TALLER GRUPAL

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MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
ESTUDIANTE: CELIA THAIS MOREIRA GARCÍA
Mediante el microscopio electrónico es posible observar la morfología de las partículas virales presentes en muestras clínicas y se utiliza ampliamente en investigación, siendo restringida su aplicación al diagnóstico. Existen dos técnicas básicas: la microscopía de transmisión y la tinción negativa. 
Para el estudio de partículas virales en tejidos y células infectadas se emplea la microscopía electrónica de transmisión. Su poder de resolución permite observar estructuras moleculares como proteínas y ácidos nucleicos. Sin embargo, los haces de electrones que forman las imágenes de la muestra tienen escaso poder de penetración y no permiten la visualización directa de células aisladas ya que resulta demasiado gruesa. Esta técnica permite el estudio de las etapas de la replicación viral en las diferentes estructuras celulares y, asimismo, permite 
¿QUÉ ME DETECTA? 
Este método directo de diagnóstico virológico permite observar la morfología de las partículas virales, es decir, detecta la partícula viral como tal. 
PRINCIPIO – FUNDAMENTO 
· Su principio de funcionamiento se basa en utilizar electrones en lugar de luz para obtener una imagen de la muestra. Las partes principales del microscopio electrónico son: una fuente de electrones, un conjunto de lentes electromagnéticas, una cámara de vacío y una pantalla fluorescente. 
· El equipo (microscopio) tiene un cañón grande que emite electrones para que se difundan sobre la muestra, la cual estará sobre una grilla de carbón, ahí debe incidir el haz de electrones. Pero para que la muestra se pueda ver de blanco y negro, hay que agregarle a la muestra el ácido fosfotúngstico (en algunos casos el ácido uranílico) que tendrá acción de teñir negativamente las muestras. 
· En los viriones que no penetra la tinción se observan partículas blancas en fondo oscuro, esto se debe a la acción entre el ácido fosfotúngstico y el haz de electrones que cubre a la muestra. 
· Concentración de partículas virales es de al menos 10*4/ml 
PROCEDIMIENTO 
1. Colocación de un antisuero específico a una dilución adecuada. 
2. Rejilla sensibilizada. 
3. Aplicación de muestra con virus. 
4. Rejilla con partículas virales adheridas. 
5. Aplicación de contrastante. 
6. Rejilla contrastada lista para observar en el microscopio electrónico. 
IDENTIFICACIÓN DE RESULTADOS 
Aquí se observa la morfología de los viriones 	basándose en los conocimientos inculcados referentes a la forma y tamaño de cada virus. 
· Identificación rápida de viriones con morfología distintivas. 
· Observación 	directa de muestra clínica. 
· A veces en líquido de cultivo celular 
VENTAJAS 
· Mejora el diagnóstico virológico con un resultado más confiable. 
· La sensibilidad y rapidez son buenas 
· Resultado confiable. 
· Reconoce e identifica un virus en particular. 
DESVENTAJAS 
· Alto costo del equipo 
· Limitada diámetro de resolución (por qué no hay gran cantidad de muestra) 
· Persona experta para manejarla. 
Realizado por:
 (ENZIMOINMUNOANÁLISIS) ELISA DIRECTA
ESTUDIANTE: CELIA THAIS MOREIRA GARCÍA
Las técnicas de enzimoinmunoensayo se pueden emplear tanto para detección de antígenos virales como de anticuerpos específicos (IgM, IgG o Igs totales). Son procedimientos de alta sensibilidad, similar a la del radioinmunoensayo (RIA) y para algunos virus (virus respiratorios), similar a la de la IF. 
La técnica de ELISA requiere, en términos generales, de tres componentes esenciales: el antígeno a detectar o cuantificar, un anticuerpo específico para ese antígeno conjugado a una enzima que genere una reacción cuantificable y un sistema que permita estimar la cantidad de antígeno presente en la muestra a partir de la reacción enzimática que se genere. El resto de los detalles variará dependiendo del tipo de ELISA. 
¿QUÉ ME DETECTA? 
Detecta antígenos virales como anticuerpos específicos IgM, IgG, Igs totales. Se emplean para la detección de marcadores de HB (Hepatitis B), para antígenos del rotavirus, adenovirus, virus respiratorios, herpes simplex. El ELISA directo es adecuado para determinar la cantidad de antígenos de alto peso molecular y se considera el tipo de ELISA más simple 
PRINCIPIO – FUNDAMENTO 
Se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo, un colorante, puede ser medido espectrofotométricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre. 
PROCEDIMIENTO 
1. Preparación: Sacar el reactivo a temperar a 25 grados 
2. Disolver: En cada pocillo poner 100 microlitros de la muestra diluida (cada pocillo puede con 400 microlitros) 
3. Aquí después se agrega la enzima (TMB sustrato 100 microlitros) (ojo) 
4. Primera incubación: La muestra se incuba a 37 grados centígrados durante 1 hora. 
5. La sacamos, se lava de 5 a 6 veces se le coloca el conjugado 
6. Incubamos por segunda vez por (1 hora más) y agregamos el sustrato 
7. Se deja 15 minutos (reacción del TMB, enzima y muestra) y se pone solución de Stop 
8. Leemos visualmente o por un espectrofotómetro 
IDENTIFICACIÓN DE RESULTADOS 
Los resultados finales de la lectura colorimétrica se reflejan numéricamente mediante valores de absorbancia o densidad óptica que se obtendrán a la longitud de onda más adecuada para la coloración final. 
El sustrato da el resultado + agua oxigenada + peróxido de rábano picante, hace que reaccione y se elimine un radical de agua + promogeno se oxida y da un producto coloreado. 
VENTAJAS 
· No se necesita de un observador experimentado 
DESVENTAJAS 
· Alto costos de equipos automatizados 
· Es un procedimiento complejo 
· Algunos sustratos pueden ser cancerígeno 
 Realizado por:
 INMUNOFLORESCENCIA DIRECTA
ESTUDIANTE: SCARLET VIVIANA LAVID SANDOVAL
QUE DETECTA: 
La inmunofluorescencia directa (DIF) es una técnica utilizada en el laboratorio para diagnosticar enfermedades de la piel, los riñones y otros sistemas de órganos. También se le llama prueba fluorescente inmune directa o primario inmunofluorescencia. 
PRINCIPIO: 
Directo: marcador de fluoro foro se conjuga directamente con el anticuerpo primario que reaccionara con el epítopo diana. Necesitan contener grupos químicos capaces de formar enlaces covalentes con moléculas de proteínas, emitiendo una alta fluorescencia en el espectro visible con una coloración diferente a la emitida por los tejidos 
 PROCEDIMIENTO: 
Se toma la muestra clínica, por ejemplo, un frotis faríngeo y este tendrá el antígeno del microorganismo en estudio. Este frotis es puesto en contacto con un anticuerpo monoclonal específico del antígeno y esta conjugado con isotiocianato de fluorescencia. Únicamente los microorganismos que tienen el antígeno en estudio reaccionarían y se creara un complejo antígeno-anticuerpo. 
 
