
70
Cuantificación mediante PCR (qPCR). Estas técnicas se basan en la amplificación 
de una molécula o de una región de interés de modo de poder cuantificarla. 
Actualmente la más utilizada es la qPCR en tiempo real (real time qPCR). Es 
una variante de la PCR convencional utilizada para amplificar un ácido 
nucleico de interés pero que permite simultáneamente cuantificar el 
producto de la amplificación en tiempo real. 
Utiliza un primer complementario a una parte del ADN que queremos amplificar 
por lo cual tiene alta selectividad. Para podes realizar la 
cuantificación se pueden utilizar fluoróforos
acoplados a primers o utilizar agentes intercalantes
(ver siguiente diapositiva). Esta cuantificación en 
tiempo real se lleva a cabo midiendo la 
fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR 
la cual será proporcional a la cantidad de ADN que 
se está amplificando.
Se pueden utilizar fluoróforos acoplados a primers o utilizar agentes intercalantes.
● Agentes intercalantes: Son sustancias que al formar complejos con el ADN doble
cadena (sin interferir en su síntesis) aumentan su fluorescencia. Ejemplo: bromuro
de etidio y SYBR Green (más sensible y menos tóxico). El intercalante es muy
sensible, puede utilizarse con distintos moldes (no así las sondas marcadas) y es
relativamente económico. La principal desventaja es que puede unirse a cualquier
ADN de doble cadena, incluyendo dímeros de primers y productos inespecíficos.
● Primer marcado: la sonda lleva adherida una molécula fluorescente y otra
molécula que inhibe la fluorescencia de la primera (quencher), de tal forma que
sólo cuando la sonda es desplazada de su sitio debido a la amplicicación del
ADN, la molécula fluorescente se aleja del quencher y emite fluorescencia al ser
iluminada. Las sondas marcadas permiten diferenciar los productos específicos de
cualquier otro ADN de doble cadena. Existen diferentes estrategias para el diseño
de sondas fluorescentes. Es posible realizar reacciones múltiples utilizando
sondas con diferentes fluoróforos. La principal desventaja está dada en los
mayores costos y en mayor complejidad en el diseño. Las sondas TaqMan (de
Taq Pol y Pac Man) son las sondas más comúnmente usadas (ejemplo del panel
derecho). Están compuestas por entre 13 y 18 nt, y poseen un fluoróforo
covalentemente unido al extremo 5' de un oligonucleótido y un quencher en el
72
extremo 3'. En cada ciclo de la reacción, el ADN de doble cadena es
desnaturalizado, y la sonda puede hibridarse con su región complementaria;
durante el paso de polimerización, la sonda es degradada por la polimerasa
liberando el fluoróforo por lo que se observa un aumento de la fluorescencia.
72
La cuantificación mediante real time qPCR requiere una curva de calibración con un
estándar en distintas concentraciones conocidas (diferentes diluciones). Se obtienen
cuantificaciones muy precisas, sensibles y rápidas. Una desventaja de esta técnica es
que los reactivos y el equipamiento tienen un costo relativamente alto.
Las reacciones se caracterizan por el momento (o ciclo de PCR) en que se detecta que
ha habido amplificación (debido a la presencia del ADN objetivo). Este valor se
denomina ciclo umbral (CT del inglés cycle threshold), y se define como el ciclo en el
que la intensidad de fluorescencia supera un cierto nivel (ruido de fondo). En
consecuencia, a mayor cantidad de DNA molde inicial, más rápido se observará un
aumento apreciable de la fluorescencia, y menor será el valor de CT.
La PCR digital (dPCR) permite una cuantificación directa de las moléculas presentes
en una muestra. Representa una mejora sobre la real time qPCR, ya que otorga una
cuantificación absoluta (no depende de estándares), y es capaz de distinguir diferentes
especies incluso si se encuentran a muy baja concentración (menos de 50 copias). Se
basa en realizar PCRs a partir de 1 molécula de molde. Las reacciones se realizan en
microarreglos con miles de posiciones. Para ello, la muestra es diluida y dividida en
pocillos, de manera que en cada uno haya una o ninguna molécula de molde. Los
productos se hacen detectables mediante fluorescencia utilizando sondas de tipo
TaqMan. Además de la alta sensibilidad, el hecho de trabajar con muestras muy
diluidas minimiza el efecto de interferencias e inhibidores que pudieran estar
presentes. Cuando en qPCR se utilizan sondas marcadas con diferentes fluoróforos
para distinguir cada molde, las moléculas que producen poca señal pueden no ser
detectadas por la competencia con los demás fluoróforos. dPCR resuelve este
problema, ya que la mezcla de reacción se diluye y distribuye en una gran cantidad de
pocillos de modo lograr 1 molécula de molde por pocillo.
Existe una variante a esta técnica que es la droplet digital PCR, el fundamento es el
mismo,