· Grupo funcional de la molécula fluorescente que absorberá energía (FOTONES) de una longitud de onda especifica elevándola a un estado muy corto de excitación, permanece en estado de excitación por un periodo de tiempo muy corto. El retorno a nivel de energía es acompañado por emisión de luz. (fluorescencia) este fenómeno luminoso visible tiene una longitud de onda diferente mayor longitud de onda (es decir con menor energía). 
· Al atravesar la energía el compuesto hace que se desubiquen los autónomos que lo forman y giran en sus orbitas alrededor del núcleo. 
· Longitud de onda es absorbida por la sustancia fluorescente emiten está a una longitud que lo forman diferente. 
· Fluoro foro: Parte del fluorocromo responsable de la emisión de la fluorescencia 
· Fluorocromo: Marcador para un determinado anticuerpo, molécula capaz de absorber fotones y emitir de menor energía (mayor longitud de onda). 
· La cantidad de energía emitida y su longitudde onda dependen tanto del propio fluorocromo como de su ambiente químico. 
INTERPRETACION DE RESULTADOS 
Positivo: La fluorescencia está presente en los tejidos al conjugarse con el antígeno especifico 
Negativo: La inmunofluorescencia está ausente 
 Considerar que hay factores que intervienen o afectan los resultados de la prueba, incluyendo el tipo de reactivo, fijador, tiempo y concentraciones, especie de los anticuerpos, uy colores emitidos por el fluorocromo, siendo los colores del espectro medio como la verde manzana co0n utilización más frecuente en la prueba, vista desde el microscopio de fluorescencia en luz ultravioleta. 
VENTAJAS: 
· La IF es una técnica rápida y especifica que se puede hacer en un corto espacio de tiempo ya solo requiere un solo paso de etiquetado. En comparación con la indirecta que necesita usar un anticuerpo secundario conjugado para detectar el anticuerpo primario (más pasos adicionales). 
· Generalmente es más sensible al cultivo celular. 
· Se pueden identificar microorganismos específicos en un grupo mixto. 
· Evita la reactividad cruzada entre anticuerpos secundarios, en la directa el fluorocromo ya está conjugado con el anticuerpo primario mientras que en la indirecta los secundarios pueden reaccionar de forma cruzada con especies distintas a la diana. 
 
DESVENTAJAS: 
· Baja sensibilidad en comparación con otras técnicas (IFI/PCR) la indirecta ofrece una mayor sensibilidad porque más de un anticuerpo secundario puede unirse a cada anticuerpo primario, lo que resulta una amplificación de la señal. 
· Menor flexibilidad, en el caso de la secundaria puede utilizar varios anticuerpos secundarios mientras que en la directa los anticuerpos primarios preconjugados disponibles limitan su flexibilidad. El flujo del trabajo puede ser menos flexible (puede haber menos colores disponibles), más caro y si los conjugados directos etiquetados comercialmente no están disponibles, más difícil. 
· La señal del fluorocromo en el número finito del fluoro foros que se puede unir a un solo anticuerpo y por tanto se limita la detección a objetivo de alta abundancia. 
Realizado por:
 INMUNOPEROXIDASA
ESTUDIANTE: SCARLET VIVIANA LAVID SANDOVAL
QUE DETECTA: 
La posibilidad de determinar en un huésped la presencia de anticuerpos específicos contra antígenos específicos, y por tanto establecer un diagnóstico indirecto y seguir el curso de tales anticuerpos ha sido estudiada con distintos sistemas. En el estudio y evaluación de las enfermedades del tejido conectivo (Lupus Eritematoso Sistémico. Artritis Reumatoidea, Escleroderma, Enfermedades Conectivas Mixtas], el estudio de los anticuerpos antinucleares por inmunofluorescencia es sin duda la prueba más sensible y mejor estandarizada. 
 PRINCIPIO: 
 La posibilidad de determinar en un huésped la presencia de anticuerpos específicos contra antígenos específicos, y por tanto establecer un diagnóstico indirecto 
 
PROCEDIMIENTO: 
· Se utilizó la técnica descrita por Sternberg modificada por Holubar y Wolff. Los cortes de hígado de rata Wistar de un mes de dad. Fueron obtenidos por crióstato; se utilizaron cortes de tres micras los cuales se montaron en láminas portaobjetos específicamente diseñados para el caso y se utilizaron frescos y sin fijar. 
· Los sueros se procesaron haciendo hasta 10 diluciones seriadas, al doble, a partir de 1:10 usando como diluyente solución salina buffer pH 7.2. Los controles consistieron en suero reactivo conocido, un suero negativo y un control de coloración en el que. en vez de suero, se utilizó solución salina. 
· Las láminas con los cortes fueron coloca das en un soporte de madera y después de mantenerlas al ambiente, por 30 minutos se cubrió cada corte con suero normal de cabra, que, de acuerdo con lo recomendado por varios autores (3, 4, 5) evita reacciones de especificidad. Cada preparación fue cubierta luego con la respectiva dilución, tanto de los sueros problema como de los controles; luego de una incubación en cámara húmeda por treinta minutos a temperatura ambiente, se retiró el exceso de suero dejándolo caer libremente sobre servilletas de papel y se lavaron las láminas, colocadas cuidadosamente en un soporte, en solución salina buffer pH 7.2 por diez minutos. Enseguida se cubrieron las preparaciones, nuevamente colocadas en el soporte de madera, con un antisuero anti-IgG humana obtenido en cabra y previamente titulado para contener 8 U. precipitantes por ml., y se cumplió el proceso de incubación y lavado en forma idéntica al paso anterior. 
· En el paso siguiente las preparaciones fueron tratadas con un suero anti-cabra no diluido. Obtenido en conejo y sometidas al procedimiento de los anteriores pasos. Luego se trataron las preparaciones con un suero anti-peroxidasa obtenido en cabra; se utilizó una dilución 1:8. 
· En el paso final se cubrieron las preparaciones con peroxidasa en una concentración de 25 mg/ml. Luego de la incubación adecuada y subsiguiente lavado se procedió a fijar las preparaciones en una solución de glutaraldehído 1.25% por un tiempo crítico de 15 minutos, transcurridos los cuales, se lavaron cuidadosamente con solución salina tamponada. buffer por diez minutos 
· Para revelar la reacción de la peroxidasa se utilizó el procedimiento de Graham y Karnovsky usando el revelador preparado minutos antes Este reactivo se colocó cuidadosamente sobre cada uno de los cortes y se dejó actuar por un máximo de 15 minutos, al término de los cuales se lavó con buffer de Tris-HC1. 0.5 M pH 7.6 por diez minutos. Luego se montaron las preparaciones con líquido de montaje consistente en una mezcla de nueve partes de solución salina buffer y una parte de glicerol y se cubrieron con laminillas. 
 
 
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
De los setenta sueros estudiados que llenaron los requisitos de calidad exigidos. Siete presentaron inequívocamente pruebas positivas a título de 1:160 a 1:640; siete tuvieron reacción positiva, tres en dilución 120 y cuatro en dilución 1:40. Estas fueron consideradas como negativas, debido a que las reacciones se tomaron como falsas positivas toda vez que la prueba se hizo negativa en las diluciones subsiguientes; cincuenta y cuatro sueros fueron francamente negativo. Al confrontar los resultados obtenidos en esta prueba con los obtenidos por quienes practicaron inmunofluorescencia. Se pudo apreciar la concordancia entre ambos procedimientos tanto para los casos francamente negativos, como para los positivos. Esta concordancia fue tanto cualitativa como cuantitativa. Los casos falsos positivos. Pero fácilmente dilucidados como negativos. En la prueba de peroxidasa, fueron negativos a la inmunofluorescencia. 
VENTAJAS: 
· Permite una localización más precisa de las reacciones ya que la tinción es permanentemente estable. 
· Puede concentrase y puede ser evaluada con microscopio de luz. 
· El material estudiado puede archivarse por años sin pérdida de intensidad de la reacción.
· Los anticuerpos monoclonales han 	permitido aumentar la especificidad sensibilidad y gama de esta técnica. 
DESVENTAJAS: 
· Presencia de reacción inespecífica especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales. 
· Requieren estandarización precisos y estricto control de calidad.
· Algunos reactivos son potencialmente carcinógenos y su manipulación debe ser cuidada.
Realizado por:
 
 CONVERSIÓN SEROLÓGICA
ESTUDIANTE: ZINNA NAYELHI LINO ALVAREZ
DETECTA 
Se aplica para demostrar el contacto con un determinado agente infeccioso causante potencial de enfermedad. También para verificar la protección obtenida mediante una vacuna, si tras la administración de una vacuna se logra una seroconversión del 99%, ello significa que el 99% de las personas vacunadas han adquirido inmunidad frente al agente infeccioso y por tanto están protegidas contra esta enfermedad concreta. 
PRINCIPIO 
Es la aparición de anticuerpos contra una determinada enfermedad infecciosa. Para demostrarla es preciso analizar al menos dos sueros de la misma persona separados por unintervalo de tiempo variable, por ejemplo 2 semanas. En general se considera seroconversión al aumento al menos de cuatro veces en el título de anticuerpos en el suero frente a un antígeno concreto, con relación al obtenido 2 o 3 semanas antes. 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 
La seroconversión como procedimiento diagnóstico tiene sus limitaciones, derivadas de la necesidad de obtener dos sueros del mismo paciente separados en el tiempo, lo cual a veces no es posible, por otra parte, la elevación del nivel de anticuerpos puede demorarse hasta 2 meses tras el inicio de los síntomas y existen casos de falsos negativos, en los que, a pesar de la negatividad de las pruebas serológicas, se puede detectar la presencia del agente patógeno mediante cultivo u otros métodos. 
VENTAJAS 
· La seroconversión puede ser de gran importancia legal en determinadas circunstancias, por ejemplo, para demostrar que se ha producido infección por un agente infeccioso tras un pinchazo accidental con material infectado en un laboratorio clínico. 
DESVENTAJAS 
· La seroconversión suele indicar infección activa, pero con frecuencia se observa tardíamente. 
Realizado por:
 WESTERN BLOT
ESTUDIANTE: ZINNA NAYELHI LINO ALVAREZ 
DETECTA 
Western Blot es una técnica utilizada para detectar una proteína específica en una muestra de sangre o tejido. El método implica el uso de electroforesis en gel para separar las proteínas de la muestra. Las proteínas separadas se transfieren del gel a la superficie de una membrana. 
PRINCIPIO 
Es un principio de proceso de tres pasos con electroforesis en gel, seguido de borrar y sondeo con los anticuerpos de la membrana. Detección de proteína puede ser directa o indirecta, con el último usando un anticuerpo secundario marcado contra el principal. 
PROCEDIMIENTO 
· Preparación de la muestra. 
· Electroforesis en gel. 
· Transferencia a una membrana 
· Inmunotinción 
· Detección de las bandas 
1. Añadir 2ml de TAMPÓN DE LAVADO DILUIDO a cada pocillo. 
2. Utilizando unas pinzas extraiga con cuidado del tubo las TIRAS DE NITROCELULOSA necesarias y coloque cada tira en su pocillo con el numero hacia arriba. 
3. Incube las tiras durante 1 o 2 min a temperatura ambiente en un plato basculante. Extraer el tampón por aspiración. 
4. Añada 2ml de TAMPÓN BLOTTING DE TRABAJO a cada pocillo. 
5. Añada 20 microlitros de suero de pacientes en cada uno de los pocillos. 
6. Cubra la bandeja con la tapa suministrada e incube durante 1 hora a temperatura ambiente en el plato basculante. 
7. Aspirar la mezcla de los pocillos. Evitar contaminaciones. 
8. Lave tres veces cada tira con 2ml de TAMPÓN DE LAVADO DILUIDO, dejando que se empapen durante 5min en la plataforma basculante. 
9. Añada 2ml de SOLUCIÓN DE CONJUGADO DE TRABAJO a cada pocillo. 10. Cubrir la bandeja e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en la plataforma basculante. 
10. Aspire el Conjugado de los pocillos y lavar tres veces. 
11. Añadir 2ml de SUSTRATO a cada pocillo. 
12. Cubra la bandeja e incube durante 15min en la plataforma basculante. 
13. Aspire el sustrato y lavar tres veces. 
14. Utilizando pinzas, coloque las tiras con suavidad sobre paños de papel, cúbralas y séquelas con cuidado. 
15. Coloque las tiras en una hoja de trabajo y Observe las bandas calificando los resultados. 
 
 
 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 
El resultado de la prueba de Western Blot se informa como negativo cuando hay ausencia total de bandas; como indeterminado, cuando no cumple los criterios definidos en la tabla 1 y no es negativo, y positivo cuando cumple los criterios, de acuerdo con el que se haya adoptado. 
VENTAJAS 
· Las membranas húmedas son flexibles y fáciles de manipular. 
· Las proteínas bloqueadas en la membrana son accesibles para los diferentes ligandos. 
· Se necesitan pocos reactivos para el análisis. 
· Se pueden mantener las membranas útiles durante más tiempo. 
DESVENTAJAS 
· Resultados propensos a falsas o subjetiva: A pesar de su sensibilidad y especificidad, una mancha blanca /negra occidental todavía puede producir resultados erróneos. Un falso positivo se produce cuando un anticuerpo reacciona con una proteína no-pensada, que es lo que ocurre con frecuencia cuando un paciente sometido a prueba para el VIH pasa a tener tuberculosis o un número de infecciones parasitarias. 
· Alto costo y demanda de técnica: El costo de un western Blot es un compuesto de los grandes gastos individuales para etiquetado anticuerpos, analistas calificados y equipo de laboratorio. Un proceso delicado, el borrar occidental requiere precisión en cada paso para la correcta identificación de los componentes de la muestra. Un error leve en la concentración de reactivo o en periodo de incubación puede ser desastroso para todo el proceso. 
Realizado por:
 ELISA INDIRECTA
ESTUDIANTE: DIEGO ANDRES PAREDES JIMENEZ
PRINCIPIO DE LA PRUEBA 
La prueba se basa en una placa de micro titulación de poliestireno con 96 pocillos, en el fondo de cada pocillo se encuentra un anticuerpo especifico, en la que se agrega la muestra diluida que contiene el virus, luego se le agrega la enzima peroxidasa y el sustrato TMB (Tetrametil Benceno) que es aquel que dará la reacción química o colorimétrica del antígeno 
¿QUÉ DETECTA? 
· Detección de antígenos virales, anticuerpos específicos: IgG, IgM (especifica de HA, citomegalovirus, herpes simplex). Igs totales (HIV Y HTLV) en una muestra. 
· Detección de marcadores de HB, antígenos del adenovirus, herpes simplex. rotavirus, virus respiratorios. 
 PREPARACION DE LA MUESTRA 
Debemos seguir el Protocolo de trabajo que nos ayuda identificar a la persona que le estamos realizando el examen, además que se debe dejar 6 pocillos para el control, también debemos temperar los reactivos a temperatura de 25 C. por 30 min. 
DISOLUCIÓN DE LA MUESTRA 
1. Se realiza una dilución con el diluyente de muestra. Se pone 100 microlitros en el pocillo, luego de esto así mismo con la muestra del paciente le vamos a agregar 100 microlitros en lo que es el pocillo. 
2. 1 ERA INCUBACION a 37 C 1h. Se incuba la muestra con el diluyente de la muestra y es donde ocurre la unión antígeno anticuerpo al fondo del pocillo. 
3. Se realiza de 5 a 6 lavados con el tampón de lavado de muestra. Para descartar los antígenos que no se han unido. 
4. AGREGAR ENZIMA PEROXIDASA. Se hace el conjugado agregando el anticuerpo con la enzima peroxidasa se le agrega 100 microlitros al complejo antígeno anticuerpo ya formado anteriormente 
5. Se realiza de 5 a 6 lavados para quitar el conjugado que no se ha podido unir 
6. SE AÑADE TMB SUSTRATO (tetrametil benceno) 100 microlitros para dar la coloración al resultado 
7. Se realiza la incubación de 15 min a temperatura ambiente. 
8. Se añade una solución de stop para que se detenga la reacción 
LECTURA DE RESULTADOS: 
· Positiva: cambio de color hacia amarillo o naranja. 
· Negativa: Queda azul (por sustrato de TMB solución de tetrametilbencidina). 
Observamos densidad óptica va hasta 3000 o ponemos en espectrofotómetro y nos da medida. Va de 0 a 3000 
· Positivo fuerte 3000 
· Positivo débil 1500 a 2000 
· Inespecífico en Elisa de 200 a 300 
· Negativo 0 
 VENTAJAS
· Es una técnica sensible
· Fácil
· Buena
· Especifica
· Rápida
DESVENTAJAS
· Necesario elegir materiales de plásticos adecuados como soporte y que algunos sustratos como la ortofenilendiamina pueden ser cancerígenos. 
· Alto costo de los equipos automatizados 
 
 
 
 
Realizado por:
 NEUTRALIZACIÓN
ESTUDIANTE: DIEGO ANDRES PAREDES JIMENEZ 
PRINCIPIO Pone en evidencia la capacidad neutralizante de los anticuerpos presentes en el suero del paciente sobre cepas virales. 
UTILIDAD De gran valor en estudios epidemiológicos, determina la presencia de anticuerpos protectores inducidos mediante vacunas 
PROCEDIMIENTO: 
1. Recuperar el virus del medio de cultivo y/o de las células 
2. Mezclar alícuotas del virus con anticuerpo específicos antivirus: polio (1, 2 y 3), antivirus ECHO y antivirus Coxsackie; e incubar1 hora a 37°C
3. Inocular en nuevos cultivos celulares. 
4. Si el virus aislado es polio, será neutralizado por el suero antipolio polivalente y los cultivos infectados con esa mezcla no desarrollarán ACP. Por el contrario, los cultivos inoculados con las mezclas: Virus + suero anti ECHO, y con virus + suero anti-Coxsackie desarrollarán ACP. 
5. Inocular alícuotas del virus con sueros de los antivirus específicos e incubar 1h a 37c 
6. Inocular nuevos cultivos con cada una de las 3 mezclas 
7. Observar la aparición de APC 
 
VENTAJAS 
· De gran valor en estudios epidemiológicos 
· Determinar la presencia de anticuerpos protectores inducidos mediante vacunas 
DESVENTAJAS 
· Proceso complejo 
· Suele abarcar hasta 4 semanas 
· Costoso 
Realizado por:
 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
 
ESTUDIANTE: DOMÉNICA YULISSA MOLINA GARCES
OBJETIVO Buscar la presencia de un determinado antígeno (antígeno problema). 
DETECTA Permite la detección de anticuerpos específicos virales en el suero del paciente por medio un fluorocromo (isotiocianato de fluoresceína). 
PRINCIPIO
El principio está basado en una lámina portaobjeto con pocillos circunscritos en el cual se pone la muestra del paciente (ac no conjugado), se lava, se lo deja media hora, se coloca el conjugado (fluoresceína), se lava cuatro veces, y se lee los resultados. 
PROCEDIMIENTO
1. Preparación: Muestra cortada por criostato en portaobjetos, fijada con acetona fría. 10min. 
2. Incubación con antisueros específicos (37 °c a 30min) 
3. Lavado: Elimina anticuerpos no fijados. Lavar 
4. Agregado: Anticuerpo conjugado con fluoresceína (Igs) 
5. Incubación por media hora más. Lavar. 
INTERPRETACIÓN
· Positivo a HTLV-1: Pocillo superior (muestra): Verde manzana, la célula en forma tubular como sellos de anillo. Pocillo inferior (célula sin virus): No hay reacción. 
· Negativo a HTLV-1: No hay reacción entre el anticuerpo y el antígeno viral. 
VENTAJAS
· Permite diagnosticas en pocas horas. 
· Elevada sensibilidad 70%. 
· Con 2-3 células se puede realizar el diagnóstico. 
DESVENTAJAS: 
· Alto costo de microscopio de IF. 
· Dificultad para interpretar si no hay una persona entrenada. 
 Realizado por: 
 
 PCR (REACCIÓN EN CADENA POLIMERASA)
 
ESTUDIANTE: DOMÉNICA YULISSA MOLINA GARCES 
OBJETIVO Conseguir una enorme amplificación del número de moléculas que contienen la secuencia diana o de interés. 
DETECTA Se utiliza para detectar RNA. 
PRINCIPIO
· Desnaturalización. 
· Templado (hibridación). 
· Elongación (replicación).
PROCEDIMIENTO
1. Desnaturalización a 94-96°C 
2. Alineamiento a 68 °C 
3. Extensión a 72°C 
INTERPRETACIÓN
	PCR
	IgM
	IgG
	Interpretación
	-
	-
	-
	Negativo
	+
	-
	-
	Fase inicial de la infección
	+
	+
	-
	Infección confirmada
	+
	+
	+
	Fase activa de infección
	+
	-
	+
	Fase final de la infección
	-
	+
	-
	Estudio temprano con falso negativo.
	-
	-
	+
	Infección pasada. Fase de recuperación
	-
	+
	+
	Fase final de la infección
DETECCIÓN Y AMPLIFICACIÓN
PCR se utiliza para la detección y amplificación de ARN. Permite estudiar la expresión de determinados genes (su traducción a proteínas). 
1. Se extrae el ARNtotal de las células en estudio y se separa la fracción correspondiente al mensajero (ARNm). 
2. Tras purificarlo el ARN se transcribe a ADN mediante una transcriptasa inversa, por cada molécula de ARNm se sintetiza una molécula de cADN monocatenaria que posteriormente se ha de convertir en bicatenaria utilizando una ADN polimerasa. 
3. Se aplica la técnica de PCR lo que permite una detección de la expresión de ARNm mucho más sensible que con Northern blot o con hibridación in situl76. La,80. secuencia del fragmento amplificado se determina mediante secuenciación automática de ADN.
VENTAJAS: 
· Alta sensibilidad 
· Alta especificidad 
· Rapidez 
DESVENTAJAS: 
· Contaminación. 
· La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN. 
Realizado por: 
 
 PCR ANIDADA O NESTED PCR
ESTUDIANTE: CELIA THAIS MOREIRA GARCÍA
QUE ME DETECTA 
· Utilizando PCR hibridación in situ podemos detectar una única copia de genoma del virus del papiloma humano (HPV) en una célula determinada. Esto permite localizar células que contienen el virus en infecciones ocultas 94. 
· Mutación puntual de un gen: RED, SB, PCR, AS... 
· Creación de un nuevo gen: NB, PCR; leucemia ... 
· Reordenamiento de un gen: SB, PCR 
· Traslocación de un gen: SB, PCR, FISH 
PRINCIPIO 
Diseñada para aumentar la especificidad. Esta modificación consta de dos grupos de cebadores dirigidos contra la misma diana. El primer grupo de cebadores se desarrolla de la manera usual, mientras que el segundo grupo son cebadores situados internamente o anidados con respecto al primer grupo.
PROCEDIMIENTO 
Seguidamente, el producto de este primera PCR se utiliza como molde para una segunda ronda, la cual utiliza cebadores internos a la región previamente amplificada. La sensibilidad de la PCR anidada es extremadamente alta debido al proceso de amplificación dual. 
 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 
Dada su enorme sensibilidad, uno de los peligros de esta técnica es la contaminación, por lo que su utilización es difícil en laboratorios de rutina. En el estudio de los genes IgH, el ADN genómico puede ser amplificado utilizando oligonucleótidos específicos para la región variable (FR2A) y de unión (LJH). La secuencia obtenida es comparada con la secuencia VH de línea germinal utilizando programas informáticos como HUSAR84. 
VENTAJAS 
· Mejor sensibilidad y especificidad 
DESVENTAJA 
· Mayor contaminación y tiempo prolongado 
 Realizado por:
 RT PCR
ESTUDIANTE: SCARLET VIVIANA LAVID SANDOVAL 
QUE ME DETECTA 
La RT-PCR es un método de base nuclear que detecta la presencia de material genético específico de los patógenos, como los virus. 
Los ensayos moleculares, como la técnica RT-PCR, están diseñados para identificar con precisión el ARN viral de la influenza A y B o los ácidos nucleicos utilizando genes conservados. 
PRINCIPIO 
La PCR con transcripción inversa (RT-PCR) es una variante de la PCR convencional donde se utiliza ácido ribonucleico (ARN) como molde para sintetizar ADN complementario (ADNc), con el que posteriormente se realiza la PCR correspondiente. 
PROCEDIMIENTO 
La reacción se lleva a cabo mediante la repetición sucesiva de un ciclo de tres pasos, cada uno a temperatura diferente. En cada paso o cambio de temperatura ocurre un proceso que en su conjunto complementan la PCR. Primeramente, la desnaturalización del ADN o separación de la doble cadena, luego la unión de los oligonucleótidos o cebadores a las cadenas simples de ADN y, por último, la extensión o polimerización donde la ADN polimerasa cataliza la formación de doble cadena de ADN. 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 
A partir de los productos de ADNc, podemos examinar la composición genética de diferentes tumores, realizar la PCR de manera tradicional y cuantitativa, expresar proteínas únicas, generar bibliotecas de secuencias de ADN que codifican proteínas importantes y mucho más. 
VENTAJAS 
· Dan resultados consistentes, el protocolo es simple y rápido y hay menos pipeteo. 
DESVENTAJA 
· Esta técnica es menos sensible y no es posible optimizar las reacciones individualmente. 
· El proceso tampoco proporciona un stock para ADNc. 
Realizado por:
 REAL TIME PCR
ESTUDIANTE: ZINNA NAYELHI LINO ALVAREZ
QUE ME DETECTA 
La RT-PCR en tiempo real es un método de base nuclear que detecta la presencia de material genético específico de los patógenos, como los virus. 
PRINCIPIO 
Puedo utilizarte tanto en forma cualitativa como cuantitativa. la PCR en tiempo real genéticas, por lo general, utilizan más de un par de primers y varias sondas marcadas a fin de detectar todos los serotipos de adenovirus. 
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 
Resultado negativo 
· Un resultado negativo significa que no hay evidencia de ARN viral de la influenza o ácidos nucleicos en el espécimen respiratorio sometido a prueba. Para los pacientes hospitalizados,en especial para los pacientes con enfermedad en las vías respiratorias inferiores, si no se identifica ninguna otra etiología y todavía se sospecha clínicamente la presencia de influenza, se deben recolectar y examinar más muestras y se debe iniciar o continuar el tratamiento antiviral. 
Resultado positivo 
· Un resultado positivo indica la detección de ARN viral de influenza o ácidos nucleicos en el espécimen respiratorio sometido a prueba, que confirma la infección por el virus de la influenza, pero no necesariamente significa que el virus infeccioso está presente o que el paciente puede contagiar. 
· Un resultado positivo en las pruebas de detección en especímenes de las vías respiratorias superiores en una persona que recibió por vía intranasal la vacuna atenuada en virus vivos (LAIV) contra el virus de la influenza puede indicar la detección de los virus contenidos en la vacuna. La LAIV contiene cepas del virus de la influenza que replican el virus en tejidos respiratorios de menor temperatura (por ejemplo, fosas nasales) que la temperatura corporal interna. Debido a que las fosas nasales se infectan con las cepas vivas del virus de la influenza de la vacuna durante la administración de LAIV, las muestras de las fosas nasales extraídas unos días después de la vacunación con LAIV pueden causar resultados positivos de influenza. Puede ser posible detectar cepas de la vacuna LAIV hasta 7 días después de la vacunación y, en casos menos frecuentes, por periodos mayores. 
· La interpretación de los ensayos moleculares de influenza dependerá de la prueba individual que se realice. Por ejemplo, un resultado negativo de un ensayo molecular de influenza que solo detecta el virus de la influenza A y el subtipo A(H1N1) pdm09 no descarta infección por el virus de la influenza B. Los médicos pueden consultar el prospecto del producto para conocer las descripciones detalladas de cada prueba autorizada por la FDA y qué puede o no puede significar el resultado. 
VENTAJAS 
· Los ensayos moleculares de detección rápida y algunas pruebas moleculares disponibles comercialmente permiten obtener resultados en un periodo razonable como para emplearlos en las decisiones de manejo clínico (aproximadamente de 15-30 minutos a menos de 1.5 horas). 
· Los ensayos moleculares son más sensibles y específicos para detectar los virus de la influenza que otras pruebas de influenza (p. ej., pruebas de diagnóstico rápido de la influenza, inmunofluorescencia y cultivo viral). 
· Las probabilidades de un resultado falso positivo o falso negativo son bajas y, por consiguiente, la interpretación del resultado se ve menos afectada por el nivel de actividad de la influenza en la comunidad 
· Algunos ensayos moleculares, pero no todos, pueden distinguir entre subtipos específicos del virus de la influenza A. 
DESVENTAJAS
· Los resultados de algunas pruebas RT-PCR y otras pruebas moleculares pueden no estar disponibles dentro de un periodo clínicamente relevante como para informar las decisiones de gestión clínica. 
· La RT-PCR y otras pruebas moleculares pueden no estar disponibles en todas las salas de emergencia o entornos ambulatorios. Para los pacientes hospitalizados, estos ensayos no siempre están disponibles en el lugar. o Es posible que las muestras respiratorias tengan que enviarse a un laboratorio estatal de salud pública o laboratorio comercial para RT-PCR. Por consiguiente, aunque la prueba puede arrojar resultados en 4-8 horas, el tiempo real para recibir los resultados puede ser mucho mayor. 
· La mayoría de los ensayos moleculares autorizados por la FDA no están aprobados para las muestras de las vías respiratorias inferiores 
· Por lo general, RT-PCR y otros ensayos moleculares son más costosos que otras pruebas de influenza 
· Algunos ensayos moleculares pueden no identificar de manera específica todos los subtipos de virus de influenza A que circulan actualmente. Según la prueba, un resultado negativo de un subtipo de virus de influenza A no descarta la infección con otro subtipo de virus de influenza A. 
· Algunos ensayos moleculares de influenza que se utilizan no están autorizados por la FDA y no se ha realizado una evaluación para conocer la precisión de todos los RT-PCR y ensayos moleculares disponibles
· Los ensayos moleculares de detección rápida pueden tener una sensibilidad levemente menor para detectar los virus de la influenza, en relación con RT-
PCR y otras pruebas moleculares. 
Realizado por:
 
 NOUTHERN BLOT
ESTUDIANTE: DIEGO ANDRES PAREDES JIMENEZ 
QUE DETECTA
Northern blot es una técnica de laboratorio que se utiliza para detectar una secuencia de ARN específica en una muestra, secuencia de ARN específica en una muestra, permite también determinar el tamaño de la transcripción de ARN mensajero. 
 
PRINCIPIO
Permite también determinar el tamaño de la transcripción de ARN mensajero. 
PROCEDIMENTO
El procedimiento involucra electroforesis del ARN total o ARN poli-A junto con marcadores de pesos moleculares, para separar moléculas por tamaño. Las muestras de ARN son disueltas en buffers que contienen formamida y la electroforesis es llevada a cabo en un gel que contiene formaldehido. El formaldehído y la formamida son fuertes agentes desnaturalizantes que rompen la estructura secundaria del ARN, las cuales pueden dificultar la migración (Pedro L. Fernández Ruiz., 2010). Por lo tanto, moléculas de ARN linealizadas pueden ser separadas y visualizadas por tinción con colorantes fluorescentes como colorantes de bromuro de etidio y cianina SYBR verde. Al igual que en el Southern el Southern blot, el blot, el ARN se transfiere a transfiere a la membrana la membrana de filtro de filtro y se hibridan con sondas de ADN marcada. Durante la electroforesis se pueden observan grandes cantidades de ARNm correspondiente a ribosomal (unidades 28S y 18S) Electroforesis de ARN donde destaca gran cantidad de ARN correspondiente a las unidades 28S y 18S ribosomales. Tanto la técnica de Southern como de Northern blot se usan poco hoy en día al haber sido sustituidas por técnicas derivadas de la PCR. 
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
 Este procedimiento provee información visual sobre la longitud de migración de las dos bandas de rARN distintas, de 28S y 18S; de aproximadamente 5 y 2Kb respectivamente. También provee información de la cantidad de ARN en el gel. A partir del gel, el ARN se transfiere a una matriz sólida (generalmente (generalmente hecha de membrana de nitrocelulosa o de nylon) por difusión capilar o electro transferencia, e inmovilizada por cross-linking bajo la radiación de luz ultravioleta. Las membranas son hibridizadas con sondas de ácidos nucleicos marcados específicamente. Después de la hibridación, la membrana se lava y las bandas hibridizadas pueden ser visualizadas por una auto radiografía. 
 VENTAJAS
· La muestra de ARN requiere de un mínimo procesamiento 
· La técnica puede ser fácilmente evaluada (degradación, límite de detección) 
· Nos permite reconocer el análisis de mutaciones y alteraciones del RNAm de enzimas y en la regulación de la expresión génica de marcadores moleculares de células leucémicas humanas y moléculas del reconocimiento inmunológico. 
DESVENTAJAS
· Es menos precisa que la RT-PCR (Retro PCR). 
· Es una técnica que consume mucho tiempo montarla y necesita de mucho cuidado cuando se usan sondas radioactivas. 
· Es una técnica que consume mucho tiempo montarla y necesita de mucho cuidado cuando se usan sondas radioactivas.
Realizado por:
 SOUTHERN BLOT 
ESTUDIANTE: DOMÉNICA YULISSA MOLINA GARCES
OBJETIVO Se utiliza para determinar la presencia de un gen o fragmentos del ADN específicos en una mezcla de ácidos nucleicos previamente extraídos. 
DETECTA Se utiliza para detectar una secuencia específica de ADN en una muestra de sangre, esputos, tejido y células. 
PRINCIPIO
El proceso implica la transferencia de fragmentos de ADN separados por electroforesis a una membrana portadora que normalmente es nitrocelulosa y la posterior detección del fragmentode ADN diana mediante la hibridación de la sonda. La hibridación se refiere al proceso de formación de una molécula de ADN bicatenario entre una sonda de ADN monocatenario y un ADN diana monocatenario. Dado que la sonda y el ADN diana son complementarios entre sí, la reacción es específica, lo que ayuda a detectar el fragmento de ADN específico. 
PROCEDIMIENTO
Es una técnica simple y fácil de realizar que detecta fragmentos de DNA, separados por tamaño mediante electroforesis en gel. Combina la separación electroforética del DNA con su transferencia a un soporte solido o “filtro” (nylon o nitrocelulosa) para su hibridación. Tanto esta como la posterior detección se realizan de forma más eficaz en el filtro de lo que se haría en el gel. Esta técnica ha contribuido de forma notable a aumentar la potencialidad de la hibridación como herramienta analítica, constituyendo el método habitual de análisis del DNA extraído de muestras de sangre. Esputo, tejido y células (linfocitos, amniocitos). 
1. Separación electroforética 
2. Desnaturalización 
3. Transferencia 
4. Hibridación 
5. Detección 
INTERPRETACIÓN: 
Una enzima de restricción se utiliza para cortar una muestra de ADN en fragmentos que se separan mediante electroforesis en gel. Los fragmentos de ADN son transferidos del gel a la superficie de una membrana. La membrana se expone a una sonda de ADN marcada con un marcador radiactivo o químico. Si la sonda se une a la membrana, entonces la secuencia de la sonda está presente en la muestra. 
VENTAJAS: 
· Altas especificidad y reproducibilidad. 
· Permitir la valoración del estado físico del ADN. 
DESVENTAJAS: 
· Cantidad relativamente alta de ADN. 
· Permite estudiar una pequeña región del genoma con cada sonda. 
· La mayoría de las sondas son poco informativas (heterocigosidad baja). 
Realizado por: